专利名称：：畜水产品中残留动物用药物的提取液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及残留动物用药物的提取液。更详细地说，涉及测定畜水产品中残留的动物用药物时所使用的提取液。
背景技术：
：10近年来，为了预防/治疗畜水产动物的疾病或促进生长，人们使用了许多种动物用药物。测定畜水产品中动物用药物的残留量(定量)对确保食品安全至关重要。基于此种状况，日本及国外各国导入了与畜水产品中残留的动物用药物相关的肯定列表制度，同时规定了200多种动物用药物残留量的暂定基准值，但实际上用公定方法对每15种动物用药物的残留进行分析，时间与劳动力均难以应付。因此希望开发出一种能同时对多成分且简便、迅速分析的残留物质的分析方法。在动物用药物中，特别是抗菌物质(例如抗生素、合成抗菌药等)在目前集约化祠养方式下使用的种类和用量均有增加的趋势，其在20畜水产品中残留的可能性倍受关注。但现在的问题是，即使对在食品卫生法中规定的动物用药物中，诸如螺旋霉素、替米考星、庆大霉素、大观霉素、新霉素等抗生素类或喹喔啉曱酸、环丙马秦等高极性化合物也未能开发出多成分同步分析的方法。进行所迷多成分同步分析，需要从被检物畜水产品25中一次性提取出多种残留动物用药物。对可溶于有机溶剂的动物用药物来讲，通过使用有机溶剂作为提取液，上述问题已得到解决(例如，参考Howells,L.,Sauer,M.J.,Analyst,126,155~160,2001)。但是，对难溶于有机溶剂的药物来讲，因不能使用有机溶剂，提取工序存在问题。如上所述，对可溶于有机溶剂的动物用药物来讲，使用有机溶剂作为提取液，问题已得到解决，也期望对水溶性的动物用药物能同时提取的一次性提取液。但问题是在动物用药物中，如抗菌物质5等各种药物可稳定存在的条件各异，要在多种残留的动物用药物不变性的条件下高效一次性提取是困难的。为解决上述问题，本发明人等进行了各种研究，结果发现通过使用具有特定性质的提取液，可以在多种残留动物用药物不变性的条件下，高效一次性提取。本发明根据这一发现而设，提供对畜水10产品中残留的动物用药物、特别是抗菌物质一次性提取有用的提取液。
发明内容为解决上述问题所做的本发明是一种畜水产品中残留动物用药15物的提取液，其包括含0.05~1%(W/V,以下同样)的偏磷酸、pH为5.5~7.5的緩冲液。该提取液特别适合用于残留动物用药物为抗菌物质时的提取，緩冲液优选使用Mcllvaine緩冲液。实施发明的最佳方式20如上所述，动物用药物中特别是抗菌物质，各种物质稳定存在的条件不同，导致难以一次性提取。基于上述观点，本申请发明人等为消除这一障碍，进行了如下试验。首先，根据提取液的极性，将目标物质分成了两类。目标物质之一选择的是可溶于有机溶剂的四环素等21种化合物；目标物质之25二选择的是高极性且难溶于有机溶剂的氨基糖苷类抗生素的4种化合物(链霉素、双氢链霉素、大观霉素和庆大霉素)。首先，进行的是添加回收试验，即在牛肉中加入规定量的目标物质，以此作为被检物，对其利用pH7.0的Mcllvaine緩冲液/EDTA/曱醇混合溶剂进行提取，再使用(:18固相提取柱进行纯化。对目标物质之一的21种化合物进行了20ppb浓度的添加回收试验，结果回收率以及变动系数基本达到了法定药典的基准。与此不同，对目标物质之二的氨基糖苦类抗生素，为使这些化5合物能吸附于C,8固相提取柱，提取液中添加了离子对试剂七氟丁酸，然后通过c18固相提取柱进行了纯化。通过这样的操作预计回收链霉素、双氢链霉素、大观霉素和庆大霉素，可实际上未能回收到庆大霉素。为了查找到原因，在C18固相提取柱处理前，向提取液中添加标10准物质，结果论及的所有氨基糖苷类抗生素得到回收。因此判断问题出现在C,8固相提取柱纯化前的工序，即提取。在此试验庆大霉素提取法，用公定方法规定的提取条件即在提取液中使用1。/。的偏磷酸(pH2)，研究的结果确认可以回收庆大霉素。以往使用上述1。/。偏磷酸(pH2)目的在于除去蛋白质，提取溶剂因添15加偏磷酸呈现了酸性。但是，如果采用此类提取溶剂，则红霉素等酸性条件下不稳定的化合物就会被分解掉。因此，多种成分同步分析法不能使用低pH的提取液。此外，考虑有氯四环素等在碱性条件下不稳定的化合物存在，因此多种成分同步测定需要在中性条件下提取。为此，就接20近中性条件下的提取方法进行了研讨。首先，针对庆大霉素的提取，研究了是否需要在酸性条件下除去蛋白。上述公定方法中偏磷酸溶液pH为2，使用Mcllvaine緩冲液将pH由2调整到6，未能回收到庆大霉素。因此，偏磷酸本身的存在是良好回收庆大霉素所需要的。25基于上述结果，如后述实施例所示，本发明人等对提取液的液体性质和偏磷酸浓度进行了反复研究，结果表明使用尽管其液体性质在中性附近，但调整偏磷酸到特定浓度的提取液，更具体讲就是使用包括含0.05~1%的偏磷酸，pH为5.57.5的緩沖液的提取液，可以在不损害动物用药物、特别是抗菌物质稳定性的情况下一次性提取。需要说明的是，在上述浓度/pH条件下含有偏磷酸的緩冲液未确认具有公定方法所用目的，即除去蛋白质的效果，作为一种化合物，偏磷酸本身的存在对保证提取效果具有重要的意义。5对本发明中所用的緩沖剂来讲，只要对从畜水产品中提取动物用药物无阻碍作用，可以广泛选用緩沖液，例如Mcllvaine緩冲液、HEPES緩冲液、索伦森(Scrensen)緩冲液、克拉克-鲁布斯(Clark-Lubs)緩沖液和Kolthoffs緩沖液等，其中优选使用Mcllvaine緩冲液。本发明为防止作为提取对象的动物用药物变性，将提取液的pH10调整到5.5-7.5,优选调整到6.0-7.0。此外，偏磷酸浓度调整到0.05~1%,优选调整到0.1~0.5%。如果偏磷酸浓度不足0.05%,则可能难以提取到庆大霉素。本发明的提取液，可以通过在上述适当的pH緩冲液中添加偏磷酸使其达到上述的浓度来制备。在使用时为了提高提取效果，根据15需要可以添加EDTA等螯合物、曱醇等水性有机溶剂。优选使用将上述緩冲剂螯合物曱醇按15:1:4左右的比例混合而成的提取液。本发明提取液的使用方法可以采用与过去的残留动物用药物提取液相同方法。例如，向被检畜水产品中添加本发明的^是取液，均20质后，利用离心等常用方法进行分离即可得到提取液。相对上述祐_检物提取液的添加量可调整到被检物与提取液之比为1:110(W/V比，以下同样)，优选为1:2~8，更优选为1:2.55左右。如果相对1份被检物添加的提取液不足1，则可能使提取不充分；反之如果提取液超过10,提取方面没有问题，但由于提取液量25增加操作会麻烦。作为被检物的畜禽水产品包括畜肉(例如牛肉、猪肉、鸡肉、兔肉、羊肉、鸭肉等)和水产品(竹莢鱼(youngyellowtail)、鲷鱼、飩鱼、虾、鳗鱼、鲤鱼、鲑鱼、牡蛎等)。需要说明的是，在调查动物用药物？1起的环境污染时也会把从自然界采取的动物作为被检物。如此得到的提取液，经过柱纯化等常规方法纯化后，利用常规测定装置可测定残留动物用药物。作为纯化方法，例如可以使用C18固相提取柱等，此时，为使所5述柱吸附被检物，也可以在提取液中添加离子对试剂HFBA。另外，可以利用高效液相色i普仪/质量分析法等对残留动物用药物进行测定。产业实用性10本发明所提供的提取液，由于pH在中性范围，可在不损害多种动物用药物稳定性的情况下，将其有效地一次性提取。此外由于在提取液中含有偏磷酸，还可发挥能成功提取庆大霉素的效果。综上所述，通过使用本发明的提取液，可一次性提取畜水产品中残留动物用药物，有望使残留量的测定更加迅速、简捷。15实施例以下，基于实施例更详细地说明本发明，但本发明不仅限于所列举的例子。实施例120按以下方法进行了添加回收试验。需要说明的是，氨基糖苦类的添加回收试验参照了食品卫生法规定的残留基准值，按200ppb的添力口量进行。被检物(牛肉)中添加氨基糖苷类抗生素(链霉素、双氬链霉素、大观霉素、庆大霉素)的标准试样使其浓度分别达到200ppb,或者未25添力。的作为对照被检物(牛肉)，上述5g被检物在25ml含0.1%偏磷酸、pH为7的Mcllvaine溶液/EDTA/甲醇混合溶剂中，均质后提取。用25ml10mMHFBA对提取后的上清液进行稀释，添加到C18固相提取柱(12cc500mg)上，然后用5ml5mMHFBA清洗，用20mlHFBA/MeOH(l:l)洗脱。浓缩干燥洗脱液后，用DMSO/水混合溶剂(1.0ml)再溶解，提供给按以下条件进行的LC/MS/MS分析，求得回收率(％)。在高效液相色谱部分的移动床中使用梯度A液(0.3%乙酸、10mM乙酸铵)和B5液(含20%甲醇的乙腈)，通过亲水色i普柱，在流速220pl/min的条件下进行洗脱。质量分析装置采用AppliedBiosystems<^司生产的API2000仪器，离子化模式采用正负ESP,在电喷雾正电压为5000,负电压为-4200和涡轮增压器气体温度为55(TC的条件下实施。10实施例2作为提取液，除使用含0.3%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液替代含0.1%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液进行回收以外，按照与实施例1相同的方法进^f亍测定。15实施例3作为提取液，除使用含0.5%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液替代含0.1%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液进行回收以外，按照与实施例1相同的方法进行测定。20实施例4作为提取液，除使用含1.0%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液替代含0.1%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液进行回收以外，按照与实施例1相同的方法进行测定。.25比较例1作为提取液，除使用不含偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液替代含0.1%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液进行回收以外，按照与实施例1相同的方法进行测定。比專交例2作为提取液，除使用含0.01%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液替代含0.1%偏磷酸、pH为6的Mcllvaine溶液进行回收以外，按5照与实施例1相同的方法进行测定。以上的试验结果见表l。如表1所示，实施例l中，所有工序的回收率为双氢链霉素达到约60%,链霉素和大观霉素达到约50%，庆大霉素不到40%。此外，四个被检物的变动系数为10%左右，获得了良好的再现性。实施例2、实施例3、实施例4也获得了大致相10同的结果。另一方面，在比较例1和2中，庆大霉素的回收率过低，到了无法测出的程度。在上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中，观察用LC/MS/MS得到的色i普图发现，肉提取液基本检测不到峰值，很难出现易于定性的假阳性现象。另外由于基准线低，通过S/N求得的l5定量下限也可以达到几十ppb左右。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>综上所述，对氨基糖苷类抗生素来讲，通过向提取液中加入较20以往浓度低的偏磷酸，发现即4吏在中性pH范围也可以实现提取，而且可以得到具有再现性的结果。实施例5上述目标物质之一的可溶于有机溶剂的四环素等19种化合物，同实施例1一样，使用含0.1。/。偏石粦酸、pH为7的Mcllvaine溶液/EDTA/曱醇混合溶剂作为提取液进行了添力。回收试验，结果见表2。如表2所示，对所述目标物质之一的物质也得到了良好的提取结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1.畜水产品中残留动物用药物的提取液，其包括含0.05P/。W/V的偏磷酸、pH为5.5~7.5的緩冲液。2.权利要求1的畜水产品中残留动物用药物的提取液，其中动物用药物为抗菌物质。3.权利要求2的畜水产品中残留动物用药物的提取液，其中抗菌物质为氨基糖苷类抗生素。4.权利要求1~3中任一项的畜水产品中残留动物用药物的提取10液，其中緩冲液为McIlvaine緩冲液。全文摘要本发明公开了一种可以用于提取畜水产品中残留动物用药物的提取液。所述提取液包括含0.05～1％W/V的偏磷酸、pH为5.5～7.5的缓冲液，为可以一次性提取多种动物用药物的提取液。特别适合用于残留动物用药物为抗菌物质时的提取。本发明所提供的提取液，由于pH在中性范围，可在不损害多种动物用药物稳定性的情况下，将其有效地一次性提取，有望使畜水产品中残留动物用药物的测定更加迅速、简捷。文档编号G01N1/36GK101124479SQ20058004836公开日2008年2月13日申请日期2005年12月16日优先权日2004年12月16日发明者北山雅彦,大森丘,小园正树,山田良司,森松文毅申请人:日本肉类批发商株式会社