专利名称：作为胰岛素耐受性的靶标/标记的cd99的制作方法
作为胰岛素耐受性的把标/标记的CD99
2型糖尿病是在世界范围内重要性快速增长的疾病，可以描述为胰脏/3 细胞不能以|8细胞胰岛素分泌的增强4M尝外周胰岛素耐受性^细胞衰竭)。
可以认为胰岛素耐受性是2型糖尿病i^艮的第一步，并J^诊断出糖 尿病之前数年就已经发生。在这第一个阶段中，患者保持血糖正常，通过 增强胰岛素分泌来4M尝肌肉和肝对胰岛素应答性的降低。在2型糖尿病发 展的4^阶段，^细胞功能降低，引起葡萄糖耐量降低并最终导致糖尿病。 已经显示通过减轻体重、锻炼或药物治疗进行早期干预可以延緩或甚至防 止在葡萄糖耐量降低的患者中糖尿病的iLjl(Diabetes Prevention Program Research Group, N. Engl. J. Med. 346 (2002) 393-403)。因此，胰烏素耐受 性的早期诊断将允许通过M尿病治疗或防止该疾病^L艮的其他手段进行
早期干预。目前，检测胰島素耐受性的惟一可靠的可能性是通过正常jMt-
高胰岛素钳夹(EHC). HOMA模型常用于评估胰岛素耐受性，但不是公认 的诊断方法(Wallace等，Diabetes Care 27(2004)1487ff.)。由于它们费时费 力，因此，这些方法不能成为广泛的患者筛查程序。因此胰岛素耐受性的 分子标记将对于该疾病的检测非常有用。
目前最经常使用的2型糖尿病治疗不直接针对胰岛素耐受性。存在对 于主要在外周葡萄糖摄取水平下发挥作用的治疗方法(如胰岛素致敏物)的 安全性担忧。因此，鉴定其他更好的治疗靶标和比目前常用的标志物(如 EHC或HOMA法)更灵敏或更可靠的标志物也是有用的，所述标志物用于 检测胰岛素耐受性或功效。
此外，鉴定可以在血浆中检测的标志物也是有利的。 本发明的目的在于鉴定和提供新靶标，所述乾标用于筛选防止、减弱 或抑制胰岛素耐受性的化合物和筛选允许在II型糖尿病早期阶段监测和/
或诊断胰岛素耐受性并且比目前的更为可靠的标志物。
令人惊奇的是，我们发现使用蛋白质CD99能克服(至少部分克服)目 前该领域已知的问题。
CD99是32-kDa聘_膜蛋白，已经与单核细胞的迁移以及T细胞和胸腺 细胞的分化和凋亡相联系。CD99的生物功能还没有什么了解。
令人惊奇地，在胰乌素耐受性中发现了 CD99分泌水平的改变。因此， 本发明提供了用于治疗和/或预防胰乌素耐受性的靶标以及用于早期诊断 糖尿病中胰岛素耐受性的新标志物。优选地，所述改变为分泌CD99水平 的提高.
EndogHn是跨膜蛋白这一事实意味着为了在血浆中出现分泌形式，必 须产生SeqIDNo. 1的序列片段。因此，本发明方法中使用的把标或通过 本发明方法可检测的标志物还包括Seq ID No. 1的可溶性片段。这些可溶
质结构"(跨膜结构域后第二;M酸至序列C端)的部分或;任何片^:.
因此，本文使用的术语"CD99，，或"蛋白质CD99，，应理解为包括Seq ID No. 1 的可溶性片段以及Seq ID No. 1的蛋白质或其与Seq ID No. 1至少90 %同 源的突变体。为了测定两个^^^列之间的百分比同源性，以最优比较 目的将序列进行比对(例如为了与另一多肽或核酸分子进行最佳比对，可以 在序列中引入缺口)。接着比较相应的M酸位置上的氨基酸残基或核苷 酸。当一个序列上的位置被与另一序列中相应位置相同的氨基酸泉基占据 时，则分子在该位置上同源，本文使用的氨基酸"同源性"与氨基酸"同一性" 等价。两序列之间的百分比同源性是序列共享的相同位置数的函数(即百分 比同源性等于相同位置lfc/位置总数乘以100)。
在优选的实施方案中，标志物CD99由可通过实施例4中所述ELISA 检测的Seq ID No. 1的任何片段或突变的或天然形式组成。
在优选的实施方案中，新耙标和/或标志物CD99可用于诊断、监测以 及筛选目的。
用于患者监测时，本发明的诊断方法可帮助在患者随访中评估疗效和
胰岛素耐受性的复发。因此，本发明提供蛋白质CD99用于监测糖尿病疗 效的用途。
在优选的实施方案中，本发明的诊断方法用于患者筛选目的。即用于 通过测量CD99水平并将CD99水平与胰岛素耐受性存在与否进行联系来 在没有糖尿病先期诊断的情况下评估受试者。
本发明的方法可用于通过引起糖尿病的不同阶段(即胰岛素耐受性、葡 萄糖耐量降低和糖尿病)来监测疾病的H
因此本发明提供用于监测糖尿病iU艮的方法，其包括以下步骤(a)提 供得自个体的液体样品，(b)在将所述样品与CD99的特异性结合剂在适于 所述结合剂和CD99之间形成复合体的条件下接触和(c)将(b)中形成的复合 体的量与胰乌素耐受性中形成的复合体的量相关联.
本发明还提供用于监测糖尿病疗效的方法，其包括以下步骤(a)提供 得自进行M尿病治疗的患者的液M品，(b)将所述样品与CD99的特异 性结合剂在适于所述结合剂和CD99之间形成复合体的条件下接触和(c)将 (b)中形成的复合沐的量与未进行治疗时形成的复合体的量相关联。
本发明提供用于筛选与CD99相互作用的化合物的方法，其包括以下 步骤(a)在允许化合物或多种化合物与CD99相互作用的条件下使蛋白质 CD99与所述化合物或多种化合物接触；和(b)检测所述化合物或多种化合 物与所述多肽之间的相互作用。
本发明提供用于筛选防止和/或抑制和/或减弱胰岛素耐受性的化合物 的方法，其包括以下步骤a)使化合物与蛋白质CD99接触；和b)测量蛋 白质CD99的活性，其中抑制或刺激蛋白质CD99的活性的化合物为可以 防止和/或抑制和/或减弱胰岛素耐受性的化合物。优选地，所述方法还包括 在步骤a)之前或步骤a)和b)之间固定蛋白质CD99的步骤。
本文使用的术语"活性，，涉及例如CD99介导细胞迁移的能力、诱导凋 亡的能力或与亲环蛋白A结合的能力(参阅如Cerisano等，2004， Oncogene 23， 5664-5674; Kim等，2004， Immunol. Lett. 95， 155-159)。
本发明还包括无细胞测定。这些测定包括使CD99形式(如全长多肽、
所述多肽的生物活性片段或包含所述多肽全部或部分的融合蛋白)与测试 化合物接触并测定该测试化合物与所述多肽结合的能力。可以如上述直接 或间接测定该测试化合物与所述多肽的结合。在一个实施方案中，该测定 包括使所述多肽与已知结合所述多肽的化合物接触，以形成测定混合物，
的能力，其中测定所述测试化合物与所述多JiM目互作用的能力包括测定测 试化合物与已知化合物相比，与所述多肽优先结合的能力。
本发明的无细胞测定适于使用膜结合形式的多肽或其可溶性片段。对 于包括膜结合形式多肽的无细胞测定，可能需要使用增溶剂以将膜结合形 式的多肽维持在溶液中。这些增溶剂的实例包括非离子型去污剂如正辛基 葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛it^-N-甲基葡糖酰
胺、癸B!^-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-IOO、 Triton X-114、 Thesit、异十 三聚(乙二醇醚)n、 3-(3-胆酰胺丙基)二甲氨基H-丙磺酸内盐(CHAPS)、 3-(3-胆酰胺丙基)二甲氨基-2-羟基-l-丙磺酸内盐(CHAPSO)或N-十二烷 基-N， N-二甲基-3-HJ^l-丙磺酸内盐。
在本发明以上测定方法的多个实施方案中，可能需要固定多肽以便于 从多肽与结合分子的未复合形式中分离复合形式以及提供测定的自动化。
在存在和不存在候选化合物的情况下与结合分子的相互作用。这些容器的 实例包括微量滴定板、试管和微量离心管，在一个实施方案中，可以提供 融合蛋白，其加入了允许一种或两种蛋白质与基质结合的结构域。例如谷 胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical; St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定^LL，其接着再与测试化合物组 合，或者将测试化合物与非吸附的结合蛋白或多肽组合，接着在有助于形 成复合体的条件下(如生理条件下的盐和pH)温育混合物。温育后，洗涤珠 子或微量滴定板以去除任何未结合的组分，直接或间接(如上文所述)测量 复合体的形成。或者，可以从基质中解离复合体，可以使用标准技术测定 上文所述多肽的结合水平或活性。
在本发明的筛选测定中还可以使用将蛋白质固定在基质上的其他技 术。例如，可以使用缀合生物素和链霉抗生物素蛋白来固定上文所述的多
肽或其结合分子。可以使用本领域熟知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals; Rockford， Ill.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)来制备生物 素化的本发明多肽或其乾分子，并固定在包被链霉抗生物素蛋白的96 ;U1 (Pierce Chemical)中。或者可以在平板的孔中衍生能与多肽或结合分子反 应但不干扰本发明多肽与其结合分子的结合的抗体。通过抗体缀合将未结 合的结合蛋白或本发明多肽捕获在孔中。除了上述用于GST-固定的复合体 的方法以外，用于检测这些复合体的方法包括使用与本文所述多肽或结合
相关的酶活性的酶联测定。
本发明还提供筛选防止和/或抑制和/或延緩胰岛素耐受性的化合物的 方法，其包括检测在存在或不存在所述化合物的情况下宿主分泌的可溶性 CD99,其中防止和/或抑制和/或延緩胰岛素耐受性的化合物为改变了宿主 分泌的CD99水平的化合物。
宿主可以是培养物中代表/S细胞的宿主细胞，或者是可用作胰乌素耐 受性模型的动物。
本发明还提供蛋白质CD99作为把标和/或标志物用于筛选防止和/或 抑制胰乌素耐受性的化合物的用途.
本发明的诊断、监测或患者筛选方法基于来自个体的液体样品。与本 领域已知的方法不同，通过4吏用特异性结合剂特异性地测量来自该液* 品的CD99。
特异性结合剂为例如CD99的受体或CD99的抗体。本领域技术人员 会理解，术语特异性用于表示样品中存在的其他生物分子不与对CD99具 有特异性的结合剂显著结合。低于5%交叉反应性的水平认为是不显著。
特异性结合剂优选为与CD99反应的抗体。术语"抗体"指多克隆抗体、 单克隆抗体、这些抗体的片段以及包含抗体结合结构域的基因构建体。
通过本领域现有方法产生抗体，例如Tijssen (Tijssen， P.，《Practice
and theory of enzyme immunoassays》 11 (1990)全书,特另'J是43-78页； Elsevier,Amsterdam)中所述。对于本发明公开的成就，使用了在兔中产生 的多克隆抗体。然而，显然还可以使用来自不同物种(如大鼠或豚鼠)的多 克隆抗体以及单克隆抗体。由于可以以任何数量产生具有恒定特性的单克 隆抗体，因此它们代表了在开发用于临床常规的测定中的理想工具。在本 发明方法中CD99单克隆抗体的产生和使用还是另一优选的实施方案。
技术人员会理解，既然已经将CD99鉴定为用于诊断胰岛素耐受性的 标志物，就可以使用备选方法达到与本发明的成果相当的结果。例如可以 使用产生抗体的备选策略。这些策略包括使用代表CD99表位的合成肽用 于免疫等。或者可以使用DNA免疫，也称为DNA接种。
为了进行测量，在适于形成结合剂-CD99复合体的条件下使得自个体 的液*品接触CD99的特异性结合剂。由于本领域技术人员可以无需进 行发明性努力而容易地鉴定这些适当的温育条件，因此这些条件无需指定。
作为本发明公开的方法的最后步骤，测量复合体的量并与胰岛素耐受 性诊断进行关联，或者与各自的对照进行关联，如上文所述.本领域技术 人员会理解，在相关教科书中都详细描述了测量特异性结合剂-CD99复合 体的多种方法(参阅如Tijssen P.，见上文或Diamandis，等编辑(1996) Immunoassay, Academic Press, Boston).
优选以夹层型测定形式中检测CD99。在这种测定中，使用第一种特 异性结合剂将CD99捕获在一面，在另一面使用第二种经标记而可以直接 或间接检测的特异性结合剂.
如上文所述，已经惊奇地发现可以在得自个体样品的液体样品中测量 CD99。在胰岛素耐受性诊断中应用标志物CD99不需要组织和活抬r样品。
在优选的实施方案中，使用血清作为液体样品材料实施本发明的方法。
在另 一优选的实施方案中，使用血浆作为液体样品材料实施本发明的 方法。
在另一优选的实施方案中，使用全血作为液体样品材料实施本发明的 方法。
对组织样品应用常规蛋白组学方法导致鉴定了许多针对所选择组织的 潜在标志物候选，然而令人惊奇地，本发明的发明人能够检测体液样品中
的CD99。甚至更令人惊奇地，他们能够证明在这些得自个体的液体样品 中CD99分存在可与胰岛素耐受性诊断相关。
可以在已建立的方法，例如原位胰岛素耐受性、活检或免疫组织学方 法中使用具很大优势的CD99抗体.
优选地，在定性(CD99存在与否)或定量(测定CD99的量)免疫测定中 使用CD99抗体。
已经证明在胰岛素耐受性和糖尿病领域中测量蛋白质CD99水平非常 具有优势。因此，在另一优选的实施方案中，本发明涉及在由得自个体的 液体样品进行的胰岛素耐受性诊断中使用蛋白质CD99作为标志分子。
术语标志分子用于表示个体的体液中测量到的分析物CD99水平的变 化标志着胰岛素耐受性的存在。
优选在II型糖尿病早期诊断中使用新标志物CD99。 特别优选在葡萄糖耐受不良的早期诊断中使用新标志物CD99。 还特別优选在糖尿病的疾病iUl监测中使用新标志物CD99, 使用蛋白质CD99本身代表了胰島素耐受性诊断这一具有挑战性的领 域的显著进步。将测量CD99与其他已知的糖尿病标志物(如胰岛素)或有 待发现的其他胰岛素耐受性标志物组合会引起进一步的改进。因此在另一 优选的实施方案中，本发明涉及在由得自个体的液,品进行的糖尿病、 优选胰岛素耐受性诊断中使用CD99作为糖尿病、优选胰岛素耐受性标志 分子与另一糖尿病、优选胰岛素耐受性的标志分子组合。可以与胰岛素耐 受性测量组合的优选选择的其他糖尿病标志物为胰烏素、前胰岛素和/或 C-肽。
通常最好以试剂盒形式提供特异性结合测定(如免疫测定)领域的诊断 试剂，所述试剂盒包括特异性结合剂和进行测定所需的辅助试剂。因此本 发明还涉及免疫试剂盒，其包括CD99的至少一种特异性结合剂和用于测 量CD99的辅助试剂。
评估新标志物CD99临床可用性的一种方法是通过用EHC法测量葡 萄糖移去率来测量诊断为胰岛素耐受性的17名患者中的水平，并与通过用 相同方法测定的表明为正常的17名患者中所测量的葡萄糖移去率水平进 行比较。对于统计学分析，进行标准斯氏t检验，<0.05的值认为是显著 的。
测试的准确性可以通过其接收器工作特性(ROC)进行描述(特别参阅 Zweig， M. H.和Campbell, G.， Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)。 ROC图是 由在观察数据的完整范围内连续改变判断阈值而得到的所有敏感性/特异 性对的曲线。
实验室测试的临床性能取决于其诊断准确性或将受试者正确归类至临 ^目关的亚组的能力。诊断准确性测量该测试正确区分研究受试者中两种 不同状态的能力。这些状态为例如使泉和疾病。
在每种情况下，ROC曲线描述在判断阈值的完整范围内敏感性对1-特异性作图得到的两种分布之间的重叠，y轴为敏感性或真阳性分数定义 为(真阳性测试结果数)/(真阳性数+假阴性测试结果数)l。这也称为存在疾 病或病症时的阳性度。它仅计算自受影响亚组.x轴为假阳性分数或1々 异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)l。它是特异性 的指标，完全计算自未受影响亚组。由于真阳性和假阳性分数通过使用来 自两个不同亚组的测试结果完全单独地计算，因此ROC图独立于疾病在 样品中的优势，ROC曲线的每个点代表对应于特定判断阈值的敏感性/特 异性对.具有完美分辨力的测试(在结果的两种分布之间无重叠)具有通过 左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100%(完美的敏感性)，而 假阳性分数为O(完美的特异性)。无分辨力的测试的理论曲线(两个组结果 的分布相同)为从左下角到右上角的45。对角线。多数曲线落在这两个极端 之间。(如果ROC曲线完全落在45。对角线以下，可以容易地通过将"阳性" 标准由"高于，，转变为"低于，，来进行校正，反之亦然。)定性地讲，曲线与左 上角越接近，测试的总体准确率就越高。
量化实验室测试的诊断准确率的一个便利的目标是通过单个数字表达其性能。最普遍的总体度量是ROC曲线下的面积。常规上该面积总是^ 0.5(如果不是，可以通过倒转判断原则来使其达到)。数值在l.O(两个组测 试值的完美分离)和0.5(两个组的测试值之间没有明显的分布差异)之间。该 面积不仅仅取决于曲线的特定部分(如最接近对角线或90%特异性处的敏 感性的点)，而是取决于整个曲线。这是ROC曲线有多接近完美曲线(面积 =l.O)的定量描述性表达。
要求保护的还有基本如上文所述、特别是参阅以下实施例的方法、用 途和试剂盒。
提供以下实施例、参考文献、序列表和图表用于辅助理解本发明，本 发明的真正范围在附带的权利要求书中公开。应该理解，可以对所公开的 方法进行修饰而不背离本发明的精神。
实施例
实施例1
通过分析0脉内皮细胞中的mRNA表达来鉴定胰乌素耐受性的候选内 皮标志蛋白
内皮细胞培养、mRNA提取、逆转录、标记和与DNA微阵列杂交
基于将来自胰岛素耐受性患者的血浆中蛋白质水平与来自对照的血浆 进行比较的分析，很明显在胰岛素耐受性个体中可以以更高水平检测到内 皮活化的标志物。最近的文献支持了这些发现(如Meigs等，JAMA 291 (2004) 1978 ff)。因此，带有靶向它们而用于外排的信号序列的高表达的内 皮蛋白或者带有通过单跨膜序列锚定在膜上的大胞外结构域的1型膜蛋白 都是内皮活化的潜在新标志蛋白。为了鉴定候选蛋白，在计算机芯片上分 析了胞外蛋白的mRNA表达数据集。
按照标准方法制备人血管内皮细胞(HUVEC)。筒言之，将静脉的血洗 净，接着灌注分散酶溶液(Roche，目录号295 825，在DMEM中以1:10稀 释)。将血管两端封闭，在37'C温育30分钟。接着收集分离的内皮细胞， 并用PBS洗涤脐静脉一次。将细胞以320xg离心10分钟，重悬于PO培养 基M199(Sigma目录号M7528)+ 20%胎牛血清+ 1%青霉素/链霉素+ 1%谷氨酰胺+ 100jig/ml ECGS (Sigma目录号E2759) + 100pg/ml肝素 (Sigma目录号H3149) + 1/500体积庆大霉素(Roche目录号1 059 467)。 24 小时后，洗下红细胞，用新鲜P9培养基更换培养基。再温育24小时后， 培养基更换为pl培养基:M199 (Sigma目录号M7528 + 20%胎牛血清+ 1%青霉素/链霉素+ 1%谷氨酰胺+ 50pg/ml ECGS (Sigma目录号 E2759) + 100>ig/ml肝素(Sigma目录号H3149)。
将HUVEC在pl培养基中培养48小时。48小时后，通过刮除来)|^ 细胞并用RNA-BeeTM提取细胞总RNA。对于每个样品，取10將细胞总 RNA进行逆转录(Invitrogen， U.S.)、标记(Ambion， U.S.)并使用市售试剂盒 按照提供商的说明进行处理。碱性热断裂和其后cDNA与U133A和B GeneChip阵列杂交的方法为微芯片生产商(Affymetrix, U.S.)提供的标准 方法。
用共焦激光扫描仪(Hewlett Packard, U.S.)记录阵列中细胞的强度值， 使用GeneChip v3.1软件(Affymetrix， U.S.)分析数据。以荧光强度与错配寡 核苷酸杂交相比的归一化平均差异来计算每个基因的表达水平，表达为平 均差异(A.D.)。该实验以一式三份进行，以解决生物学变异。
通过在计算机芯片上分析mRNA表达数据集来鉴定高表达的胞外蛋白质
选择了在上述数据蓋中显示最高的mRNA水平(最高的A.D.值)的200 个基因。通过惯用的以概率方式预测信号和膜锚定序列的软件工具分析相 应的蛋白序列。简言之，该软件工具展示来自SwissProt或真核基因组中 预测的蛋白质的信号肽或膜锚定预测。它基于一组专门的人工辅助的隐蔽 马尔可夫模型(HMM),其试图识别信号肽或锚各自的共有序列特征(Sean
R. Eddy, HMMER 2.3.2， httD:〃hmmer.wustl.edu)。由于并不能可靠地预测 这些信号序列，因此对任何给定输入序列的"信号"和"锚"评分要在第二个 分析步骤中提交支持向量机(Support Vector Machine)(SVM)(Cristianini N， Shawe曙Taylor J. 《An Introduction to Support Vector Machines and other Kernel-based Learning Methods》.Cambridge University Press, Cambridge, England, 2000) 。 SVM为两个类别对真实实例集合进刊哨练。 在该训练集合中，SVM在三个训练集合(信号-锚-都不)中得到以下结果。 对预测为胞外("信号"或"锚")的蛋白质进一步评估器官特异性。进行了对 编码候选蛋白的公共结构域表达序列标签的搜索，并按照组织来源进行分 组。仅保留在血管中表达而且不在其他分泌器官(如肝、胰)中显示强烈表 达的那些蛋白质.
实施例2
产生针对胰岛素耐受性标志物CD99的抗体
产生了针对胰岛素耐受性标志物CD99的多克隆抗体，以将抗体进一 步用于通过免疫检测测定(如Western印迹和ELISA)测量CD99的血清和 血浆和血液水平。
;U^杆菌中的重组蛋白表达
为了产生CD99的抗体，进行蛋白质的重组表达以获得免疫原。应用 RTS100表达系统和大肠杆菌的组合来完成表达.在笫一步中，分析DNA 序列并使用"ProteoExpert RTS E.coli HY，，系统获得高产量cDNA沉默突 变变体及其各自PCR引物序列的推荐。这是基于商业网络的服务 (www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，使用"RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His誦tag" (Roche Diagnostics GmbH， Mannheim， Germany, Cat.No. 3186237)系统由cDNA产生线性PCR模板并用于体外转 录和表达编码CD99蛋白的核苷酸序列。为了进行Western印迹检测和其
后的纯化，表达的蛋白质含有His标签。鉴定表达最佳的变体。按照生产 商的说明进行从PCR到表达和检测的所有步骤。按照生产商的说明将含有 所有必需T7调节区(启动子、核糖体结合位点和T7终止子)的各个PCR产 物克隆进pBAD TOPO⑧栽体(Invitrogen， Karlsruhe, Germany,目录号K 4300/01)。为了使用T7调节序列进行表达，将构建体转化进大肠杆菌BL 21(DE3)(Studier， F.W.，等，Methods Enzymol. 185 (19卯)60-89),并以1升 的批次培养转化的细菌用于蛋白质表达。
按照标准方法在Ni-螯合柱上完成His-CD99融合蛋白的纯化。简言之， 通过离心沉淀含有His-CD99融合蛋白表达载体的1升细菌培养物。将细 胞沉淀物重悬于含有磷酸盐，pH8.0、 7M氯化胍、咪唑和巯甘油的裂解緩 冲液中，接着使用111&3-1110^乂@进行匀浆。通过高速离心沉淀不溶物质并 将上清液应用于Ni-螯合层析柱。用几倍柱床体积的裂解緩冲液^a,接着 用含有磷酸盐,pH 8.0和尿素的緩冲液洗涤.fe^使用含有SDS的磷酸緩 冲^酸性条件下洗脱结合的抗原。
产生针对蛋白质CD99的单克隆抗体
a) 免疫小鼠
用100將CD99皿内最初免疫12周龄的A/J小鼠。6周后以一个月 的间隔进一步腹膜内免疫两次。在这个过程中，对每个小鼠施用100叫吸 附在氢氧化铝上的CD99以及109个百日咳博德特氏菌(5onfete/te pert"柳's)细菌.其后在融合前第3天和第2天^^吏用PBS中的100將CD99 通过静脉内进行后两次免疫。
b) 融合和克隆
Galfre， G.和Milstein， C.， Methods in Enzymology 73 (1981) 346 将按照a)免疫的小鼠脾细胞与骨髄瘤细胞融合。在该过程中，将免疫小鼠 的约lx108个脾细胞与2xl07个骨髄瘤细胞(P3X63-Ag8-653， ATCC CRL1580)混合并离心(4。C， 300 g， 10分钟)。接着用无胎牛血清(FCS)的
RPMI 1640培养基洗涤细胞一次，并在50 ml锥形管中以400 g再次离心。 弃去上清液，轻敲将细胞沉淀打散，加入lmlPEG(分子量4000, Merck， Darmstadt)并吹打混合。37。C水浴1分钟后，室温下在4-5分钟的时间内 逐滴加入5 ml无FCS的RPMI 1640。其后在约1分钟内逐滴加入含10% FCS的5 ml RPMI 1640，彻底混合，用培养基(RPMI 1640+10% FCS)补 足50 ml，接着在4。C以400 g离心10分钟。将沉淀细胞置于含有10 % FCS 的RPMI 1640培养基中，并接种在次黄噤呤-偶氮丝氨酸选择培养基(RPMI 1640中的100 mmol/1次黄噪呤、1將/ml偶氮次黄噪—10% FCS)中。在 培养基中以100 U/ml加入白细胞介素6作为生长因子。约10天后，对原 代培养物测试特异性抗体。使用荧光激活细胞M仪将CD99阳性原代培 养物克隆进96孔细胞培养板。在此过程中，在培养基中再加入IOO U/ml 的白细胞介素6作为生长添加剂。
c)从细胞培养物上清液中分离免疫球蛋白
以每ml lxl()S个细胞的密度将得到的杂交瘤细胞接种到含有10% FCS的RPMI1640培养基，并在发酵罐(Thermodux Co.， Wertheim/Main， ModelMCS-104XL，订购号144-050)中增殖7天。平均来说，在培养物上 清液中得到每ml 100吗浓度的单克隆抗体。通过蛋白质化学常规方法从 培养物上清液中纯化该抗体(如按照Bruck， C.，等，Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695)。
产生多克隆抗体 a)免疫
为进行免疫，制M白质溶液(100 jig/ml蛋白质CD99)和弗氏完全佐 剂l:l比例的新鲜乳剂。在第l、 7、 14和30、 60和90天用1 ml乳剂免 疫每只兔子。抽血并使用得到的抗CD99血清进行如实施例3和4所述的 其他实验.
b)通过用辛酸和硫酸铵进行连续沉淀从兔血清中纯化IgG(免疫球蛋白G) 用4倍体积的乙酸緩冲液(60mM， pH4.0)稀释一倍体积的兔血清。用 2 M Tris-base将pH调整至4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸(25 jil/ml稀释 样品)。30分钟后离心样品(13000xg, 30分钟，4。C)，弃去沉淀并收集上清 液。通过加入2 M Tris-base将上清液的pH调整至7.5并过滤(0.2 nm)。在 剧烈搅拌下通过逐滴加入4 M硫酸铵溶液至终浓度2 M来沉淀上清液中的 免疫球蛋白。通过离心收集沉淀的免疫球蛋白(8000xg， 15分钟，4°C)。
弃去上清液。将沉淀溶于10 mM NaH2P04/NaOH， pH 7.5、 30 mM NaCl并充分透析。离心透析物(13000xg， 15分钟，4'C)并过滤(0.2 jim)。
多克隆兔IgG的生物素化
将多克隆兔IgG用10 mM NaH2P04/NaOH、 pH 7.5, 30 mM NaCl 调节到10 mg/ml。在每ml IgG溶液中加入50 jil生物素-N-羟基琥珀酰亚 胺(DMSO中3.6 mg/ml)。室温30分钟后，在Superdex 200 (10 mM NaH2P04/NaOH， pH 7.5、 30 mM NaCl)上层析样品。收集含有生物素化 IgG的级分。单克隆抗体已按照同一方法进行生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黄毒苷化
将多克隆兔IgG用10 mM NaH2P04/NaOH、 pH 7.5, 30 mM NaCl 调节到10 mg/ml。每ml IgG溶'紗入50 pi洋地黄毒苷-3-0-甲基絲-s-4RJ^己^"N-羟^t珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, 目录号1 333 054)(DMSO中3.8 mg/ml)。室温30分钟后，在Superdex 200 (10 mM NaH2P04/NaOH， pH7.5、 30 mM NaCl)上层析样品。收集含有洋 地黄毒苷化IgG的级分。单克隆抗体已按照同一方法用洋地黄毒苷标记。
实施例3
Western印迹
将通过肝素柱从培养基中富集并分离(如上文所述)的蛋白质样品溶于
由10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 150 mM NaCl、 0.05 % Tween 20、 1 % SDS 组成的样品緩冲液，并在4。C以12000 g离心10分钟。使用建立自一系列 已知牛血清白蛋白标准品的标准曲线通过Bradford测量上清液的蛋白质 浓度。将样品与样品緩冲液(60 mM Tris-HCl、 2% SDS、 0.1%溴酚蓝、25% 甘油和14.4 mM 2-巯基乙醇，pH 6.8)混合并在70卩温育5分钟后，通过 12.5 %均相ExcelGel SDS凝胶(Amersham Bioscience)分离样品并电转移至 硝酸纤维素膜上。在封闭液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5、 150 mM NaCI、0.05% Tween 20和5%脱脂乳粉)中温育后，将膜分别与兔抗大鼠抗体在室温下温 育2小时。用洗涤溶液(tris緩冲盐水中0.3% Tween 20)洗涤三次，每次10 ^绅后，室温下将膜分别与级^^根过氧化物酶的抗兔IgG(H+L)、抗小鼠 IgGi 和抗'J、鼠 IgG2a (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)温育1小时。洗膜10分钟3次，按照生产商的方案通过 增强化学发光试剂(Western Lightning TM， PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA)在X光胶片上使抗原-抗体复合体显色。
实施例4
用于测量人血清和血浆样品中CD99的ELISA
为了检测人血清或血浆中的CD99而开发了夹层ELISA。为了捕获和 检测抗原，将抗CD99多克隆抗体(参阅实施例2)的等分试样分别与生物素
和洋地黄毒苷缀合。
将包被链霉抗生物素蛋白的96孔微量滴定板与10 mM磷酸，pH 7.4, 1% BSA, 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中的100 pi 10 jig/ml的生物素化 抗CD99多克隆抗体温育60分钟。温育后，用0.9。/。NaCl ， 0.1% Tween 20洗涤平板三次。接着将孔与作为标准抗原的重组蛋白(参阅实施例2)连 续稀释液或来自患者的稀释血浆样品温育2小时。结合CD99之后，用0.9%NaCl , 0.1% Tween 20洗涤平板三次。为了特异性检测结合的CD99,将 孔与10 mM磷酸，pH 7.4， 1% BSA， 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中的 100 fil 10 ng/ml的洋地黄毒苷化抗CD99多克隆抗体温育60分钟。其后洗 涤平板三次以去除未结合的抗体。在下一步骤中，在10mM磷酸，pH7.4， 1% BSA, 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中将孔与20 mU/ml抗洋地黄毒苷 -POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,目录号 1633716)温育60分钟。其后用同一緩冲液洗涤平板三次。为了检测抗原-抗体复合体，将孔与100 pi ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,目录号11685767)温育并在30-60分钟后用ELISA 读数器测量405 nm处的OD。
实施例5
患者数据的统计学分析
新标志物CD99的临床实用性通过测量其在IO名依赖外源胰岛素注射 的糖尿病患者中的水平并将该水平与表明为正常^细胞功能的IO名患者中 测量的水平进行比较来评估.通过标准斯氏t检,估进行统计学分析， 认为<0.05的值是显著的.
权利要求
1.监测糖尿病发展的方法，所述方法包括以下步骤a)提供得自个体的液体样品，b)将所述样品与CD99的特异性结合剂在适于所述结合剂和CD99之间形成复合体的条件下接触，和c)将(b)中形成的复合体的量与胰岛素耐受性中形成的复合体的量相关联。
2. 监测糖尿病疗效的方法，所述方法包括以下步骤a) 提供得自针对糖尿病进行治疗的患者的液体样品，b) 将所述样品与CD99的特异性结合剂在适于所述结合剂和CD99 之间形成复务沐的M下接触，和c) 将(b)中形成的复合本的量与无治疗时形成的复合体的量相关联。
3. 诊断胰岛素耐受性的方法，所述方法包括以下步骤a) 提供得自个体的液,品，b) 将所述样品与CD99的特异性结合剂在适于所述结合剂和CD99 之间形成复合体的务ff下接触，和c) 将(b)中形成的复合体的量与胰岛素耐受性诊断相关联。
4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其特M在于所述样品为血清o
5. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其特M在于所述样品为 血浆。
6. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其特M在于所述样品为 全血，
7. 蛋白质CD99作为标志分子的用途，用于从得自个体的液体样品 诊断胰岛素耐受性。
8. 蛋白质Endoglin作为标志分子的用途，用于从得自个体的液^# 品早期诊断II型糖尿病。
9. 根据权利要求8的用途，其中用来自患有葡萄糖耐受不良的患者 的样品进行早期诊断。
10. 蛋白质CD99用于监测糖尿病尤艮的用途。
11. 蛋白质CD99用于监测糖尿病疗效的用途。
12. 蛋白质CD99作为胰岛素耐受性的标志分子的用途，与胰岛素耐 受性的至少一种其他标志分子组合用于从得自个体的液体样品诊断胰岛素 耐受性。
13. 免疫试剂盒，其包含CD99的至少一种特异性结合剂以及用于测 量CD99的辅助试剂。
14. 筛选与CD99相互作用的化合物的方法，所述方法包括以下步骤a) 将蛋白质CD99与一种或多种化合物在允许所述一种或多种化合 物与CD99相互作用的条件下接触；和b) 检测所述一种化合物或多种化合物与所述多肽之间的相互作用.
15. 筛选可以预防和/或抑制和/或减弱胰岛素耐受性的化合物的方法， 所述方法包括以下步骤a) 将化合物与蛋白质CD99接触；b) 测量蛋白质CD99的活性；其中抑制蛋白质CD99活性的化合物为可以预防和/或抑制胰岛素耐受 性的化合物。
16. 权利要求14和15任一项的方法，所述方法还包括在步骤a)之前 或步骤a)和b)之间固定化蛋白质CD99的步骤。
17. 筛选预防和/或抑制和/或延緩胰岛素耐受性的化合物的方法，所述 方法包括检测在存在或不存在所述化合物的情况下从宿主分泌的可溶性 CD99的步骤，其中预防和/或抑制和/或^胰岛素耐受性的化合物为改变 宿主分泌的CD99水平的化合物。
18. 蛋白质CD99作为乾标和/或标志物的用途，用于筛选预防和/或抑 制胰岛素耐受性的化合物。
19. 基本如上文所述、特别是参考上述实施例描述的方法、用途和试 剂盒。
全文摘要
本发明涉及通过测量液体样品中的CD99水平来监测疾病发展和诊断胰岛素耐受性，以及筛选用于预防和/或治疗糖尿病的新化合物。
文档编号G01N33/566GK101099084SQ200580046397
公开日2008年1月2日 申请日期2005年12月9日 优先权日2004年12月14日
发明者E·谢伯科娃, M·L·马丁, M·丰图拉基斯, P·伯恩特, S·埃弗斯, S·福瑟尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司