专利名称：用于通过酶促转化制备西他列汀的中间体的方法
技术领域：
本发明涉及用于制备3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)_基)-4-(2，4，5_三氟苯基)丁 _1_酮的酶促还原方法。特别地，本发明涉及用于制备(S)或(R)-3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[I，2，4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7 (8H)_基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮的立体选择性酶促还原方法。本发明提供了具有相关氧化还原酶活性的多肽的氨基酸序列。此外，本发明提供了编码具有氧化还原酶活性之多肽的多核苷酸序列。本发明还公开了通过基于底物或基于酶之系统的辅因子再生系统从而在目标酶促还原过程中再生辅因子。
背景技术：
下式(I)的3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6_ 二氢-[1，2，4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7 (8H)-基)-4- (2,4, 5-三氟苯基)丁 _1_ 酮，
权利要求
1.一种用于制备式(I)的化合物
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶是氧化还原酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶是酮还原酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶是短链脱氢酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶是醇脱氢酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶是醛酮还原酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶分离自酵母(saccharomyces)、红酵母(rhodotorula)、毕赤酵母(pichia)和大肠杆菌(E.coli)。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述合适的酶分离自选自酿酒酵母(saccharomyces cervisiae)、深红酵母(rhodotorula rubra)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)和大肠杆菌的物种。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合适的酶选自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列 Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 IdN0.9、序列Id N0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示的核苷酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶具有选自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列 Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 IdN0.9、序列Id N0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示核苷酸序列的核苷酸序列或其变体，所述核苷酸序列或其变体被克隆于载体中并且随后表达于合适的重组全细胞中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重组全细胞还共表达具有由氧化型NAD(P)再生辅因子之潜力的多肽。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述全细胞选自:MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述全细胞包含表达载体，所述表达载体包含: a)至少一个控制所述载体在宿主细胞内复制和保持的区域； b)第一启动子，其与编码所述氧化还原酶的选自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 Id N0.9、序列 IdN0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示核苷酸序列的核苷酸序列或其变体有效连接； c)第二启动子，其与编码具有再生辅因子潜力之多肽的序列idno7所示核苷酸序列有效连接； d)合适的抗生素标记。
14.一种用于制备式⑴的合适中间体
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述全细胞选自:MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654。
16.根据权利要求1所述的方法，其中通过基于酶的再生系统连续再生辅因子，其中所述酶氧化合适的共底物以再生辅因子。
17.根据权利要求1或16所述的方法，其中辅因子再生中所使用的所述酶选自:葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、亚磷酸脱氢酶。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中辅因子再生中所使用的所述酶是序列IdN0.7或其变体所示葡萄糖脱氢酶。
19.根据权利要求1所述的方法，其中通过基于底物的辅因子再生系统连续再生辅因子，其中所述酶氧化合适的共底物以再生辅因子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述酶选自:氧化还原酶、酮还原酶、短链脱氢酶、醇脱氢酶和醛酮还原酶。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述共底物是异丙醇。
22.根据权利要求1和14所述的方法，其中式(III)的浓度选自0.1%至30% w/Vo
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述辅因子是NAD(P) H和NAD (P)。
24.根据权利要求2所述的方法，其中pH维持在5至9，优选7至8。
25.一种用于表达手性醇的载体，其包含: a.至少一个控制复制的区域； b.合适的启动子，其与选自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列Id N0.3、序列Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 Id N0.9、序列 Id N0.10、序列 Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示的期望核苷酸序列或其变体有效连接； c.抗生素标记。
26.根据权利要求25所述的载体，其还包含序列IdN0.7的多核苷酸序列或其变体。
27.根据权利要求23所述的载体，其表达氧化还原酶，所述载体是pETllaZBG5.1.1、pETllaZBG6.4.l、pETllaZBG2.0.1.pETllaZBG25.1.l、pETllaZBG8.1.l、pETllaZBG13.1.1，pET27bZBG5.1.1、pET27bZBG2.0.1、pET27bZBG8.1.1、pET27bZBG2.0.9、pET27bZBG13.1.1、pET27bZBG2.0.8、pET27bZBG2.0.ll、pET27bZBG2.0.5、pET27bZBGl.1.22、pET27bZBGl.1.2、pET27bZBG2.0.4。
28.根据权利要求31所述的载体，其表达氧化还原酶，所述载体是pET27bZBG2.0.9。
29.根据权利要求23所述的载体，其表达葡萄糖脱氢酶，所述载体是pET27bZBG13.1.1。
30.根据权利要求23所述的载体，其共表达氧化还原酶和葡萄糖脱氢酶，所述载体是PZRC2G-2ZBG2.0.9C1。
31.下式的化合物
32.一种用于制备式(II)化合物的方法，其包括: (a)使式(Ib)的(S)-3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[I，2，4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7 (8H)-基)-4- (2,4, 5-三氟苯基)丁 +酮
全文摘要
本发明提供了用于制备成为外消旋形式(R/S)或其任意光学活性(S)或(R)形式或者任意所述形式之对映体过量混合物的3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮(式I)的方法，其包括a)在合适条件和辅因子的存在下，使式(III)4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氢[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁-2-酮与合适的氧化还原酶或其合适变体反应；b)分离成为外消旋形式(R/S)或其任意光学活性(S)或(R)形式或者任意所述形式之对映体过量混合物的3-羟基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氢-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮。
文档编号C12P17/18GK103228658SQ201180042086
公开日2013年7月31日 申请日期2011年10月10日 优先权日2010年10月8日
发明者桑吉夫·库马尔·门迪拉塔, 比平·潘迪, 茹帕尔·乔希, 乌曼·特里维迪, 马扬克·G·达弗, 希曼舒·M·科塔里, 巴温·舒克拉 申请人:卡迪拉保健有限公司