一种水稻抗病相关基因OsXBP1的应用
【专利摘要】本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个水稻抗病相关基因OsXBP1的DNA片段及其应用，具体利用RNA干扰原理的转基因技术，将OsXBP1基因的RNAi载体转入水稻品种中花11，抑制水稻中OsXBP1基因的表达。OsXBP1基因表达量显著下降的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强，证明OsXBP1基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。
【专利说明】
-种水稻抗病相关基因 OsXBPI的应用
技术领域
[0001] 本发明设及植物基因工程技术领域，提供了一个水稻抗病相关基因 OsXBPi的功能 验证，OsXBPI基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强。
【背景技术】
[0002] 植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病 毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：（1)病原体成功的在寄主植物内繁 殖，引起相关病症；（2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资 源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两 类：（1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。
[0004] 根据目前人们对抗病基因功能的认识，运类基因的产物主要是作为受体，直接或 间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径（Tang等，1996, Science 274: 2060-2063 ; Baker等，1997，Science 276 : 726-733 ; Jia等，2000 ,ΕΜΒΟ J. 19 :4004- 4014;Dang1和Jones,2001，Nature 411:826-833;Nimchuk等，2001iCurr.Opin.Plant Biol.4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利 用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要 病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻攝病的抗病基因也只有大 约40个；（2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；（3)因为病原的 快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
[0005] 抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与 合成植物体内抗病信号分子、参与信号传导或参与防卫反应等。运类基因的共同特点是病 原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可W根据病原诱导前后基因的表达量的差异 大规模地鉴定植物抗病相关基因（Maieck等，2000，化1:ure Genet. 26:403-410; Schenk等， 2000，P;roc.化tl.Acad.Sci.USA 97:11655-11660;Zhou等，2002，Science in Qiina 45: 449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因 单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因 资源：（1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，运类基因是具 有持久抗性的基因资源；（2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它 们是具有广谱抗性的基因资源；（3)运类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗 病相关基因（Zhou等，2002;化U等，2004)，运些基因在水稻抗病反应中的作用机理、W及单 个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。
[0006] 水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因 此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减 少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。 目前已报道多种抗病基因通过与抗病相关基因互作来调控植物的免疫反应，例如水稻中抗 水稻白叶枯病菌基因 Xa21，目前采用酵母双杂交技术已鉴定出XB3、XB10、XB15、XB24、BiP3 和0SSERK2等Xa21的互作蛋白，运些互作蛋白与Xa21的结合在抗病反应中发挥重要作用 (Wang et al.,2006;化ng et al.,2008;化rk et al.,2008;Qien et al.,2010;化rk et al. ,2010;化en et al. ,2014)。另外，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供 植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进 行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。运些方面是采用常规植 物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用水稻抗病基因的克隆获得抗病植株成为亟 待解决的问题之一。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个水稻抗病相关基因 OsXBPl 的DNA片段及其应用，具体利用RNA干扰原理的转基因技术，将OsXBPl基因的RNAi载体转入 水稻品种中花11，抑制水稻中OsXBP 1基因的表达。OsXBP 1基因表达量显著下降的遗传转化 水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强，证明OsXBPl基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用。
[0008] 发明人提供了一个水稻中抗病相关基因 OsXBPl完整编码区段的核巧酸序列，该基 因参与负调控水稻对白叶枯病的抗性，其核巧酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，或者基本 上相当于SEQ ID NO. 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO. 1所示序列的亚片段； 其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0009] 该基因片段OsXBPl表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增 强，可见采用抑制表达之后可W赋予植物对由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. ory zae)所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
[0010] 获得了运一片段之后，将运一序列与合适的载体连接，可W转入植物细胞，产生转 基因植物，发现抑制OsXBPl基因表达的遗传转化水稻对白叶枯病的抗性显著增强，证明了 OsXBPl基因在水稻抗白叶枯病中发挥重要作用，因此证实了抑制该基因表达后可W赋予植 物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生抗病反应，获得高 抗病植株。采用运种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。
[0011] 综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一个从水稻中分离克隆出的抗病 相关基因完整编码区段的DM片段，并命名为OsXBPl，并利用RM干扰技术（RM interference, RNAi)抑制目标基因在植物体内的表达，来鉴定该基因在抗病反应过程中所 起作用，最终发现抑制该基因表达的转基因植株抗病能力显著提高，获得高抗病植株。
【附图说明】
[0012] 图1.用定量RT-PCR技术检测水稻材料IR24(对PX099感病）和IRBB13(对PX099抗 病)接种白叶枯病菌PX099后OsXBPl基因的表达模式结果示意图；
[001引图中黑色柱形图表示对IR24接种PX099后OsXBPl基因的相对表达量，灰色柱形图 表示对IRBB13接种PX099后OsXBPl基因的相对表达量，可W看到在接种后0h、4h、化、24h和 4她OsXBPl基因的相对表达水平，可见在感病材料IR24中，接种后4h和化，OsXBPl基因表达 量显著提高；
[0014] 图2.抑制OsXBPl基因表达的转化材料(OsXBPl-RNAi)接种白叶枯病菌PX099两周 的发病结果示意灰度图，
[001引其中"WT"为野生型中花11，图中抑制OsXBPl基因表达的转化材料接种白叶枯病菌 PX099两周后的病斑面积显著低于野生型中花11材料；
[0016] 图3.用定量RT-PCR技术检测抑制OsXBPl基因表达的遗传转化水稻中OsXBPl基因 在对照材料中花11和To代遗传转化植株中的表达量结果示意图；
[0017] 图中纵坐标为OsXBPl基因在每份水稻材料中的相对表达量(对照材料WT的表达量 定为1);
[001引图4.抑制OsXBPl基因表达的遗传转化植株Zrai4Ti代接种白叶枯病菌PX099两周 后发病结果示意图；
[0019] 图中纵坐标表示每个单株接种PX099两周后的发病面积，"WT"为遗传转化受体野 生型中花11，"**"表示与对照中花11的发病面积相比，转化材料发病面积极显著降低(T检 验，P<0.01)，"*"表示与对照中花11的发病面积相比，转化材料发病面积显著降低(T检验，P <0.05)，图中琼脂糖凝胶电泳照片中条带是每个单株中抗潮霉素基因化t的PCR扩增示意 图，能扩增出化t基因的即为阳性转化材料；
[0020] 图5.抑制OsXBPl基因表达的遗传转化植株ZDH23T1代接种白叶枯病菌PX099两周 后发病结果示意图；
[0021] 图6.抑制OsXBPl基因表达的遗传转化植株ZDH29T1代接种白叶枯病菌PX099两周 后发病结果示意图。
【具体实施方式】
[0022] W下实施例中进一步定义本发明，根据W上的描述和运些实施例，本领域技术人 员可W确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可W对本发明 作出各种改变和修改，W使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本 领域现有技术；
[0023] 实施例1: OsXBPl基因的结构分析和分离克隆
[0024] 1.从水稻品种中分离克隆OsXBPl基因
[0025] 采用SIGAMA公司的TRIZ化REAGENT试剂抽提水稻感白叶枯病品种IR24的RNA，用 康为世纪公司HiFiScript cDNA Synthesis试剂盒的进行反转录得到cDNAdW该cDNA为模 板，通过PCR技术，利用引物0sXBP 1-F (5' -ATGAAGGGGGCCAAATCCAAGG-3'，其序列如序列表 569 10^.3所示）和03乂8?1-3(5'-(：1'〔61'〔41'〔61'(：1'1^4了〇：1'(：1'1'(：-3'，其序列如序列表569 ID NO. 4所示)扩增获得OsXBPl基因的DNA片段。
[00%] 其PCR反应程序为预变性94°C3min，变性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C45s，反 应30个循环，后延伸72°C5min。所获得的基因命名为OsXBPl基因，其核巧酸序列如SEQ N0.1 所示，该基因含7个内含子区，其中第514-557位、第677-790位、第870-927位、第1085-1129 位、第1229-1309位、第1397-1507位和第1806-1826位碱基为编码碱基，编码一种含HMG盒的 高迁移率蛋白，由157个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
[0027] 实施例2: OsXBP 1基因在水稻品种中的表达模式分析
[0028] 为了证实OsXBPl基因参与抗病反应的调控，我们采用定量RT-PCR技术分析了感病 材料IR24和抗病材料IRBB13中OsXBPl基因在白叶枯病菌PX099诱导后的表达模式。白叶枯 病菌接种采用剪叶法化auffman等，1973，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae,Plant Dis.Rep.57,537-541) 对成株期的水稻进行接种。分别在接种后化、地、化、24h和4她取接种叶片，抽提总RNA。利用 iQ?5定量PCR仪(Bio-Rad公司）、SYBR Green巧光嵌入染料做定量RT-PCR分析，接种后不同 时间点OsXBPl基因的表达差异。定量RT-PCR技术中的OsXBPl基因特异PCR引物是引物1，5/- 1'1'仇6了4466461'1^44664644-3'其序列如序列表569 10^.5所示和引物2,5'- CACCTATCACCGGCTGCTTT-3/其序列如序列表SEQ ID ^.6所示。^水稻肌动蛋白的1^斗0?产 物作为样品量一致性对照，肌动蛋白PCR引物序列是ActinF巧/ -TGCTATGTACGTCGCCATCCAG- 3/其序列如序列表沈0 10側.13所示)和4(：^诚(5/-44了646了44〇：4〔6口'〇：61^4-3/，其序列 如序列表SEQ ID NO. 14所示）。
[0029] 分析结果显示白叶枯病菌接种后，感病材料IR24中OsXBPl基因被诱导表达，而抗 病材料IRBB13中OsXBPl则没有显著变化（图1)，说明OsXBPl基因参与抗白叶枯病反应的负 调控。
[0030] 实施例3: OsXBPl基因的植物表达载体构建
[0031] 本发明采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术，通过抑制水稻品种中花11中 OsXBPl基因的表达，验证该基因的功能。运个技术途径的主要机理:将目标基因的部分片段 W反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传 转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。运 些dsRNA迅速形成短干扰RNA(sho;rt inte;rfe;ring RNA，s iRNA)。运些S iRNA与目标基因的 转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA 水平上抑制目标基因的功能。研究者可W通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功 能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000，Na化re 407:319-320)。
[0032] 本发明用引物3巧/ -AAGACTAGTGGTACCGGAATCTGACAAGTCCAAGT-3^，带下划线碱基 为限制性内切酶5口61和牡111识别位点，其序列如序列表56〇10^).7所示）和引物4(5/- AAGGAGCTCGGATCCTCTAACATACGCAAACTGAT-3^，带下划线碱基为限制性内切酶SacI 和BamHI 识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO. 8所示），实施例1中分离克隆的OsXBPl基因片段为模 板，PCR扩增待转化的DNA片段，PCR反应程序如下:预变性94°C 3min，变性94°C 30s，退火55°C 30s，延伸72°C30s，反应30个循环，后延伸72°C5min。
[0033] 构建OsXBPl基因片段的第一重复链(正向链）：用ΚρηΙ和BamHr消化部分PCR产物及 载体dsl301，消化完全后在75°C水浴lOmin灭活限制性内切酶，置于冰上，用T4DNA连接酶进 行连接反应。热激后获得的克隆质粒用引物3和4扩增筛选阳性克隆。
[0034] 构建OsXBPl基因片段的第二重复链(反向链）：用Spel和SacI消化剩余的PCR产物 和上述筛选出的连接了第一重复链的阳性克隆质粒，消化完全后再75°C水浴lOmin灭活限 制性内切酶，置于冰上，用T4DNA连接酶进行连接反应。热激后获得的克隆质粒用SacI和 Spel双酶切消化反应筛选阳性克隆，命名为dsl301: :0sXBPl，作为抑制表达载体，然后电击 转化农杆菌感受态细胞EHA105,保存菌株用作农杆菌介导的水稻遗传转化。
[00巧]实施例4:0sXBPl基因的功能验证
[0036] 采用农杆菌介导的遗传转化方法化in和Zhang,Opt imis ing the t issue culture conditions for high efficiency tr曰nsform曰tion of indie曰 rice，2005， Plant Cell Rep.23:540-547)将抑制表达载体导入感病水稻品种中花11，获得的转基因材 料命名为ZDH。本发明共获得独立转化植株40株。用dsl301载体上二链克隆位点的侧翼序列 设计引物52。2(5'-1'1'机44^(：此441'此444-3'，其序列如序列表56〇10^.9所示）/52尺2 (5'-TAGGCGTCTCGCATATCTC-3'，其序列如序列表沈Q ID顯.10所示）^及载体的筛选标记 Hpt基因侧翼序列设计引物HptF巧/-GATCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3/，其序列如序列表SEQ 10側.11所示)/化11?(5'-6了4(：1'1'(：了4〔4〔46〇：41^；6了〇：4-3'，其序列如序列表沈9 10側.12 所示)分别对获得转化材料进行阳性鉴定，W两对引物鉴定均为阳性的材料作为阳性植株， 进行阳性鉴定的PCR反应程序如下:预变性94°C3min，变性94°C30s，退火55°C30s，延伸72°C 45s，反应30个循环，后延伸72°C5min。对获得转化材料在孕穗期接种白叶枯病菌PX099，每 个单株接种5片完全伸展的叶片，接种后14天进行数据统计，W野生型中花11作为对照材 料，进行T检验分析。发现抑制OsXBP 1表达的植株对PX099的抗性明显增强（表1)(如图2所 示)。
[0037]表1部分To代转化植株对白叶枯病菌PX099的反应 [00；3 引
[0039]
[0040] 为进一步验证转化植株的抗病能力是否与OsXBPl基因的表达量相关，本发明从表 1中所列转化植株中选取5个株系，抽提总RNA，利用iQ?5定量PCR仪(Bio-Rad公司）、SYBR Green巧光嵌入染料做定量RT-PCR分析，比较转化植株和对照材料中OsXBPl基因表达量。 PCR反应引物是引物1和引物2。W水稻肌动蛋白的RT-PCR产物作为样品量一致性对照。该实 施例中引物与实施例2中的引物相同。
[0041] 实验结果显示OsXBPl基因的表达量与植株的抗性密切相关（图2和图3所示）。 OsXBP 1基因表达量显著降低的转化植株对PX099的抗性显著增强，说明OsXBP 1基因的编码 产物在水稻对白叶枯病的抗病反应中发挥负调控作用。为进一步证实OsXBP 1基因在水稻对 白叶枯病抗性中的作用，本发明从To代转化植株中选取了3个株系进行Τι代的重复接种验 证。结果显示，3个Τι代株系中，OsXBPl基因抑制表达的转化植株(含载体dsl301: :0sXBPl) 抗性显著高于对照中花11 (P<〇. 05)，而不含dsl301::OsXBPl载体的植株对PX099的抗性与 对照中花11无显著差异（图4、图5和图6)。运进一步说明了基因 OsXBPl在水稻对白叶枯病抗 性中的作用。可见采用抑制OsXBPl表达之后可W赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)所引起的病害产生抗病反应，从而可W改良水稻对白叶枯病的抗性。
【主权项】
1. 一种水稻抗病相关基因 OsXBPl，其基因的序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其编码的 氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2. 权利要求1所述水稻抗病相关基因 OsXBP 1在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK106011147SQ201610523239
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】储昭辉, 丁新华, 巨延虎, 孔令广
【申请人】山东农业大学