步骤：在pH7. 0~10. 0的乙醇水溶液中，在异丙胺和磷酸 吡哆醛（PLP)的存在下，在本发明所述的转氨酶或重组转氨酶的催化下，前手性羰基化合 物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。
[0060] 其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为1~800mmol/L。本发明 的转氨酶用量为催化有效量，较佳地为〇. 1~50g/L。异丙胺的用量较佳地为1~60g/L。 额外加入的PLP的用量较佳地为0~1.0 mmol/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只 要其pH范围在7. 0~10. 0即可，优选磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲 液的浓度较佳地为〇. 05~0. lmol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述 的乙醇浓度较佳地为5 %~50 %。所述的不对称转氨反应较佳地是在振荡或搅拌条件下进 行。所述的不对称转氨反应的温度较佳地为20~55°C。所述的不对称转氨反应的时间较 佳地以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为准。不对称转氨反应结束后，可按本领 域常规方法从反应液中提取手性胺产物。
[0061] 本发明中，使用粗酶液做催化剂，较佳地应添加 PLP辅酶。如果用静息细胞做催化 剂则不需要加 PLP辅酶，只需利用细胞内所含有的PLP辅酶即可。
[0062] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0063] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0064] 本发明的积极进步效果在于：针对已报道的不对称合成西他列汀及其中间体的反 应中产率偏低、立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，提供了提供了一 种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性与溶剂耐受性好的新的转氨酶进行酶催化合成 R-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯的方法。在催化浓度高达0. 8mol/L (200g/L) 底物时，产物的光学纯度仍高达99%以上。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得 的产物浓度高，产物光学纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于 工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0065] 图1分枝杆菌PYR-I转氨酶基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0066] 图2分枝杆菌PYR-I转氨酶重组表达转化体的菌落PCR图。M为分子量标准，A泳 道为E·coliDH5α/pET21a-MvAT，B泳道为E·coliBL21(DE3)/pET21a-MvAT。
[0067] 图3重组表达的分枝杆菌PYR-I转氨酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0068] M为分子量标准，A泳道为诱导前，B泳道为诱导后。
[0069] 图4转氨酶突变体文库1的琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为定点 突变得到的PCR片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。B泳道为突变片段使用基因克隆引物再次 PCR的产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0070] 图5转氨酶突变体文库2的琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为定点 突变得到的PCR片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。B泳道为突变片段使用基因克隆引物再次 PCR的产物的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0071] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0072] 下列实施例中的材料来源为：
[0073] 分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii) PYR-1的基因组DNA由美国阿拉巴马州 立大学的口腔医学院的Hui Wu博士提供。
[0074] 表达质粒pET21a，E·coliDH5α和E·coliBL21(DE3)感受态细胞，2XTaqPCR MasterMix,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0075] 实施例1分支杆菌PYR-I转氨酶基因的克隆
[0076] 根据Genbank收录的预测为分支杆菌PYR-1转氨酶的基因序列（NCBI登录号： YP_955297. 1)为依据，设计PCR引物如表1中基因克隆上游与下游引物。其中，上游引物下 划线部分为Nde I酶切位点，下游引物下划线部分为EcoR I酶切位点。
[0077] 以分支杆菌PYR-I基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：10 X KOD-Plus PCR buffer2yL，25mM MgS041.2yL，2mM dNTP2yL，K0D-Plus PCR高保真酶0.3yL，DNA模 板0. 5 μ L (含DNA模板0. 1 μ g)，ddH2013 μ L，以表1中基因克隆上游引物与基因克隆下游引 物（SEQIDNo:ll和12)各(λ5μL(10mmol/L)进行PCR扩增。PCR扩增步骤为 ：（l)95°C， 预变性 3min ;(2)98°C，变性 15s ;(3)55°C退火 30s ;(4)72°C延伸 Imin ;步骤（2)~⑷重 复30次；(5) 72°C继续延伸lOmin，冷却至4°C。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒回收900~1200bp区间的目标条带（见图1)，获得一条完整的分支 杆菌PYR-I转氨酶全长基因序列，经DNA测序，全长1014bp，命名为MvAT，其核苷酸序列与 编码的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID No :1和2所示。
[0078] 表1PCR引物表
[0080] 实施例2重组表达载体的构建
[0081] 将实施例1中所得的转氨酶基因 DNA片段在37°C用限制性内切酶NdeI和EcoRI 双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标 片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和EcoRI酶切后的质粒pET21a，在16°C下连 接过夜得到重组表达质粒pET21a-MvAT。
[0082] 实施例3重组表达转化体的制备
[0083] 将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌（E. coli)DH5a感受态细胞中，转化条件 45°C，热击90秒，在含有氨苄青霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌 落PCR验证阳性克隆（见图2中的A泳道）。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转 化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C倒 置培养过夜，即获得阳性重组转化体E. coli BL21 (DE3) /pET21a - ΜνΑΤ，菌落PCR验证阳性 克隆（见图2中的B泳道）。
[0084] 实施例4重组转氨酶的表达
[0085] 将实施例3所得的重组E. coli BL21 (DE3)，接种至含氨苄青霉素的LB培养基（蛋 白胨1(^凡，酵母膏58/1，似(：11(^/1，？!17.0)中，371：振荡培养过夜，按1%^八）的接种量 接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37°C、180rpm摇床振摇培养，当培养液的 0D600达到0. 6时，加入终浓度为0. 2mmol/L的IPTG作为诱导剂，35°C诱导12h后，将培养 液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于PH8. 5 的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组转氨酶的粗酶液。用Bradford 法测定蛋白浓度。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（见图3)，重组蛋白以部 分可溶的形式存在。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。
[0086] 实施例5重组转氨酶催化羰基底物的不对称转氨
[0087] 在50ml磷酸钠-异丙胺缓冲液（100mmol/L，pH7. 5)中加入实施例4制备的MvAT 的粗酶液至最终蛋白浓度为l〇g/L，加入终浓度为lOmmol/L的3-羰基-4-(2, 4, 5-三氟苯 基）_ 丁酸甲酯以及终浓度为lmmol/L的磷酸吡哆醛，加入2. 5ml乙醇，在20°C用注射器针 头插入底部进行氮气吹扫反应。反应至48小时后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次， 合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和转氨产物的ee值。未发现有 转氨产物生成。
[0088] 转化率测定方法为：反应液用乙腈稀释100倍，离心后取20 μ L在 Agilentl200HPLC上分析转化率，分析柱为Agilent Eclipse XAD-C18反相硅胶柱，流动 相为水：乙腈=40:60，另补加10臟〇1/1甲酸铵，流速为每分钟11^，检测波长为21011111和 260nm，转氨产物的保留时间为4. 6min，底物的保留时间为7. 4min。
[0089] 转氨产物的ee值测定方法为：在Agilentl200HPLC上检测产物的光学纯度e. e 值，采用Daicel Chiralpak AD-H手性色谱柱（4. 6 X 150mm)进行分析，流动相为乙醇：正 庚烷：二乙胺：水=60:40:0. 1:0. 1，流速为每分钟lmL，柱温为35°C，保留时间分别为：底 物 5. 6min，（S)-产物：7. 9min ; (R)-产物：9. 7min。检测波长为 210nm 和 260nm。
[0090] 实施例6转氨酶突变文库1的构建
[0091] 以实施例3中所构建质粒pET21a-MvAT为模板，进行PCR扩增。PCR体系为： 10XK0D-Plus PCR buffer2yL，25mM MgS041.2yL，2mM dNTP2yL，K0D-Plus PCR高保真