小孢根霉须状变种zjph1308及在制备西他列汀中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种西他列汀中间体的制备，特别涉及一株新菌株一小孢根霉须状 变种（Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)ZJPH1308,及其在微生物催化不对 称合成西他列汀手性中间体（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢-[1，2,4]三唑并 [4, 3-a]吡嗪-7- (8H)-基]-4- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 西他列汀（Sitagliptin，商品名Januvia? )，化学名称为（3R)-3-氨基-1-[3-(三 氟甲基）-5, 6, 7, 8-四氢-1，2, 4-三唑并[4, 3-a]吡嗪-7-基]-4-(2, 4, 5-三氟苯基） 丁-1-酮，是Merck Sharp&Dohme Ltd.公司开发的首个二肽基肽酶-4(DPP_4)抑制剂， 用于治疗II型糖尿病。该药物在II型糖尿病患者体内具有保护胰岛β细胞、减缓降血 糖素类激素的活性抑制、调节血糖等功能，于2006年10月17日经美国食品药品管理局 (FDA)批准上市。（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢-[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7- (8H)-基]-4- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮是合成西他列汀药物的重要手性中间体， 其化学结构式为：
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[0004] 目前，文献报道的生物催化合成（S)-3_羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6_二 氢-[1，2,4]三唑并[4,3-&]吡嗪-7-(8!1)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基）丁-1-酮的方法仅 见桑吉夫·库马尔?门迪拉塔等（Mendirata S K, Pandey B, Joshi R，et al. Process for preparing an intermediate of Sitagliptin via enzymatic conversion:U. S. Patent Application 13/823, 300[P]· 2011-10-10.)报道的酶促不对称还原 4-氧-4-[3-(三氟 甲基）-5,6-二氢-[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)_ 基]-1-(2,4,5-三氟苯基） 丁-2-酮制备（S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢-[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡 嗪-7-(8H)-基]-4-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-1-酮。他们通过共表达氧化还原酶和葡萄糖脱 氢酶的工程菌全细胞催化不对称合成（S) -3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢-[1，2, 4] 三唑并[4, 3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-1-酮，反应时间为25~30h， 产率为72 %，e. e.值>99 %，反应式如下：
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(三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一株新菌株一小孢根霉须状变种（Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis)ZJPH1308,及其在微生物催化不对称合成（S)_3_羟基-1-[3_(三 氟甲基）-5,6_二氢-[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)_基]-4-(2,4,5-三氟苯基） 丁 -1-酮中的应用，建立了高立体选择性生物催化法制备西他列汀手性中间体的新方法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一株新菌株一小孢根霉须状变种（Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis)ZJPH1308,保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO :M 2014645,保藏日期为2014年12月14日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
[0009] 菌种来源：小孢根霉须状变种ZJPH1308由采自浙江省杭州市浙江工业大学朝晖 校区土壤中分离筛选获得，经如下流程筛选获得目的菌株：
[0010] 土样采集一平板培养一菌种分离一斜面培养一种子培养一发酵培养一生物转化 反应一液相色谱检测产物一获得目的菌株ZJPH1308。
[0011] 本发明小孢根霉须状变种ZJPHl308特征如下：
[0012] 菌落形态：在含PDA培养基的平板上，30°C培养3d后，菌丝体初期呈白色絮状，渐 呈灰黑色，孢子囊为浅灰色，成熟后变为棕色，延伸至平板边缘，菌落背面呈米黄色。
[0013] 细胞形态：孢子囊光滑，球状，浅灰色，成熟后呈棕色，53. 2~92. 4X54. 6~ 86. 8 μ m。最小直径为36 μ m，最大的为105 μ m。囊轴壁光滑，呈梨形，球形或近球形。孢子 梗有隔膜，有的有少量假根，有的没有假根，假根为棕色，颜色逐渐变浅。
[0014] 菌种的ITS序列特性：采用通用引物ITSl和ITS4,对ZJPH1308菌株rDNA的ITS 区进行扩增，产生一个大小为672bp的DNA片段，对上述PCR扩增产物进行序列测定。经测 定，所述小孢根霉须状变种ZJPH1308的真菌核糖体ITS (Internal Transcribed Spacer) 基因序列（SEQ ID NO. I)如下：
[0015] CCTGCGGAAGGATCATTAACTAATGTATTGGCACTTTACTGGGATTTACTTCTCAGTATTGTTTGCTTC TATACTGTGAACCTCTGGCGATGAAGGTCGTAACTGACCTTCGGGAGAGACTCAGGACATATAGGCTATAATGGGTA GGCCTGTTCTGGGGTTTGATCGATGCCAATCAGGATTACCTTTCTTCCTTTGGGAAGGAAGGTGCCTGGTACCCTTT ACCATATACCATGAATTCAGAATTGAAAGTATAATATAATAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATC GATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTG CACTCTATGGATCTTCTATAGAGTACGCTTGCTTCAGTATCATAACCAACCCACACATAAAATTTATTTTATGTGGT GATGGACAAGCTCGGTTAAATTTAATTATTATACCGATTGTCTAAAATACAGCCTCTTTGTAATTTTCATTAAATTA CGAACTACCTAGCCATCGTGCTTTTTTGGTCCAACCAAAAAACATATAATCTAGGGGTTCTGCTAGCCAGCAGATAT TTTAATGATCTTTAACTATGATCTGAAGTCAAGTGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAo
[0016] 将 ZJPH1308 菌株的 ITS 序列在 NCBI 网站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov) 上进行同源性比对分析。结果表明：ZJPH1308菌株与Rhizopus microsporus var. Rhizopodiformis KJ417564. 1的同源性达到100%。综上所述结果，该菌种被鉴定为小孢 根霉须状变种（Rhizopus microsporus var. Rhizopodiformis)，命名为小抱根霉须状变种 ZJPH1308。
[0017] 通过响应面实验设计优化，得到菌株ZJPH1308较佳的培养基组成为：糊精12. 5~ 25. Og/L，牛肉膏10. 0~35. Og/L，硫酸铵L 5~6. Og/L，氯化钙0· 1~0· 5g/L，氯化钠 0. 1~0. 3g/L，氯化钴0. 025~0. 05g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6. 0 ;优选培养基组成为糊精 25. Og/L，牛肉膏30.0 g/L，硫酸铵5. Og/L，氯化钙0. 4g/L，氯化钠0. 3g/L，氯化钴0. 05g/L， 溶剂为蒸馏水，pH 6. 0。
[0018] 摇瓶培养条件为：初始pH值5. 5~7. 5,体积接种量1 %~11 %，装液量70mL~ 120mL/250mL摇瓶，发酵时间20~24h。
[0019] 本发明涉及的ZJPHl308菌株通过以下步骤筛选得到：
[0020] 1)平板分离培养：
[0021] 取Ig 土样分别稀释至KT3和10 Λ取I UL接种至以底物4-氧-4-[3-(三氟 甲基）-5,6_ 二氢-[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8Η)_ 基]-1-(2,4,5-三氟苯基） 丁 -2-酮为唯一碳源的平板分离培养基，30°C培养7d，之后挑取单菌落转接斜面培养基。平 板分离培养基配方如下：4_氧-4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢-[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡 嗪-7- (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮10mm〇l/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾Ig/ L，氯化钠0. 3g/L，琼脂20g/L，以蒸馏水配制，pH 6. 0。
[0022] 2)斜面培养（PDA培养基）：
[0023] 马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。接种斜面后， 在30°C培养2~3d，4°C冰箱保存。
[0024] 3)种子培养：
[0025] 将培养成熟的斜面菌种接入装有IOOmL种子培养基的250mL摇瓶中，30°C， 200rpm，培养17~24h，种子培养基配方如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27. 5g/L，硫酸铵3g/L， 磷酸二氢钾lg/L，氯化钠0. 3g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6. 0。
[0026] 4)发酵培养：
[0027] 以体积浓度1 %~11 %的接种量将种子液接种至装有IOOmL发酵培养基的250mL 摇瓶中，30°C，200rpm，培养20~24h，培养结束后，离心，收集湿菌体；发酵培养基配方如 下：糊精25. 0g/L，牛肉膏30. 0g/L，硫酸铵5. 0g/L，氯化钙0. 4g/L，氯化钠0. 3g/L，氯化钴 0· 05g/L，以蒸馏水配制，pH值6. 0。
[0028] 5)生物转化过程：
[0029] 将离心所得湿菌体重悬于蒸馏水或磷酸盐缓冲液（pH值为6. 0)中，加 入一定量的4-氧-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢-[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7- (8H)-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮底物和辅助底物甘油，置30 °C摇床反应一 定时间。反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取，离心后所得上清液采用液相色谱分析。
[0030] 6)分析检测：
[0031] 反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析，用外标法定量。液相 色谱条件：安捷伦1200液相色谱仪，安捷伦液相色谱工作站；色谱柱为Daicel公司多糖衍 生物类手性色谱柱Chiralpak ID(250mmX4.6mm，5ym);流动相：V(正己烧）：V(异丙醇） =65:35 ;流速0. 8mL/min ;柱温30°C ;检测波长269nm。根据液相色谱检测谱图，通过产物 标准曲线计算出反应液中的产物浓度，进而计算出产率和产物e. e.值。
[0032] 小孢根霉须状变种ZJPH1308菌株生物还原反应产率（Yield)计算式为：
[0033] Yield (%) = -^x 100% 公式（1) Co
[0034] 公式（1)中Cp C。分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓 度。
[0035] 产物的光学纯度由对映体过量值（enantiomeric excess，e. e.)表征^
[0036] e.e.= ：'xl()()% 公式（2) Cs + Cr
[0037] 公式⑵中：(；和C κ分别为（S)-3_羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二 氢-[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7-(8H)_ 基]-4-(2, 4, 5-三氟苯基）丁 -1-酮 和（R)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢-[1，2,4]三唑并[4