专利名称：超敏化学发光酶免法测定人肿瘤可溶性蛋白sp185的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用超敏化学发光酶联免疫吸附法定量测定人Her-2/Neu癌基因可溶性产物sp185Her-2的含量。
背景技术：
美国Oncogene Science公司专利(细胞溶胞产物中检测neu p185)纯化并确认了检测产物为分子量97kDa-115kDa的人neu基因表达的胞外区蛋白。
专利文献-Carney(Oncogen Science，Inc)细胞溶胞产物中检测neu p185(Detection of neup185 in cell lysates)、美国、分类号(435/7.23；435/7.1；435/7.7；435/7.92；436/64；436/813；530/388.8；530/388.85)、申请日(1994年3月30日)、申请公布日(1997年2月18日)、申请号(220962)、专利号(5,604,107)。
奥地利Bender MedSystems GmbH的BMS207CE sp185Her-2应用酶联免疫吸附法定量测定细胞培养上清液、人血清、血浆、羊水或其他体液中Her-2/Neu癌基因可溶性产物sp185Her-2。测试原理抗sp185Her-2单克隆抗体包埋微孔。样本或标准品中sp185Her-2结合在包埋抗体上；加入辣根过氧化酶(HRP)联结的单克隆抗sp185Her-2抗体，它和已被第一抗体捕获的sp185Her-2结合。孵育后洗除未结合的抗sp185Her-2酶联结抗体，加入辣根过氧化酶底物。有色产物形成和样本中sp185Her-2含量成正比。加酸终止反应，在450nm处测吸光度。从有7个sp185Her-2标准品制成的标准曲线上求得样本中sp185Her-2含量。
该法曾应用于测定人血清中Her-2/Neu癌基因可溶性产物sp185Her-2，实时观察乳腺癌患者术后sp185Her-2含量的变化，有助于预后的临床评估(见以下参考文献)。
Klein B，Levin I，Kfir B，Marinski R，Rakowski E，Shapira J，等。乳腺癌患者可溶性c-erbB-2(P185)和预后的关系。肿瘤报告1995；2759-61。[Klein B，Levin I，Kfir B，Marinski R，Rakowski E，Shapira J，et al.Soluble c-erbB-2(P185)in breast cancerpatients in relation to prognosis.Oncol Rep 1995；2759-61.]Visco V，Bei R，Moriconi E，Gianni W，Kraus MH，Muraro R.乳腺癌患者可溶性受体外辖区ErbB2的免疫反应。美国病理杂志2000；1561417-24。[immune response in breastcancer patients with soluble receptor ectodomain.Am J Pathol 2000；1561417-24.]中国科学技术大学专利(人肿瘤抗原p185#+[HER-2]的检测方法及肿瘤诊断用途)应用双抗体夹心ELISA检测可溶性p185#+[HER-2]抗原。
专利文献-中国科学技术大学人肿瘤抗原p185#+[HER-2]的检测方法及肿瘤诊断用途，中国，公开(公告)号(1397803)、公开(公告)日(2003.02.19)、主分类号(G01N33/531)、分类号(G01N33/531；G01N33/574；G01N33/96；C07K1/14)、申请(专利)号(01113787.8)、申请日(2001.07.13)中国科学技术大学专利其ELISA检测原理和方法和Bender MedSystems完全一致。二者均没有象美国Oncogene Science公司专利那样确认检测产物的理化属性，单克隆抗体识别的可溶性p185[HER-2]抗原分子量大小未知，因而和美国Oncogene Science公司专利无冲突。
美国Oncogene Science公司专利、奥地利Bender MedSystems GmbH的BMS207CE sp185Her-2和中国科学技术大学专利均采用可见光底物测定辣根过氧化酶活性。超敏化学发光底物测定辣根过氧化酶活性可大大提高测试敏感性、降低试剂尤其是单抗用量，作为新一代ELISA适合在临床上推广使用。
发明内容
本发明和Bender MedSystems GmbH BMS207CE sp185Her-2一样采用固相双位点夹心式酶联免疫吸附技术，使用其包埋单克隆抗体、辣根过氧化酶标记单克隆抗体和人Her-2/Neu癌基因可溶性蛋白sp185Her-2作为标准品。为了降低成本，本发明在反应微孔面积和辣根过氧化酶底物的选择上大力创新。
1.采纳小容量微孔板小容量微孔表面积为常规微孔的一半。小容量微孔提高了表面积/容量比率，缩短了溶液中分子扩散到表面的时间，从而加快了分子在表面的吸收率。在不影响反应敏感性的前提下，包埋小容量微孔仅需包埋常规微孔30％的抗体量。除此之外，还节省了50％其他反应试剂。
2.选择超敏化学发光底物测定辣根过氧化酶活性Bender MedSystems GmbH BMS207CEsp185Her-2使用四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB)作为辣根过氧化酶的底物。其酶联免疫吸附法的敏感性依赖于TMB的检测下限(2,000,000×10-21摩尔辣根过氧化酶)。除此之外，由于可见光测量的物化限制(Lambert & Beer定律)，其有效检测范围仅在100×之内。本发明屏弃TMB，选择超敏化学发光底物测定辣根过氧化酶活性。化学发光的定量测定仅限于光倍增管(Photo-multiplier)的分辨力。通常化学发光仪的有效检测范围在10-2×1011相对光单位/秒(relative light units/second，RLU/S)。因此，使用超敏化学发光底物和化学发光仪可加宽检测线性范围(10,000×)，提高反应敏感性，使检测下限达2,000×10-21摩尔辣根过氧化酶。在不影响反应敏感性的前提下，本发明使用超敏化学发光底物和化学发光仪节省了试剂使用量，达到了降低试剂成本的初宗。
具体实施例方式
一、试剂的准备1.小容量微孔板的准备1)包埋最终抗sp185Her-2单克隆抗体的浓度＜2.5μg/ml磷酸盐缓冲液(PBS)；每孔加＜100μl包埋液，2-8℃过夜。洗涤液(含0.01-0.1％Tween20 PBS)洗板一次。
2)阻断用反应液(含0.5-3％小牛血清白蛋白BSA、0.01-0.1％Tween20 PBS)阻断微孔表面非特异性结合位点。然后，洗板二次。
2.标准品的准备最高sp185Her-2标准蛋白的浓度≤10ng/ml反应液，将此1∶3稀释6次以制备标准曲线。
3.辣根过氧化酶联结的单克隆抗sp185Her-2抗体的准备用反应液＜1∶7,500稀释辣根过氧化酶联结的单克隆抗sp185Her-2抗体。
二、测试步骤
1.sp185Her-2标准蛋白的稀释加50μl反应液至所有标准孔，但A1留空。加入75μl sp185Her-2标准蛋白至A1。转移25μl到B1。混匀B1后再转移25μl到C1。重复此步骤4次，形成最高不超过10ng/ml sp185Her-2标准蛋白的1∶3稀释梯度。G1孔中丢弃25μl。(sp185Her-2标准蛋白稀释示意图见说明书附图-
图1)2.加50μl反应液至空白孔。
3.加入＜50μl稀释的辣根过氧化酶联结的单克隆抗sp185Her-2抗体至所有含sp185Her-2标准蛋白的孔中，包括空白孔。
4.室温18-25℃孵育＞2小时。
5.配制超敏化学发光底物溶液。1∶1混匀发光原/增强剂和过氧化物溶液。
6.洗板三次。
7.加入＜100μl配制好的超敏化学发光底物溶液至所有含sp185Her-2标准蛋白的孔中，包括空白孔。1-5分钟后用96孔化学发光仪在大约425nm处测定相对光单位。
三、结果计算sp185Her-2超敏化学发光ELISA检测结果见说明书附图-表1sp185Her-2超敏化学发光ELISA标准曲线见说明书附图-图2检测线性范围0-10ng/ml(R2＝0.9999)最低检测限度40.15pg/ml。
权利要求
1.一种用超敏化学发光酶联免疫吸附法定量测定人Her-2/Neu癌基因可溶性产物sp185Her-2的方法，其特征是采用固相双位点夹心式酶联免疫吸附技术，用抗sp185Her-2单克隆抗体包埋小容量微孔后，样本中sp185Her-2结合在包埋抗体上；加入辣根过氧化酶(HRP)联结的单克隆抗sp185Her-2抗体后，它和已被第一抗体捕获的sp185Her-2结合；孵育后洗除未结合的抗sp185Her-2酶联结抗体；加入辣根过氧化酶超敏化学发光底物后；通过化学发光仪测定425nm处发光量来定量样本中sp185Her-2浓度。
2.一种在权利要求1下采用小容量96微孔酶标板，其特征是在不影响反应敏感性的前提下，减少了包埋抗体和其他反应试剂的使用量，加快了反应速度。
3.一种在权利要求1下采用超敏化学发光底物和化学发光仪，其特征是加宽了检测线性范围，使检测限度下移，提高了反应敏感性，减少了试剂的使用量。
全文摘要
本发明一种用超敏化学发光酶联免疫吸附定量测定人Her－2/Neu癌基因可溶性产物sp18文档编号G01N33/543GK1731188SQ20051005665
公开日2006年2月8日 申请日期2005年4月14日 优先权日2005年4月14日
发明者蔡枫 申请人:浙江亚克药业有限公司, 蔡枫