一种评估肉类产品中是否含有抗生素的方法与流程

本发明涉及农产品检测领域，具体涉及一种评估肉类产品中是否含有抗生素的方法。

背景技术：

抗生素在现代养殖业发展中发挥了无可替代的作用，但同时也给动物性食品带来了药物残留，给食品安全和人类健康带来了严重威胁，引起了国际关注和重视。目前研究发现人体长期摄入残留剂量抗菌药物会对肠道菌群产生不利影响，如破坏肠道菌群定植抗力，诱导及促进耐药菌的增长；破坏肠道菌群的屏障作用，导致潜在病原菌过度生长；肠道菌群代谢活性改变；肠道细菌数目和相对比例改变。

我国是猪肉消费大国，年消费量占到肉食消费量的50％左右。无抗猪肉成为市场新宠和养猪业的热点，源于消费者对食品安全的追求。无抗猪肉和普通猪肉相比，在烹制过程肉质更有嚼头，肉香浓郁，随着生活水平的提高，更符合人们对健康的追求，能够满足人们对高品质安全食品的需求。无抗养殖不仅能提高肉的安全性和品质，而且可改善人类健康。从国际大环境来看，目前在生猪饲养过程中不使用抗生素是国际公认的猪肉安全标准，无抗养殖已成为世界养殖业的必然趋势。

目前关于无抗猪肉的定义有很多争议，从字面上看，无抗猪肉即猪肉中不含有抗生素，但由于环境、饮水等有微量的存在，即使养殖过程不使用抗生素，猪肉中仍会有极微量的抗生素检出。

现有的抗生素检测多是针对特定种类的检测，而抗生素本身种类繁多，同时检测费时费力，因此现有的检测方法很容易存在被忽视的种类而无法避免抗生素的残留。为确保无抗肉类产品的安全评估工作顺利开展，有必要建立抗生素残留微生物学安全评估体系，包括评价模型和技术、评估程序等。

技术实现要素：

为克服现有肉类产品在抗生素检测中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种评估肉类产品中是否含有抗生素的方法。

本发明的评估方法包括以下步骤：

S1：构建人体肠道菌群的离体恒化器模型，并向其中添加待评估的肉类产品；

S2：通过16S rDNA测序方法得出所述离体恒化器模型在添加所述待评估的肉类产品时与未添加时的肠道菌群情况，当肠道菌群无波动变化时表明所述肉类产品中不含有抗生素，否则表明所述肉类产品中含有抗生素。

人肠道菌群的稳定性对抗生素非常敏感，抗生素会干扰肠道菌群的生态平衡，从而引起菌群的波动变化，即使微量存在也会引起波动，具体表现在：对肠道菌群多样性指数有一定影响；对肠道中总需氧菌、肠杆菌、肠球菌、拟杆菌、总厌氧菌等菌群数量有一定影响；对人体肠道总需氧和兼性厌氧菌、大肠杆菌等耐药性有一定影响(如氨苄青霉素、金霉素、链霉素会使耐药大肠杆菌数增加；螺旋霉素会使耐药肠杆菌数明显增加；四环素会使耐药肠球菌和脆弱拟杆菌明显增加，耐药肠杆菌数明显增加，停药后作用消失；环丙沙星会使需氧菌总数和肠球菌数明显下降，耐药肠球菌和梭菌百分数增加，耐药脆弱拟杆菌增加)。基于此，可通过构建体外人肠道菌群的离体恒化器模型来模拟人体肠道，抗生素会对其中的菌群多样性参数产生非常明显的影响，肠道菌群结构和组成会发生紊乱，由此可作为肉类产品中是否含有抗生素的评估指标，从而建立起一种准确的、方便的肉类产品是否含有抗生素的评估方法。

本发明的方法中，所述的肠道菌群的波动变化可表示为肠道菌群丰度的波动变化，不同种类的抗生素会对不同菌种产生影响，无论增加或减少，都会引起其丰度的明显改变，表现出肠道菌群结构的波动，从而反映出是否受到抗生素残留的影响。

本发明的方法中，所述的肠道菌群的波动变化还可表示为肠道菌群多样性的波动变化，一般来说，抗生素会导致肠道菌群多样性明显降低，表现出肠道菌群结构的波动，从而反映出是否受到抗生素残留的影响。

本发明的方法中，所述肠道菌群的波动是指统计学上的差异性，当两组细菌数据比对时，如具备显著差异(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)，则被视为具有波动。

本发明的方法中，人体肠道菌群离体恒化器模型采用的装置、培养基、构建方法等都可采用现有技术，例如中国专利ZL 200710028346.2记载的装置及使用方法。

本发明的方法中，所述步骤S2进一步为：通过16S rDNA测序方法得出所述离体恒化器模型在添加所述待评估的肉类产品之前、添加时以及停止添加之后的肠道菌群情况，当肠道菌群无波动变化时表明所述肉类产品中不含有抗生素，否则表明所述肉类产品中含有抗生素。停止添加含抗生素肉类产品之后，肠道菌群尽管有所恢复，但相对于添加之前，还是存在明显波动，因此，作为优选的技术方案，通过测序方法检测离体恒化器模型在添加待评估的肉类产品之前、添加时以及停止添加之后的肠道菌群情况，均无波动则更好地说明待测产品中不含有抗生素。

本发明的方法可适用的肉类产品包括常见的家畜、家禽、水产等肉产品；优选适用于猪肉、牛肉、羊肉等常见肉类产品；最优选适用于无抗猪肉的评估。

本发明的评估方法结合了离体恒化器模型与宏基因组技术，首先构建离体恒化器模型在体外模拟人肠道菌群生态系统，再利用宏基因组技术考察添加待检测样品前后的菌群情况，通过肠道菌群的波动评估是否残留有抗生素。该评估方法可不受抗生素种类限制，只要有抗生素残留，都可在肠道菌群上表现出波动，而且，由于宏基因组技术的准确性和灵敏性，即使微量残留也可被检测出，因此，本发明的评估方法提高了抗生素残留检测的可靠性、准确性及灵敏性，为建立更为科学、全面的无抗产品抗生素残留安全性评估体系提供了良好的模型和先进的检测技术。

附图说明

图1为本发明所述评估肉类产品中是否含有抗生素的方法流程图。

具体实施方式

以下通过具体实施例说明本发明，但实施例仅用于说明，并不限制本发明的范围。

定义

1.宏基因组学从技术上看包括16S rDNA高变区测序和全基因组的宏基因组测序两个层次。16S rDNA高变区测序可获得微生物多样性与丰度、种群结构、进化关系等相关信息；而对微生物菌群全基因组进行测序，可进一步对微生物基因功能、各微生物菌群相互协作关系、菌群与环境之间的关系等方面进行深入研究。

2.16S rDNA是指：即16S ribosomal DNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分，相对分子质量约为0.6Mda，长度约为1540nt。

3.无抗猪肉是指：不含抗生素的猪肉。生猪养殖过程中以不含抗生素的饲料为原料，生猪屠宰时也检测不到抗生素，加工后的猪肉和肉制品也不含抗生素，这样的生猪即为“无抗猪”。“无抗猪”屠宰加工后的肉类即为“无抗猪肉”。

4.人源菌群是指：来自健康人粪便的微生物。

5.本发明所利用的动物肠道菌群的表型和/或症状包括：菌群的多样性差异；物种的丰度及均匀度变化。

6.操作分类单位是指：运算分类单元(OTU)，用于物种分类及物种相对丰度分析的基本单元。一般情况下，若序列之间，比如不同的16Sr DNA序列的相似性低于98％就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16S rDNA序列，即每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种。

7.离体恒化器模型是指：一种通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续流动培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。

实施例

1、粪便来源及离体恒化器模型构建

选取6个月以上未使用抗菌药、无胃肠疾病及饮食规律无异常的健康志愿者4名(男、女各2名，22～28周岁)，采集健康志愿者的清晨第1次的新鲜粪便于无菌厌氧袋(氮气85％、氢气5％、二氧化碳10％)，加入10％甘油作为抗冻保护剂，旋涡振荡混匀，-80℃保存。

参照中国专利ZL 200710028346.2组装离体恒化器，向离体恒化器模型的发酵罐中注入灭菌的肠道菌群培养基500ml，蜡封，使整个系统处于无菌、密闭环境。开启连接新鲜培养基的蠕动泵以35ml.h^-1流速运行，输送新鲜培养基不断补充营养物质，废液以同等流速移出，保证培养液恒定。准确称取粪便样品10g，灭菌0.85％生理盐水5倍稀释，充分匀浆后过滤，取等量3份样品混匀，接种于已平衡了24h的发酵罐中。

培养基配方为(g/L)：蛋白胨3.0g、牛奶乳酪蛋白3.0g、脂蛋白0.6g、果胶0.6g、木聚糖0.6g、淀粉5.0g、L-半胱氨酸0.4g、胆固醇0.25g、鹅脱氧胆酸0.25g、胆酸0.25g、阿拉伯半乳糖0.6g、KH₂PO₄2.0g、N aHCO₃0.1g、CaCl₂·2H₂O0.45g、MgSO₄·7H₂O0.5g、氯化高铁血红素0.01g；121℃高压蒸汽灭菌15min。

2、样品采集与处理

离体恒化器模型接种人肠道菌群后采集未添加待测肉产品时的培养液。

离体恒化器模型运行14天后，向培养基中添加待测猪肉或猪肉产品粉末2.5g，连续作用8天，并采集培养液样品(第4天、第8天)。

停止添加后继续运行7天，并采集培养液样品(停止后第7天)。

上述采集的培养液装于2ml无菌EP管中，冻藏于-80℃，参照DNA提取试剂盒(厂家：Qiagen，货号：51504))的说明提取DNA。

3、16S rDNA测序

提取样品总DNA，参照文献(Sun,W.et al.Mechanism and Effect of Temperature on Variations in Antibiotic Resistance Genes during Anaerobic Digestion of Dairy Manure.Sci.Rep.6,30237；doi:10.1038/srep30237(2016).)进行扩增，扩增完成的PCR产物纯化之后进行上机测序。整个测序流程由上海锐翌生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq PE250进行上机测序。通过对测序结果进行OUT(操作分类单位)聚类分析，反映出肠道菌群群落的物种组成、物种间进化关系及群落多样性。

4、统计学分析

实验数据用平均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，不同实验组之间的差异分析采用Student-t检验，P<0.05为统计学上有显著差异，P<0.01为统计学上极显著差异。

5、菌群波动评估

(1)猪肉中如没有抗生素残留，加肉粉前后及停肉粉后，模型的肠道菌群均无波动变化，即统计学上无显著差异。

(2)猪肉中如有抗生素残留，则对模型的肠道菌群丰度、多样性都有影响，具有明显的波动变化。

以上流程可参照图1。

6、对比实验

以含抗生素的猪肉重复前述实验过程(作为实验组)，并设置未添加猪肉粉末的相同离体恒化器模型作为对照组，菌群波动变化结果如表2所示：

表2离体恒化器培养液中细菌数量的变化[log(CFU/g)]

*表示与对照组相比，差异显著(P＜0.05)，**表示与对照组相比，差异极显著(P＜0.01)

由表2结果可以看出，实验组总需氧和兼性厌氧菌数、大肠杆菌、肠球菌和总厌氧菌数明显低于对照组(P＜0.01)。停止添加7天后，实验组总需氧和兼性厌氧菌以及大肠杆菌细菌数量仍低于对照组，且差异极显著(P＜0.01)。说明添加了含抗生素猪肉后的模型内肠道菌群丰度发生了明显波动。由此说明肠道菌群波动可以反映出抗生素的残留情况，本发明的评估方法可准确评估出肉类产品中的抗生素残留。

虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。