一种转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种转氨酶，含有该酶编码基因的重组 表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及该转氨酶作为催 化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是由于胰岛素分泌改变，导致胰岛素缺乏及作用减弱，或者胰岛素活性降 低，或者在两者共同影响下，出现的代谢性疾病，以高血糖为特征，并同时伴有蛋白质、糖 及脂肪的代谢紊乱。糖尿病及其并发症对人类健康的危害程度居心血管疾病、肿瘤之后的 第三位，成为危害人类健康的重要疾病。国际糖尿病联合会预计，到2030年，患病总人数 将超过4. 35亿人。而我国已成为世界糖尿病患病率增长速度最快的国家之一，目前约有 4000万糖尿病患者，人数仅次于印度，居世界第二位。在糖尿病的四种类型中，II型糖尿 病占90%以上，多见于30岁以上的中老年人，病因主要是由于机体对胰岛素不敏感。在 临床上治疗II型糖尿病的药物中，磺酰脲类胰岛素分泌促进剂、双胍类胰岛素敏感性增强 剂、α -葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂、非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂等 虽然降糖作用较为理想，但均有一定的副作用影响患者坚持用药，达不到较好的血糖控制 效果。西他列汀磷酸盐（Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批准上市的第一个二肽 基酶-IV(DPP-4)抑制剂，用于治疗II型糖尿病，其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有 明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反应少。它主要通过抑制DPP-4对胰高血 糖素样肽-I(GLP-I)和糖依赖性胰岛素释放肽（GIP)的降解以达到治疗的目的，轻度增加 GLP-I含量并减弱GLP-I代谢物的拮抗作用，所以在有效发挥降糖作用的同时不会引起因 GLP-I含量过高而引起的恶心呕吐等副作用；同时，GIP促进胰岛素分泌具有血糖依赖性， 故能大大降低口服降糖药导致的低血糖副作用的发生率。西他列汀磷酸盐由默克公司开 发，于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物， 商品名为捷诺维（Januvia)，目前已经在全世界60多个国家批准使用，2012年销售额已达 40. 86亿美元，同比增长23%。因此，西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的"重 磅炸弹"。
[0003] 西他列汀合成中的关键步骤是手性氨基中间体的构建。美国专利US6699871公开 了一种西他列汀的合成方法，采用手性源来诱导出手性的α -氨基酸，而后通过重氮化反 应产生β-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻 烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。
[0004]
[0005] 国际专利W02004087650公开了默克公司关于西他列汀的合成路线，利用手性钌 催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要 用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52%，工艺中用到高压氢气，立体 选择性也不高。
[0007] 国际专利W02005003135公开了默克公司开发的西他列汀的合成方法，以S-苯甘 氨酰胺作为手性助剂来诱导催化氢化而合成手性胺。该路线需要两次催化氢化，第一次所 用的钼催化剂价格昂贵，第二次脱保护时需要用大量的Pd(OH) 2-C催化剂，成本较高，ee值 为96 %，需要进一步重结晶。
[0008]
[0009] 国际专利W02007050485公开了默克公司关于西他列汀的合成方法，采用了手性 铑催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84%，ee值94%，但该方法需要用 昂贵的铑手性催化剂，去除与回收也较为困难。
[0011] 美国专利US8293507公开了 Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的 生物催化剂代替上述工艺中的铑催化剂，转氨化产物ee值达到99 %，底物投料100g/L。但 是由于底物水溶性差，需要添加高达50%的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO 的溶剂残余较高，回收困难，成本较高。
[0012] 中国专利CN102838511公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采 用格式试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成β -羟基 酸，该方法总收率仅40 %，而且由于采用剧毒氰化物，应用受限。
[0013]
[0014] 中国专利CN102485718公开了浙江海翔药业关于西他列汀合成的路线，通过采用 甲硫氨酸作为手性源进行合成，但是产率仅14%，即使以2, 4, 5-三氟溴苯计也仅55%。
[0016] 中国专利CN103014081公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰基-4-(2, 4, 5-三 氟苯基）-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯，但是并没有公开 具体转氨酶的序列以及克隆方法。
【发明内容】
[0017] 针对已报道的不对称合成西他列汀及其中间体的反应中产率偏低、立体选择性 不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，本发明提供了一种催化活性高、对映选择性 强、底物耐受性与溶剂耐受性好的转氨酶进行酶催化合成R-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯 基）_ 丁酸甲酯，进而进一步合成西他列汀的酶-化学合成方法。还提供了该转氨酶的基 因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该转氨酶在催化 羰基底物不对称转氨合成西他列汀中间体中的用途。
[0018] 本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
[0019] 本发明的第一方面提供了一种分离的蛋白质，其是如下（a)或（b)的蛋白质：
[0020] (a)由SEQ ID No :2、4、6、8或10所示氨基酸序列组成的蛋白质；
[0021] (b)在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有 转氨酶活性的由（a)衍生的并和（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白质，特别是 下文中所提到的那些氨基酸取代。
[0022] SEQ ID No :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质来源于分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR_l，具有转氨酶的功能，是一种新的转氨酶。
[0023] SEQ ID No :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从分支杆菌PYR-I中分离获 得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。
[0024] 两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得 至1J，优选采用NCBI Blastp和Blastn软件根据默认参数计算得到。
[0025] SEQ ID No :2所示的转氨酶和节杆菌来源的ATA117之间的氨基酸序列同一性为 52%。本发明中氨基酸序列如SEQ ID No :2所示的转氨酶与已知转氨酶的氨基酸序列的同 一'I"生低于70%，具有显著差异性。
[0026] 蛋白质（b)是在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且 具有转氨酶活性的由（a)衍生的并和（a)的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白质。其 中，所述的"几个"是指2个至小于100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加 一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有转氨酶活性。也就是 说，只要由（a)衍生的蛋白质具有转氨酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的 发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No :2所示氨基酸序列的蛋白质（a)分子中进行4、10、 15、20个氨基酸残基的突变得到SEQ ID N〇:4、6、8、10所示氨基酸序列的蛋白质，也属于蛋 白质（b);或将SEQ ID N〇:2、4、6、8、10进行组合，或进行1-20个氨基酸残基的突变，也可 获得上述蛋白质（b)，但仍然保持转氨酶活性。
[0027] 在筛选获得SEQ ID No :2所示野生型转氨酶的基础上，发明人还对野生型酶进行 了改造，将活性中心一些位点的氨基酸残基突变为其他的氨基酸残基，以进一步强化该酶 的催化性能。所述的活性中心定义为底物结合位点附近大约丨0-!2.4的球形空间。
[0028] 优选地，（b)蛋白质是在（a)的氨基酸序列的第56、68、69、72、76、96、129、131、 143、157、206、216、222、230、243、276、289、291、295、304 位氨基酸残基中的一位或多位经过 取代且具有转氨酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
[0029] 在一个特定的实施方案中，SEQ ID No : 2所述的氨基酸序列的第72位的亮氨酸取 代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第129位的苯丙氨酸取代为缬氨酸，以及第 291位的丙氨酸取代为甘氨酸所得的SEQ ID No :4所示氨基酸序列组成的蛋白质对底物具 有一定的活性。
[0030] 在一个特定的实施方案中，SEQ ID No :2所述的氨基酸序列的第69位的组氨酸取 代为亮氨酸，第72位的亮氨酸取代为半胱氨酸，第76位的缬氨酸取代为丙氨酸，第129位 的苯丙氨酸取代为缬氨酸，第143位的甘氨酸取代为异亮氨酸，第206位的丝氨酸取代为缬 氨酸，第216位的苏氨酸取代为异亮氨酸，第230位的脯氨酸取代为丙氨酸，第289位的苏 氨酸取代为丙氨酸，以及第291位的丙氨酸取代为甘氨酸所得的SEQ ID No :6所示氨基酸 序列组成的蛋白质对底物的活性有了很大的提高。
[0031] 在一个特定的实施方案中，SE