专利名称：色素标记蛋白质复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及用色素标记由抗体与蛋白质结合形成的蛋白质复合物而成的色素标记抗体蛋白质复合物及其制备方法。
色素标记抗体，因能与试液中抗原发生特异反应，同时具有可视性，所以可被如免疫传感器检出，在临床上可利用免疫学的抗原抗体反应来检测试液中所含的检体。目前已广泛用于各医疗机构的临床诊断中。
标记抗体的色素大多使用具有高的摩尔吸光系数、反应性高的花青类标记色素(Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp105-111,1993)。
这样的花青类色素其官能团与抗体的氨基或羧基反应，进行共价结合，对于1分子抗体来说，结合20-50分子的上述色素。
这样制成的花青类色素标记抗体一般肉眼识别性好，例如用免疫层析法，可有效地检出只存在于孕妇尿中的人绒毛膜促性腺素等微量成分。
通常，在抗体上存在数百至数千个氨基或羧基。然而，抗体具有三维立体结构，因此考虑到其中可参与反应的为50个左右，对于1分子抗体而言，最多结合50分子色素。
因此，这种色素标记抗体用于免疫传感器时，若检测对象浓度低，则产生检测困难的问题。
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供用多量色素分子标记的色素标记蛋白质复合物。
本发明提供由抗体经二硫键与蛋白质结合形成的蛋白质复合物，以及由下式(1)所示花青类色素形成的用上述色素标记上述蛋白质复合物的色素标记蛋白质复合物。
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
将蛋白质结合于抗体，扩大了花青类色素可结合的面积，因此结合于蛋白质复合物的花青类色素的数目比与抗体单体结合数为多。例如，结合于每分子抗体的色素的分子数约十倍于类似的现有技术。因此，所得的色素标记蛋白质复合物的肉眼识别性好。
从而，本发明的色素标记蛋白质复合物如果用于如免疫层析法，则在检测对象(检体)浓度低的情况下，也能高灵敏度地检出检体。而且，由于灵敏度高，本发明的色素标记蛋白质复合物也可适用于生物传感器。
本发明的色素标记蛋白质复合物通过上述花青类色素的琥珀酰亚胺碳与上述蛋白质复合物的氨基氮共价结合形成上述色素的骨架与蛋白质复合物结合的结构。
本发明的色素标记蛋白质复合物的制备方法包括以下步骤在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中还原蛋白质；在此缓冲液中加入抗体，制成蛋白质复合物；及在此缓冲液中加入式(1)所示花青类色素，标记上述蛋白质复合物。
也可包括以下步骤在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中还原蛋白质；在此缓冲液中加入式(1)所示花青类色素，标记上述还原蛋白质；及在此缓冲液中加入上述抗体。
在还原蛋白质与抗体结合的步骤前，还可包括在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中用式(2)所示的吡啶基二硫丙酸琥珀酰亚胺酯进行标记的步骤。
在任何有关方法中，磷酸缓冲液的PH以7.0-8.0为宜。
可用于本发明的色素标记蛋白质复合物的抗体无特殊限制，与抗体来源及其亚型等无关。例如，作为免疫球蛋白(Ig)，可列举小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、绵羊IgG、绵羊IgM、绵羊IgA、绵羊IgE等。这些抗体可从商业途径购得也可直接从动物身上采取。
结合于抗体上的蛋白质可以是不起抗体作用的任何蛋白质。较好的是高水溶性蛋白。例如，血清白蛋白等因其不抑制抗体反应且水溶性高而较佳。
式(1)所示花青类色素是易于肉眼确认的红色染料，因其共价碳原子数少，因而在花青类色素中是水溶性最高的。
在式(1)中，X表示的卤素可列举如氟、氯、溴或碘，M表示的金属可列举锂、钠、钾等。
以下说明抗体与花青类色素结合反应的机制。
首先，如式(3)所示，将具有琥珀酰亚胺基的花青类色素与抗体混合，抗体的氨基接近上述色素的琥珀酰亚胺基的酯结合部位。
然后，如式(4)所示，上述氨基与上述酯结合部位反应，从上述氨基夺取一个氢原子。从此氨基脱离的氢原子与上述琥珀酰亚胺基的琥珀酰亚胺结合。琥珀酰亚胺从琥珀酰亚胺基变成羟基琥珀酰亚胺而脱离，与此同时，上述琥珀酰亚胺基的剩余部分与上述被夺取一个氢原子的氨基形成酰胺键，上述色素通过此酰胺键与上述抗体结合。
下面给出式(1)所示花青类色素合成途径的一个例子。
首先，将肼基苯磺酸(5)与异丙基甲基酮溶于酸性溶剂中，加热，形成磺酸假吲哚鎓(6)。然后，在磺酸假吲哚鎓(6)的醇溶液中加热金属氢氧化物的醇溶液，得到磺酸假吲哚鎓的金属盐(7)。
接着，在上述金属盐(7)的有机溶剂溶液中加热饱和脂肪酸的卤化物，加热，得到羧基烷基磺酸假吲哚鎓的金属盐(8)。考虑到水溶性，上述脂肪酸的碳原子数以1-4为宜。
然后，将上述金属盐(8)与N-羧基乙基-3,3-二甲基假吲哚溶于碱性有机溶剂，加热，制成羧酸衍生物(9)，最后，在羧酸衍生物(9)的有机溶剂溶液中加入羟基琥珀酰亚胺和缩合剂二环己基碳化二亚胺，搅拌，得到式(1)所示花青类标记色素。
又，式(1)、式(8)和式(9)所示各化合物中所含的卤素为例如氟、氯、溴、碘、式(1)、式(7)-(9)所示各化合物中所含的金属为例如锂、钠、钾等。
以下举出具体的实施例对本发明作更详细的说明。
实施例1(1)小鼠IgG的吡啶基二硫丙酸琥珀酰亚胺酯标记将5mg(3.3×10-5mmol)小鼠IgG(以下简称IgG)溶于2ml磷酸缓冲液(以下称作PBS)中。在室温下边搅拌边滴加吡啶基二硫丙酸琥珀酰亚胺酯(以下称作SPDP)的乙醇溶液0.1ml。滴加的SPDP溶液中含0.52mg(1.67×10-3mmol)SPDP。
然后，室温搅拌30分钟后，用琼脂糖凝胶(Pharmacia制，Sephadex G25柱)过滤，得到约6ml SPDP标记IgG(以下称作IgG-SPDP)的PBS溶液。进行如下计算，求出所得溶液的浓度和SPDP对抗体的结合分子数。
首先，取0.5ml所得溶液，测定280nm处的吸光度，结果为1.25。
然后，在此溶液中加入100mM二硫苏糖醇(以下称作DTT)水溶液0.025ml，静置1分钟后，测定343nm处的吸光度。所得的吸光度为0.39。
IgG在343nm处无吸收，因此，所观察到的343nm处的吸光度是DTT还原放出的硫代吡啶酮所致。此放出的硫代吡啶酮是SPDP的吡啶基二硫基还原所致，因此其浓度等于与抗体结合的SPDP的浓度。从而，SPDP的浓度〔SPDP〕可计算如下。硫代吡啶酮在343nm处的吸光系数为8.08×103。
〔SPDP〕=0.39/(8.08×103)=4.83×10-5(M)又，观察到的280nm处的吸光来自IgG，而结合的SPDP在280nm处也有吸收，扣除此影响，按下式求出IgG的浓度〔IgG〕.IgG的280nm吸光度为Ab280,IgG,SPDP的280nm摩尔吸光系数为5.1×103,IgG的280nm摩尔吸光系数为2.10×105。
Ab280,IgG=1.25-(4.83×10-5×5.1×103)=1.00〔IgG〕=1.00/(2.10×105)=4.78×10-6(M)每分子IgG结合的SPDP的分子数计算如下。
〔SPDP〕/〔IgG〕=4.83×10-5/4.78×10-6=10.1(个)(2)用二硫苏糖醇还原牛血清白蛋白将110mg牛血清白蛋白(以下称作BSA)溶于10ml PBS中，在其中加入溶于PBS的77mg DTT，室温搅拌15分钟。用Sephadex G25M柱进行快速凝胶过滤，得到约24ml BSA(无SH)的PBS溶液。
(3)蛋白质复合物(IgG-SPDP-BSA)的制备所得的BSAS(无SH)溶液与上面所得的IgG-SPDP的PBS溶液(6ml)迅速混合，于4℃静置20小时。为了除去未反应的BSA，对添加叠氮钠作防腐剂的PBS溶液(以下称作PBS·Az)20升(5升×4)进行透析，得到约5ml IgG-SPDP-BSA的PBS溶液。
(4)蛋白质复合物(IgG-SPDP-BSA)的色素标记将式(1)所示色素122.7mg溶于1ml PBS(总蛋白量的400倍)中，配制成色素溶液(以下称作SLIC1)。但是，使用式(1)中X为碘、M为钾、碳原子数n为2的化合物。
然后，将SLIC1缓缓滴入(3)中所得的IgG-SPDP-BSA溶液(使总蛋白量为3.18×10-4mmol)。其后，于4℃静置20小时，对20升PBS·Az进行透析，得到约26ml SLIC1标记蛋白质复合物的PBS溶液。按如下计算，求出所得的SLIC1蛋白质复合物的每分子蛋白质复合物的SLIC1的分子数。
测定所得溶液的430nm处吸光度。吸光度为80。IgG-SPDP-BSA在430nm处无吸收，因此，观察到的吸光来自结合的SLIC1。然而，SLIC1的浓度〔SLIC1〕可按如下方法求出。SLIC1的430nm处摩尔吸光系数为1×105。
〔SLIC1〕=80/1×105=8.0×10-4(M)将SLIC1标记蛋白质复合物的PBS溶液中的IgG的浓度〔IgG〕调整为1.06×10-6M(SPDP标记以下各步骤中，IgG无损失)，求出每分子蛋白质复合物的SLIC1的分子数为如下〔SLIC1〕/〔IgG〕=8.0×10-4/1.066×10-6=755(个)实施例2(1)IgG的SPDP标记按实施例1所述方法，进行IgG的SPDP标记。总量为6ml,IgG浓度为4.10×10-6M，而每分子IgG的SPDP的分子数为11.5个。
(2)BSA-SLIC1的制备将110mg(1.62×10-3mmol)BSA溶于10ml PBS中，然后于室温下边搅拌边缓缓滴加SLIC1 1ml。但是，滴加的SLIC1中含与实施例1同样的色素162.7mg(0.162mmol,100当量)。
然后，于4℃搅拌过夜，对20升(5升×4)PBS·Az进行透析，得到6ml SLIC1标记BSA的PBS溶液。按如下方法计算，求出溶液的浓度及每分子BSA结合的SLIC1的分子数。
测定所得溶液的280nm和430nm处吸光度。吸光度分别为9.0和59.0.BSA在430nm处无吸收，因此，观察到的430nm处的吸光为BSA结合的SLIC1所致。然而，SLIC1的浓度〔SLIC1〕可计算如下。SLIC1的430nm处的吸光系数为1×105。
〔SLIC1〕=59.0/1×105=5.9×10-4(M)又，观察到的280nm处的吸光来自BSA，结合的SPDP在280nm处也有吸收，扣除此影响，求出BSA的浓度〔BSA〕如下。BSA的280nm吸光度为Ab280,BsA,SLIC1的280nm摩尔吸光系数为9.8×103,BSA的280nm摩尔吸光系数为4.36×104。
Ab280,BSA=9.6-(5.9×10-4×9.8×103)=3.818〔BSA〕=3.818/4.36×104=8.76×10-5(M)每分子BSA结合的SLIC1的分子数计算如下。
〔SLIC1〕/〔BSA〕=5.9×10-4/8.76×10-5=6.7(个)(3)BSA-SLIC1的DTT还原在前述BSA-SLIC1溶液(110mg,13ml)中加入溶于1ml PBS的100mg DTT(终浓度50mM)，室温搅拌15分钟。用Sephadex G25M柱进行快速凝胶过滤，得到约24ml BSA-SLIC1(无SH)的PBS溶液。
(4)色素标记蛋白质复合物的制备将前述BSA-SLIC1(无SH)溶液与前述SPDP标记IgG溶液混合，4℃搅拌一夜后，再对20升PBS·Az进行透析，除去未反应的BSA-SLIC1。得到约30ml色素标记蛋白质复合物的PBS溶液。按如下方法计算，求出所得SLIC1标记蛋白质复合物每分子的SLIC1的分子数。
测定所得溶液的430nm处吸光度。吸光度为30.2。IgG在430nm处无吸收，因此，观察到的吸光来自结合于BSA的SLIC1。然而，SLIC1的浓度〔SLIC1〕可按如下方法求出。SLIC1的430nm处摩尔吸光系数为1×105。
〔SLIC1〕=30.2/1×105=3.02×10-4(M)将SLIC1标记蛋白质复合物的PBS溶液中的IgG的浓度〔IgG〕调整为8.20×10-7M(SPDP标记以下各步骤中，IgG无损失)，求出每分子蛋白质复合物的SLIC1的分子数为如下〔SLIC1〕/〔IgG〕=3.02×10-4/8.20×10-7=368(个)如上所述，本发明的色素标记蛋白质复合物每分子蛋白质结合的色素分子数似乎为现有技术的约10倍。因此，可将其用于免疫层析法的传感器并可制备高灵敏度传感器。
权利要求
1．色素标记蛋白质复合物，其特征在于由抗体经二硫键与蛋白质结合形成的蛋白质复合物与下式(1)所示花青类色素所形成，所述色素标记所述蛋白质复合物
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
2．如权利要求1所述的色素标记蛋白质复合物，其特征还在于所述色素的骨架通过所述花青类色素的琥珀酰亚胺基的碳与所述蛋白质复合物的氨基氮形成共价键与蛋白质复合物结合。
3．色素标记蛋白质复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中还原蛋白质；在此缓冲液中加入抗体，制成蛋白质复合物；及在此缓冲液中加入式(1)所示花青类色素，标记上述蛋白质复合物
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
4．色素标记蛋白质复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤在中性或弱碱性的磷酸缓冲液中还原蛋白质；在此缓冲液中加入式(1)所示花青类色素，标记所述还原蛋白质；及在此缓冲液中加入所述抗体
式中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示1-4的整数。
全文摘要
公开了用众多色素分子标记的色素标记蛋白质复合物。此色素标记蛋白质复合物由抗体经二硫键与蛋白质结合形成的蛋白质复合物与右式(1)所示花青类色素所形成,所述色素标记所述蛋白质复合物。式中,R
文档编号C07D403/14GK1235848SQ9910674
公开日1999年11月24日 申请日期1999年5月13日 优先权日1998年5月14日
发明者重藤修行, 宫崎仁诚, 中山浩 申请人:松下电器产业株式会社