专利名称：黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的提纯方法
技术领域：
本发明涉及一种黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的提纯方法。具体地说，是利用化学改性的苯乙烯类大孔吸附树脂，特别是用一种溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂进行柱层析提纯化学合成法制备的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的方法。
背景技术：
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐(Flavine Adenine Dinucleotide Sodium，以下简称FAD)，化学名为1-(6-氨基-9H-嘌呤)-1-脱氧-β-D-呋喃-5-(2R，3S，4S)-5-(3，10-二氢-7，8-二甲基-2，4-二氧-10-苯并蝶呤联苯)-2，3，4-三羟基-二磷酸戊酯二钠盐，其分子结构式如下所示 FAD是维生素B2的体内磷酸化的活性物质，在体内构成各种黄酶的辅酶参与体内生物氧化过程，也可参与碳水化合物，蛋白，脂肪的代谢，维持正常的视觉功能，促进生长。此外FAD还可激活维生素B6，维持红细胞的完整性，当体内对缺乏时，机体的生物氧化过程受到影响，正常的代谢发生障碍，即可出现典型的维生素B2缺乏症状。
FAD的性状为黄色至淡黄褐色粉末，无气味或有轻微的特殊气味，味略苦。遇光、酸、碱或高温(约50℃以上)易分解。易溶于水，几乎不溶于甲醇、乙醇、甘油或乙醚。旋光度[aD20]＝-21.0～-25.5°。
合成FAD的方法主要有两类，即生物合成法和化学合成法。在生物合成法中，由于合成酶的专一性和有效性，付反应少，所得的FAD粗品中杂质成分较为简单，且与目标产物结构相差较大，提纯比较简单。但是生物合成法需要专用的设备、场地；酶催化合成法所需的专一性酶只有试验室技术，无商业化的酶可以购买，同时样品若处理不好，产品很容易酶解。而化学合成法对设备条件和场地无特殊要求，也无需特殊试剂，但合成收率不高，付反应多，杂质成分复杂且与目标产物结构相差较小，因此所得的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐粗品提纯较困难。同时，由于FAD的特殊性质易溶于水，遇光、遇酸、碱或加热时，极不稳定，易分解，这就更增加了分离纯化的难度。
此外，由于FAD具有磷酐键，常规的柱层析条件，如硅胶、酸性Al2O3、硅藻土等对其有较强的吸附作用，有的甚至相互结合生成新的化合物，故分离纯化FAD非常困难。
在以往报道的研究中，日本专利公报JP昭43-25507、JP昭46-29878和JP昭48-86898是通过苯酚甲醛离子交换树脂分离，获得FAD纯度约为80～89％。但该方法上样条件必须为强碱性，采用薄层色谱检测，流出样品较纯，但极不稳定，在浓缩脱溶过程中样品几乎已经分解；在JP昭34-3233、JP昭34-2226专利和Achester Deluca等在文献(J.Biol.Chem，223，569-76，1956)中是以粉末状纤维素为分离介质的柱层析方法，获得FAD纯度约90％；在欧洲专利EP1171244中是通过强碱性阴离子交换树脂精制，获得的FAD纯度约90％，但该结果难以重复。因为对强碱性阴离子交换树脂而言，最有效的分离必须在某一特定的pH条件下进行，一般采用酸性条件下上柱，但FAD在酸性条件下极易分解而引入了新的杂质，所以该方法存在一定的缺陷；而在日本专利JP昭51-1495中，是以水不溶性O-[N-(1-羰基-4-胍丁基)氨基甲酰]多糖为分离介质进行柱层析，获得FAD的纯度约98％。该发明条件温和，但水不溶性单体O-[N-(1-羰基-4-胍丁基)氨基甲酰]多糖本身的聚合方法相当专一，不易控制，也无法购买到商品。由于聚合物单体技术不成熟导致分离效果的不稳定，该技术难以工业化。另外，在日本专利JP昭51-127097中，利用以聚苯乙烯为母体的非离子交换性的多孔吸附树脂接触，并用水来进行洗涤提纯，纯度约98％。但粗品是发酵得到的FAD溶液，样品本身杂质成分较为简单，杂质成分相对来说易于与产品分离。在重复该实验时，我们采用化学合成所得的样品上样，含量测定采用HPLC法(日本药局方第十四改正版476页)时发现，含量只有84～89％，远远达不到98％。这其中可能有两方面原因样品本身来源不同和该方法分离选择性差。另外该专利申请的年代较久，当时的分析技术可能不专一，采用的是紫外分光光度法(UV法)，但是黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐、黄素单核苷酸钠和维生素B2三者的紫外吸收情况基本相同，均在260nm、450nm处有最大吸收，同时为了避免溶剂和环境等因素的干扰，一般选用450nm处作为含量测定的波长，这样就不可避免的使测定的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐含量偏高。因此其紫外分光光度法(UV法)的分离效果值得怀疑，目前日本药局方第十四改正版FAD的含量测定方法采用的是HPLC法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新颖的FAD提纯方法，可很好地解决FAD，特别是化学合成法制备的FAD的纯化问题，可以得到纯度较高的FAD。
本发明采用一种利用化学改性的苯乙烯类大孔吸附树脂，特别是用一种溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂进行柱层析，来分离提纯FAD，特别是采用化学合成法制备的FAD粗品。因为采用化学合成法制备的FAD杂质成分更复杂，更不易纯化，因此本发明的方法也适用于生物合成法制得的FAD的纯化。
本发明所述的柱层析方法，上样可以采用水法上柱，也可以采用干法上柱。其洗脱剂是先用极性较小的混合溶剂体系洗脱杂质成分后，再用极性较大的混合溶剂体系或纯水洗脱产品。纯品流出液的含量约为0.05‰～0.1‰，这种极稀的纯品流出液经冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用少量的水溶解，再次进行冷冻干燥，即得到FAD纯品，采用HPLC法(日本药局方第十四改正版476页)测定，含量可达92～99％。
其中，所述洗脱剂中的有机溶剂是醇类或酮类溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮、丁酮等，优选乙醇。
所述极性较小的混合溶剂，其有机溶剂和水的体积比为20∶1-10∶1，优选19∶1，如95％乙醇。
所述极性较大的混合溶剂，其有机溶剂和水的体积比为5∶1-1∶10，优选4∶1。
在本发明中，洗脱时的流速为3～4个柱床体积。
本发明所述的溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂，国内外均有商品出售，如日本三菱化学株式会社生产的Sepabeads SP207。
该树脂可以在较宽的pH条件下工作，对于中性条件下上样也有很好的分离效果。更为可喜的是对于分离化学合成法制备的FAD粗品，只需一次上柱，进行一次柱层析分离就可以达到纯化的目的。避免了离子交换树脂的酸碱条件下对样品造成的分解以及需多根不同性质的柱连用的技术缺陷，同时也避免了用离子交换树脂分离样品时，由于FAD水溶性相当好，纯化后的样品往往与无机盐难以分离的技术缺陷。对于使用过的树脂，只需用5％氢氧化钠溶液洗至无色，再用纯水洗至中性后便可反复使用。
本发明的方法操作简便，适于工业化大生产。
图1是实施例5所得产品含量测定的HPLC图谱图2是对比实施例所得产品含量测定得HPLC图谱具体实施例通过下述实施将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容，仅对本发明作进一步的阐述。
实施实例1树脂的预处理在Φ30×600mm的层析柱中，加入由500ml无水乙醇和350mlSP-207组成的悬浮液，用1500ml无水乙醇洗脱到流出液无色无异味，流出液用去离子水稀释后仍澄清透明，然后用丙酮1500ml洗脱树脂，再用3000ml丙酮∶水＝5∶5(v/v)洗脱树脂，最后用3000ml乙醇∶水＝5∶5(v/v)洗脱树脂；倒出大孔吸附树脂，抽干，用去离子水洗涤树脂后悬浮于去离子水中。
将已处理无残余杂质的大孔吸附树脂悬浮于去离子水中，水法上柱，并用大量去离子水洗脱，直到流出液澄清透明、无溶剂气味为止。
柱层析称取0.5g FAD粗品(含量78％)溶于30ml去离子水中，充分溶解后，缓慢加入到上述已处理合格的SP-207的层析柱上，待样品充分吸附在层析柱上后，以2500ml 95％乙醇洗脱杂质，洗脱流速为3.5个柱床体积，流出液用薄层监测(GF254薄层板，展开剂正丁醇∶吡啶∶水＝8∶4∶3)。当流出液为纯品时，用2000m1～3000ml乙醇∶水＝4∶1(v/v)混合溶剂洗脱产品，洗脱流速为3.5个柱床体积，洗脱至无产品流出为止。收集纯品溶液并将其倒入不锈钢浅盘中，厚度约为1-1.5cm。进行冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用50ml去离子水充分溶解，倒入8ml装的西林瓶中，再次进行冷冻干燥，得0.32g FAD纯品，含量为99.0％，收率81.2％。
实施实例2树脂的预处理同实施例1。
柱层析称取0.5g FAD粗品(含量78％)溶于30ml去离子水中，充分溶解后，缓慢加入到上述已处理合格的SP-207的层析柱上，待样品充分吸附在层析柱上后，以2500ml丙酮与水的混合溶剂(丙酮∶水＝10∶1(v/v))洗脱杂质，洗脱流速为4个柱床体积，流出液用薄层监测(GF254薄层板，展开剂正丁醇∶吡啶∶水＝8∶4∶3)。当流出液为纯品时，用2000ml～3000ml丙酮与水的混合溶剂(丙酮∶水＝4∶1(v/v))洗脱产品，洗脱流速为4个柱床体积，洗脱至无产品流出为止。收集纯品溶液并将其倒入不锈钢浅盘中，厚度约为1-1.5cm。进行冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用50ml去离子水充分溶解，倒入8ml装的西林瓶中，再次进行冷冻干燥，得0.31gFAD纯品，含量为92.0％，收率73.1％。
实施实例3树脂的预处理同实施例1。
柱层析称取0.5g FAD粗品(含量58％)溶于30ml去离子水中，按实施实例1相同的柱层析方法，得0.26g FAD纯品，含量为92.5％，收率82.9％。
实施实例4树脂的预处理同实施例1。
柱层析称取0.5gFAD粗品(78％)溶于30ml去离子水中，充分溶解后，缓慢加入到上述20g已处理合格的SP-207中，在减压条件下，脱溶至干。倒出已吸附样品的树脂，缓慢加入到上述已处理合格的SP-207的层析柱上，再以3500ml 95％乙醇洗脱杂质，洗脱流速为3.5个柱床体积，流出液用薄层监测(GF254薄层板，展开剂正丁醇∶吡啶∶水＝8∶4∶3)。当流出液为纯品时，用3000ml～4000ml乙醇∶水＝4∶1(v/v)混合溶剂洗脱产品，洗脱流速为3.5个柱床体积，洗脱至无产品流出为止。收集纯品溶液并将其倒入不锈钢浅盘中，厚度约为1-1.5cm。进行冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用50ml去离子水充分溶解样品，倒入8ml装的西林瓶中，再次进行冷冻干燥，得0.31gFAD纯品，含量为98.5％，收率为78.3％。
实施实例5树脂的预处理同实施例1。
柱层析称取0.5g FAD粗品(含量78％)溶于30ml去离子水中，充分溶解后，缓慢加入到上述已处理合格的SP-207的层析柱上，待样品充分吸附在层析柱上后，以95％乙醇洗脱杂质，洗脱流速为3个柱床体积，流出液用薄层监测(GF254薄层板，展开剂正丁醇∶吡啶∶水＝8∶4∶3)。当流出液为纯品时，用1500ml纯水洗脱产品，洗脱流速为3个柱床体积，洗脱至无产品流出为止。收集纯品溶液并将其倒入不锈钢浅盘中，厚度约为1-1.5cm。进行冷冻干燥，浓缩后的样品用50ml去离子水充分溶解样品，倒入8ml装的西林瓶中，再次进行冷冻干燥，得0.32g FAD纯品，含量为97.7％，收率80.2％。
对比实施例树脂的预处理在Φ80×1000mm的层析柱中。加入悬浮于3000ml无水乙醇中的1000ml以聚苯乙烯作为母体的非离子交换性的多孔性吸附树脂(HP-20，日本三菱化学株式会社生产)悬浮液，用无水乙醇4500ml洗脱到流出液无色无异味，且流出液用去离子水稀释后仍澄清透明，然后用丙酮4500ml洗脱树脂，再用9000ml丙酮∶水＝1∶1(v/v)洗脱树脂，最后用9000ml乙醇∶水＝1∶1(v/v)洗脱树脂；倒出大孔吸附树脂，抽干，用去离子水洗涤树脂后悬浮于去离子水中。
将已处理无残余杂质的大孔吸附树脂悬浮于去离子水中，水法上柱，并用大量去离子水洗脱，直到流出液澄清透明、无溶剂气味为止。
柱层析称取4.4g FAD(含量78％)溶于20ml去离子水中，充分溶解后，缓慢加入到上述已处理合格的HP-20的层析柱上，待样品充分吸附在层析柱上后，以去离子水洗脱FAD，控制流速为50ml/小时，洗脱后收集FAD部分馏分，然后用1N的NaOH溶液将其馏分调整到pH＝6.0后，减压浓缩后再使用乙醇使其析出结晶，抽滤得到黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐(FAD)3.3g，含量为84.4％，收率81.2％。
我们将实施例5(见图1)的含量测定数据与对比实验的含量测定数据(见图2)作了一个对比，见表1。
表1实施例5与对比实验的比较
从表1可以看出，采用本发明制得的FAD的纯度明显高于采用JP51-127097所述方法制得产品的纯度。
权利要求
1.一种黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐的提纯方法，其特征是将黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐粗品上溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂柱进行柱层析，先用极性较小的混合溶剂体系(有机溶剂和水的体积比为20∶1-10∶1)洗脱杂质成分后，再用极性较大的混合溶剂体系(有机溶剂和水的体积比为5∶1-1∶10)或纯水洗脱产品。纯品流出液经冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用水溶解后再次进行冷冻干燥，即得到黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐纯品。
2.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于所述的溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂为Sepabeads SP207。
3.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于上柱方法为水法上柱或干法上柱。
4.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于所述混合溶剂中的有机溶剂是醇类或酮类。
5.如权利要求4所述的提纯方法，其特征在于所述的醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇，酮类溶剂选自丙酮、丁酮。
6.如权利要求4所述的提纯方法，其特征在于所述的有机溶剂是乙醇。
7.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于所述极性较小的混合溶剂，其有机溶剂和水的体积比为19∶1。
8.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于所述极性较大的混合溶剂，其有机溶剂和水的体积比为4∶1。
9.如权利要求1所述的提纯方法，其特征在于洗脱流速为3-4个柱床体积。
全文摘要
本发明提供了一种黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐(FAD)的提纯方法。将黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐粗品上溴取代烃基苯乙烯类大孔吸附树脂柱进行柱层析，先用极性较小的混合溶剂体系(有机溶剂和水的体积比为20∶1－10∶1)洗脱杂质成分后，再用极性较大的混合溶剂体系(有机溶剂和水的体积比为5∶1－1∶10)或纯水洗脱产品。纯品流出液经冷冻干燥脱溶浓缩，浓缩后的样品用少量的水溶解后再次进行冷冻干燥，即得到黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐纯品。本发明操作简便，解决了FAD，特别是化学合成法制备的FAD不易纯化的问题，可以得到纯度较高的FAD。
文档编号C07H1/06GK1763062SQ20051005732
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月17日 优先权日2005年10月17日
发明者刘永红, 王 琦, 谭俊杰, 袁代蓉, 李静 申请人:重庆药友制药有限责任公司