西他列汀及其中间体的酶-化学制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生化领域，具体设及一种西他列汀及其中间体的酶-化学制备方 法。
【背景技术】
[0002] 西他列汀憐酸盐（Sitagliptin地OS地ate)是2006年抑A批准上市的由默克公司 开发的第一个二肤基酶-IV(DPP-4)抑制剂，商品名为捷诺维（Januvia)，用于治疗II型糖 尿病，其单用或与二甲双脈、化格列酬合用都有明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好， 不良反应少。目前该药物已经在全世界60多个国家批准使用，2014年销售额已达40亿美 元，是名副其实的"重磅炸弹"药物。因而其高效的合成方法成为人们感兴趣的研究方向。
[0003]
[0004] 在西他列汀的合成路线中，手性（时-2, 4,5-Ξ氣苯基-β-氨基下酸及衍生物 (化合物I，化合物II)是制备西他列汀的关键中间体。 阳0化]
[0006] 美国专利US6699871公开了采用手性源诱导出手性的α-氨基酸后经过重氮化反 应产生β-氨基酸来构建所需的手性中屯、的方法。但是该方法存在原料价格昂贵、反应步 骤长、过程繁琐、总收率低等不利于产业化生产的缺点。
[0007] 世界专利W02004087650公开了默克公司关于西他列汀的合成路线，利用手性钉 催化剂对β-酬酸醋进行不对称氨化构建手性β-径基酸醋，然后将手性-β-径基酸醋转 化成手性β-氨基酸醋。该方法存在催化剂价格昂贵、需使用高压条件、立体选择性不高等 缺点。
[0008] 中国专利CN105018440公开了一种新的重组转氨酶及其在合成西他列汀中间体 中的应用，利用该转氨酶将β-幾基簇酸甲醋一步转换为手性β-氨基簇酸甲醋中间体，然 后经Boc保护、皂化、缩合、脱保护等步骤合成西他列汀。该方法相对于前述方法有明显的 进步，但是也存在反应步骤多、操作繁琐等问题。
[0009] 由此可见，目前报道的手性（时-2, 4,5-Ξ氣苯基-β-氨基下酸及其衍生化合 物的制备方法尚存在各自的不足，需要更多的探索W满足工业化生产的需求。（时-3-氨 基-4-(2, 4, 5-Ξ氣苯基）下酸是上述化合物的一种，用于在西他列汀合成过程中，具有合 成路径短、操作简便等优势。目前该化合物的生物合成方法，尤其是利用氨基酸脱氨酶合成 的方法还未见报道。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种西他列汀及其中间体的 酶-化学制备方法。
[0011] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 阳01引一种佩-3-氨基-4-(2, 4, 5-S氣苯基）下酸的酶法制备方法，其特征在于：3-幾 基-4-(2,4, 5-Ξ氣苯基）下酸，D-氨基酸脱氨酶，辅因子，氨基供体，辅因子催化循环酶， 助溶剂和缓冲液按一定比例混合反应得到产物（时-3-氨基-4-(2,4, 5-Ξ氣苯基）下酸， 可由W下反应式表示：
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[0014] 进一步说，该酶催化反应所用辅因子催化循环酶为甲酸脱氨酶。
[0015] 进一步说，该酶催化反应所用的D-氨基酸脱氨酶值-AA畑）和甲酸脱氨酶（抑H) 为选自尚科生物医药（上海）有限公司公开销售的D-氨基酸脱氨酶值-AADH)和甲酸脱氨 酶（抑H)酶粉。
[0016] 进一步说，该酶催化反应所用辅因子为选自NAD、NADH、NADP或NADPH，其中优选为 NAD。
[0017] 进一步说，该酶催化反应所用助溶剂为DMS0、异丙醇、乙酸乙醋或THF，其中优选 为DMS0。
[0018] 进一步说，该酶催化反应所用氨基供体为无机锭盐，其中优选为甲酸锭。
[0019] 进一步说，该酶催化反应所用缓冲液选自憐酸盐缓冲液或Ξ乙醇胺缓冲液，其中 优选为憐酸钟缓冲液。
[0020] 进一步说，该酶催化反应所用3-幾基-4-(2, 4, 5-Ξ氣苯基）下酸浓度为10~ 800mmol/l、D-氨基酸脱氨酶粗酶浓度1~50g/l、甲酸脱氨酶粗酶浓度1~50g/l，辅因子 浓度为0.Ol-lg/L甲酸锭浓度为lO-lOOg/L二甲亚讽浓度为5%~20%、缓冲液的浓度为 0. 05 ~0.Imol/Lo
[0021] 进一步说，该酶催化反应在地二6~9、温度为20~55Γ下进行，其中优选为地 =7.5、溫度为30°(：下进行。
[0022] 进一步说，该酶催化反应时间为6~48小时，利用HPLC检测反应进程，待转化率 达到95-99%时，调节抑至2. 0-3. 0后过滤，在滤液中加入乙酸乙醋进行多次萃取，旋转蒸 发去除溶剂，即得产品（时-3-氨基-4-(2,4, 5-Ξ氣苯基）下酸。
[002引本发明还公开了合成西他列汀的酶-化学制备方法，包括W下步骤：曰）使用D-氨 基酸脱氨酶的方法催化转化3-幾基-4-(2,4, 5-Ξ氣苯基）下酸（ΠΙ)得到佩-3-氨 基-4-(2,4,5-^氣苯基）下酸（1);6)佩-3-氨基-4-(2,4,5-^氣苯基）下酸（1)在 碱性条件下与度oc)20反应得到（R)-N-叔下氧幾基-3-氨基-4-(2,4,5-Ξ氣苯基）下 酸αI);c)(R)-N-叔下氧幾基-3-氨基-4-(2,4,5-Ξ氣苯基）下酸αI)与3-(Ξ氣甲 基）-5, 6, 7, 8-四氨-[1，2, 4]Ξ挫并[4, 3-a]化嗦盐酸盐（IV)在缩合剂及缚酸剂作用 下发生缩合反应生成7-[(时-3-(叔下氧幾基氨基）-1-氧代-4-(2, 4, 5-Ξ氣苯基）下 基]-5,6,7,8-四氨-3-(^氣甲基）-1，2,4-^挫[4,3-曰]化挫（￥);(1)7-[佩-3-(叔 下氧幾基氨基）-1-氧代-4-(2, 4, 5-Ξ氣苯基）下基]-5, 6, 7, 8-四氨-3-(Ξ氣 甲基）-1，2,4-Ξ挫[4,3-a]化挫（V)在酸性条件下有机溶剂中反应得到西他列汀 (Sitagliptin)，具体反应路线如下：
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[0025] 进一步说，步骤a)的条件如前所述；步骤b)中所用碱为无机碱或有机碱，所用溶 剂为有机溶剂和水的混合溶剂；步骤C)中缩合剂为0-苯并Ξ氮挫-N，N，Ν'，Ν'-四甲基脈 四氣棚酸、Ν，Ν-二环己基碳二亚胺或同时使用1-径基苯并Ξ挫和1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酷二亚胺盐酸盐为缩合剂；缚酸剂为Ξ乙胺、Ν，Ν-二异丙基乙胺或2, 6-二甲基化 晚；所用溶剂为选自DMF、二氯甲烧、二氧六环、四氨巧喃，其中优选为二氯甲烧；步骤d)中 酸性条件为盐酸，其中所用有机溶剂为选自甲醇、甲苯、乙酸乙醋、四氨巧喃、丙酬、异丙酸， 其中优选为甲醇。
[00%] 进一步说，步骤b)中所用碱为氨氧化钢、氨氧化钟、碳酸钢、Ξ乙胺、N，N-二异丙 基乙胺，其中优选为立乙胺；所用有机溶剂为四氨巧喃、乙酸乙醋、甲苯、异丙醇、丙酬、乙醇 或乙腊，其中优选反应溶剂为四氨巧喃；反应溫度为0~60°C，优选为25°C;化合物（I)与 度oc)2〇的摩尔比为1:1. 5。 阳027] 进一步说，步骤C)中化合物（II):化合物（IV):缩合剂：缚酸剂的摩尔比为 1: (1~1. 5) : (1~2) : (1. 5~4)，其中优选为1 :1 :1. 2 :3 ;反应溫度为室溫。
[0028] 进一步说步骤d)是在氯化氨的异丙