miRNA-146a突变体在制备宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条中的应用的制作方法

本发明涉及宫颈癌的早期筛查诊断试剂，具体地，公开了miRNA-146a突变体在制备宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条中的应用。

背景技术：

宫颈癌作为全球女性恶性肿瘤的第二大杀手，其防治一直以来都是全球公共卫生重点领域之一。统计数据显示，全球每年新发宫颈癌50余万例，其中中国新发病例占28.8%，高达到13.15万。世界范围内每年约有27.4万妇女死于宫颈癌，我国每年约5万多妇女死于宫颈癌。宫颈上皮内瘤变（cervical introepithelial neoplasia, CIN）是癌前病变，根据不典型增生细胞在鳞状上皮内所占的范围分为CIN I（轻度）、CIN II（中度）和CIN III（重度）三个级别。世界卫生组织（WHO）描述，CIN I 级和CIN II 级进展到CIN III 级约需3-8 年时间，CIN I 级转癌率为0.69%-6.2%, C1N II 级转癌率为4.3%-13.3%，CIN III 级转癌率则高达12%-65% 。研究表明，有效的筛查可以将宫颈癌发病率降低60-90% 。临床常用的检查手段有宫颈脱落细胞学检查（包括传统的巴氏涂片法和液基细胞学技术）、阴道镜检查以及HPV-DNA基因检测技术。

肉眼观察筛查方法包括醋酸染色和碘染色实验（VIA和VILI）。由于资金和合格的细胞学专业技术人员等方面的短缺，VIA/VILI 是目前WHO推荐在发展中国家和地区进行宫颈癌筛查的替代手段。这两种方法虽然操作简单、价格便宜，但灵敏度和特异度均较低（费华丽，程易凡，程晓东等。五种检测方法在宫颈癌及其前期病变筛查中的准确性评估.中华医学杂志.2011,91(5)：309-312）, 约20-50% , 而且筛出的病例大部分是浸润癌和早期原位癌。 宫颈细胞学检查包括传统的巴氏涂片法和液基细胞学检查。但是巴氏涂片的敏感度较低，只有25-50％左右，造成大量的假阴性, 因而临床应用受到限制。1996年美国FDA批准薄层液基细胞学技术(LBC)用于宫颈癌筛查，LBC特殊的制片方法使宫颈异常细胞检出率高达95％以上，敏感度高出巴氏涂片40％左右，假阴性率降低60%。目前在发达国家，LBC已逐渐取代巴氏涂片成为被推荐的标准初筛方法（Sherman ME, Lorincz AT, Scott DR, et al. Baseline cytology, human papillomavirus testing, and risk for cervical neoplasia: a 10-year cohort analysis. J Natl Cancer Inst. 2003; 95:46-52），但由于其较高的价格和较高的技术要求很难在发展中国家和地区推广。阴道镜观察主要以病灶的边界形态、颜色、血管结构和碘反应四个征象反映病灶的异常。若镜下有异常部位则定点取活检标本或刮取颈管黏膜送病理检查。但由于阴道镜操作常存在个人判断误差, 可能影响到诊断和活检部位的选择，出现误诊。

目前，世界卫生组织推荐的宫颈癌早期筛查方案是HR-HPV联合细胞学检测，但这一方案仍然存在许多局限与不足。新型肿瘤标志物因其在疾病的不同时期有特异性表达，所以将在宫颈癌的早期发现、治疗和预后判断方面发挥重要作用。如HR-HPV E6/E7 mRNA检测、P16INK4a/Ki-67双重免疫染色、HPV L1衣壳蛋白和hTERC基因联合检测等方法可能会成为HR-HPV DNA阳性患者的二次筛查标志物，以确定患者是否需立即行阴道镜下活检确诊或治疗。可以预测，无论是在发达国家还是发展中国家，用HR-HPV检测作为初筛、特异性宫颈癌标志物作为二次筛查的防治方案将在在宫颈癌防治中发挥重要作用。宫颈癌特异性标志物的检测将为临床宫颈癌的早期诊断和治疗提供新的思路。

microRNA表达异常和基因突变在许多肿瘤中均已得到证实，并认为对癌症早期诊断和预后评估具有重要价值(Hasani S-S, Hashemi M, Eskandari-Nasab E, Naderi M, Omrani M, Sheybani-Nasab M. A functional polymorphism in the miR-146a gene is associated with the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia: a preliminary report. Tumor Biology. 2014;35:219-25)。研究发现，宫颈癌组织中miR-21，127，199a的表达上调和miR-146a，214，218，34a的表达下调，提示miRNAs在宫颈癌变过程中发挥了一定的调控作用（Lee JW, Choi CH, Choi JJ, et al. Altered MicroRNA expression in cervical carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(9):2535-2542.）。最近的研究发现（Gadducci A,Guerrieri ME,Greco C.Tissue biomarkers as prognostic variables of cervical cancer[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2013, 86(2):104-129.），miR-9，145，146a，200a，886-5p，424在宫颈癌中出现异常表达，由于这些miRNA表达的变化发生在癌前病变早期，因此有望成为宫颈癌早期筛查的生物标志物(Srivastava K, Srivastava A. Comprehensive review of genetic association studies and meta-analyses on miRNA polymorphisms and cancer risk. PloS one. 2012;7:e50966.)。Wang等研究发现（Wang X, Tang S, Le S Y, et al. Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth[J]. PloS one, 2008, 3(7): e2557.）miR-146a-5p在宫颈癌组织中上调，将miR-146a-5p转染入宫颈癌HeLa细胞中，可促进其增殖。miR-146a-5p 可通过LMP1(latent membrane protein 1)的表达激活NF-κB（nuclear factor kappa B），这表明NF-κB是miR-146a-5p调控的靶基因之一，它们共同参与的宫颈癌的发展过程(Cameron JE, Yin Q, Fewell C, Lacey M, McBride J, Wang X, et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces cellular MicroRNA miR-146a, a modulator of lymphocyte signaling pathways[J]. Journal of virology. 2008,82(4):1946-58)

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor , TNF- α) 是一种具有广泛生物学效应的细胞因子。TNF- α属于Ⅱ型膜蛋白，以三聚体的形式发挥作用。TNF-α的基因长约 3.6kb, 位于人染色体 6p21.1～p22, mRNA 长度 1.7 kb。TNF- α基因的 TATA 盒在转录位点上游 20bp 处, 在其上游包括至少 5个NF-κB 增强子及 c-jun /AP- 1 结合位点等。因此研究发现炎症因子TNF-α可通过NF-κB诱导miR-146a的表达。以上研究表明，某些特定的microRNAs如miR-146a-5p可作为宫颈癌筛查和预后评估的新型标志物(Sandhu R, Rein J, D'Arcy M, Troester MA. Over-expression of miR-146a in basal-like breast cancer cells confers enhanced tumorigenic potential in association with altered p53 status. Cancer research. 2013;73:4196-.Palmieri A, Carinci F, Martinelli M, Pezzetti F, Girardi A, Cura F, et al. Role of the MIR146A polymorphism in the origin and progression of oral squamous cell carcinoma. European journal of oral sciences. 2014;122:198-201.)。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供了miRNA-146a突变体在制备宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条中的应用。

本发明的另一目的在于提供miRNA-146a在制备纳米金寡核苷酸探针中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种miRNA-146a宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

miRNA-146a突变体在制备宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条中的应用，miRNA-146a突变体的序列如SEQ ID NO:1~2所示。miRNA-146a突变体序列的miRNA-146a-5p如SEQ ID NO:1所示，miRNA-146a突变体序列的miRNA-146a-3p如SEQ ID NO: 2所示。

miRNA-146a在制备纳米金寡核苷酸探针中的应用，利用序列如SEQ ID NO:1~2所示的miRNA-146a突变体和序列如SEQ ID NO:3~4所示的miRNA-146a野生型设计检测探针，所述检测探针序列如SEQ ID NO:5所示；将所述检测探针进行巯基化修饰后，连接到纳米金颗粒表面，所述纳米金颗粒表面还吸附有辣根过氧化物酶HRP，得到纳米金寡核苷酸探针。

miRNA-146a野生型序列miRNA-146a-5p如SEQ ID NO:3所示，miRNA-146a野生型序列的miRNA-146a-3p如SEQ ID NO: 4所示。检测探针序列如SEQ ID NO:5所示。结合纳米金颗粒的巯基化检测探针序列为：5′-Thio/MC6-D/GGG GTT TCA CCG TGT TAG CCA GGA TGG TCT- 3′.

一种miRNA-146a宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条，包括如下组分：权利要求2所述的纳米金寡核苷酸探针，分别如SEQ ID NO:6~7所示的生物素捕获探针A、B，以及依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸收垫；所述硝酸纤维膜上固定有作为检测带的生物素捕获探针A和作为质控带的生物素捕获探针B。

生物素捕获探针A如SEQ ID NO:6所示，为5′- biotin/CGC CCG GCT AAT TTT TTG TAT TTT TAG TAG AGA C - 3′；生物素捕获探针B如SEQ ID NO:7所示，为5′-biotin/ATG AGA CCA TCC TGG CTA ACA CGG TGA AAC CC - 3′。

本发明采用硝酸纤维膜为固相载体，利用纳米金寡核苷酸探针和辣根过氧化物酶（HRP）双重放大后的目标mRNA快速形成杂交双链的原理，制作miRNA-146a(G/C)突变快速诊断试纸条，利用突变基因特异性引物识别靶基因的特定区域来实现宫颈癌早期筛查快速诊断。

优选地，使用时，将样品液滴加在试纸条的加样垫上，15分钟后，硝酸纤维素膜上的检测区显示红色的为miRNA-146a突变体患者，为高度怀疑宫颈癌患者；检测区白色表明是miRNA-146a野生型，表明宫颈组织目前尚未发生恶变。

将不同浓度的样品（野生型，突变型和非特异性核酸）液滴加在试纸条的加样垫上，15分钟后，硝酸纤维素膜上的检测区显示红色的为miRNA-146a(G/C)突变体患者，为高度怀疑宫颈癌患者；检测区白色表明是miRNA-146a野生型，表明宫颈组织目前尚未发生恶变；多余的纳米金则会与控制区域的检测探针完全互补，显示红色。miRNA-146a野生型和突变体在同一试纸条进行检测：将扩增样品液滴加在一次性试纸条上15分钟后，硝酸纤维素膜上检测区显示红色条带的表明样品为miRNA-146a(G/C)突变型，检测区仍是白色表明样品为miRNA-146a野生型。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：该技术与以往常规诊断方法相比具有的突出优点是灵敏高、操作简单（除水浴箱、便携式化学发光仪外不需任何仪器）、快速（1小时）、价格低廉（50-80元），为早期诊断、预防和治疗宫颈癌提供了最佳平台，能适用于所有国家尤其是在发展中国家低收入人群中的大规模HPV和宫颈癌筛查，快速改变宫颈癌发病率和死亡率居高不下的现状。对HPV感染和宫颈癌的流行病学调查、早期诊断和治疗具有非常重要的意义，并具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是构建miRNA-146a基因突变快速诊断试纸条示意图。

图2 是构建纳米金寡合甘酸探针示意图。

图3 是miRNA-146a野生型和突变体基因结构。

图4 是miRNA-146a快速诊断试纸条条件优化及样品的检测结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 构建快速诊断试纸条

构建纳米金寡核苷酸探针如图2所示：利用序列如SEQ ID NO:1~2所示的miRNA-146a突变体和序列如SEQ ID NO:3~4所示的miRNA-146a野生型设计检测探针，所述检测探针序列如SEQ ID NO:5所示；将所述检测探针进行巯基化修饰后，连接到纳米金颗粒表面，所述纳米金颗粒表面还吸附有辣根过氧化物酶HRP，得到纳米金寡核苷酸探针。图3 是miRNA-146a野生型和突变体基因结构。

构建HPV快速诊断试纸条如图1所示：将上述制得的纳米金寡核苷酸探针，分别如SEQ ID NO:6~7所示的生物素捕获探针A、B，以及依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸收垫；所述硝酸纤维膜上固定有作为检测带的生物素捕获探针A和作为质控带的生物素捕获探针B。

带有探针的纳米金颗粒被装载连接在硝酸纤维膜结合垫上，生物素捕获探针A连接在硝酸纤维膜的检测区，生物素捕获探针B连接在硝酸纤维膜的对照区。

实施例2

利用实施例1构建的快速诊断试纸条进行检测。将含有目标DNA的样品液滴加在结合垫上，通过虹吸作用开始移动，先经过检测区，再到对照区。目标DNA会和带有探针的纳米金颗粒发生特异性结合，结合后会继续移动，到检测区后会和检测探针发生结合反应，随着继续移动又会和对照探针发生结合反应，这两区的结合蛋白会在此时显示红色，为HPV阳性，检测区仍然是白色的表明HPV阴性。

目标DNA序列如SEQ ID NO:8所示，为5′- AGA CCA TCC TGG CTA GTC TGT TGT CTC TAC TAA AAA TA- 3′。

miRNA-146a快速诊断试纸条条件优化及样品的检测结果，结果见图4。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东医学院

<120> miRNA-146a突变体在制备宫颈癌早期筛查快速诊断试纸条中的应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 99

<212> DNA

<213> miRNA-146a突变体序列的miRNA-146a-5p

<400> 1

ccgatgtgta tcctcagctt tgagaactga attccatggg ttgtgtcagt gtcagacctc 60

tgaaattcag ttcttcagct gggatatctc tgtcatcgt 99

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> miRNA-146a突变体序列的miRNA-146a-3p

<400> 2

tgaatatttt tgaaaaatta caaattaatt ttatgctact attaattatg attttatagc 60

gcgattaaat ttaagatagt ttcttttatg atacaaatg 99

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> miRNA-146a野生型序列miRNA-146a-5p

<400> 3

ccgatgtgta tcctcagctt tgagaactga attccatggg ttgtgtcagt gtcagacctc 60

tgaaattcag ttcttcagct gggatatctc tgtcatcgt 99

<210> 4

<211> 99

<212> DNA

<213> miRNA-146a野生型序列的miRNA-146a-3p

<400> 4

tgaatatttt tgaaaaatta caaattaatt ttatgctact attaattatg attttatagc 60

gccattaaat ttaagatagt ttcttttatg atacaaatg 99

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 检测探针序列

<400> 5

ggggtttcac cgtgttagcc aggatggtct 30

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 生物素捕获探针A

<400> 6

cgcccggcta attttttgta tttttagtag agac 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 生物素捕获探针B

<400> 7

atgagaccat cctggctaac acggtgaaac cc 32

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 目标DNA序列

<400> 8

agaccatcct ggctagtctg ttgtctctac taaaaata 38