专利名称：一种水稻根系长度相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻的蛋白和基因，具体涉及一种水稻根系长度相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
根系是植物从土壤中吸收水分和氮、磷、钾等各种养分的主要器官。根系能合成氨基酸、植物激素等生物活性物质，如ΙΑΑ、ABA、乙酰胆碱等，这些物质除了参与根系发育外， 还能调节地上部的生长和发育。此外，根系所具有的分泌有机酸、酶、生物碱等物质的能力， 影响其对土壤中的矿物质的吸收和根际微生物的种类和数量。而根系的长度是根构型的一个重要指标，根系长度影响了许多重要的性状，如养分吸收、抗倒伏性、抗旱性和产量等。β-1，4-葡聚糖内切酶(ii-U-endoglucanase，EGase)属于糖苷键水解酶 (GlycosideHydrolases, GH)大类的第九家族(GH9)的A亚类，最早归为纤维素酶，其主要作用是水解可溶性纤维素衍生物内的糖苷键(Molhoj, 2001 ；Urbanowicz et al.，2007)。 β-1，4-葡聚糖内切酶在植物的生长发育中有重要作用，能影响拟南芥下胚轴的细胞壁的形成与细胞的伸长(Nicol et al. ,1998)；与拟南芥细胞的伸长和细胞壁纤维素的合成相关，并与温度相关(Sato S，2001)，在水稻中，与节间细胞伸长和细胞壁纤维素的合成相关 (Zhouet al.，2006)。KSRl在水稻中的克隆，将有助于阐明葡聚糖内切酶在水稻根系伸长方面的作用，在水稻根系育种中具有一定的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系长度相关蛋白及其编码基因与应用，该蛋白属β-1，4-葡聚糖内切酶，在氨基酸取代或缺失等情况下，能抑制水稻根系的伸长，使水稻出现短根现象，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造了条件。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为提供一种水稻根系长度相关蛋白，命名为KSRl，来源于水稻，KSRl是如下a)或b)的蛋白a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻根系长度相关的由a)衍生的蛋白质。SEQ ID NO :2氨基酸序列由623个氨基酸残基组成，属于β _1，4葡聚糖内切酶家族，与根系长度相关。上述b)中的KSRl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的KSRl的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO :1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。编码所述KSRl的基因也属于本发明的保护范围。KSRl基因具体可分为1)或2)或3)的基因
1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO=I所示的DNA分子；2)在严格条件下可与序列表SEQ ID NO 1限定的DNA序列杂交且编码上述与根系长度相关蛋白的DNA分子；3)与1)的基因有90%以上的同源性，且编码上述与根系长度相关蛋白的DNA分子。SEQ ID NO 1序列由1872个碱基组成，自5端第1_3位为起始密码子，编码具有序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸残基序列的蛋白质；该氨基酸序列为β _1，4葡聚糖内切酶类，具有四个外显子和三个内含子。若基因的碱基序列的1591bp位的鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)取代，编码的氨基酸残基序列的531位甘氨酸(Gly)突变为色氨酸(Trp)；若 1546bp位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，编码的β -1,4-葡聚糖内切酶的516位甘氨酸(Gly) 突变为精氨酸(Arg)，若178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，导致蛋白质合成的提前终止。含有KSRl基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。与现有技术相比，本发明的优点在于一种水稻根系长度相关蛋白及其编码基因与应用，该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，属于β _1，4葡聚糖内切酶家族， 与根系长度相关；该蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO :1所示的碱基序列，该碱基序列若发生突变，如1591bp位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，编码的蛋白的531位Gly变为Trp，如 1546bp位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，编码的蛋白的516位Gly变为Arg，如178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，导致蛋白质合成的提前终止，这样该蛋白就抑制节间细胞的伸长和细胞壁纤维素合成，具体在植株表现为短根系，突变体根长只有正常野生型根长的20%左右。该蛋白及其编码基因的应用，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造了条件。
图1水稻短根突变体KSRl的表型，左边为野生型，右边为突变体KSRl ；A表示植株表型，B表示根系表型。
具体实施例方式以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1突变体的表型及遗传分析/AEMS(ethyl methylsulfonate) 白勺_山禾g (Oryza Sativa L. ssp indica) ηππ 种Kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根突变体ksrl。取生长于32°C条件下6天的的幼苗进行观察，发现突变体ksrl的地上部与野生型没有显著差异，ksrl不定根和单位根长的侧根数目与野生型没有显著的差异，但不定根和侧根均比野生型短，突变体ksrl根长为3. 12士0. 38cm，野生型根长为15.16cm，突变体ksrl根长只有野生型的20%左右 (图 1)。以突变体ksrl为父本，与野生型Kasalath杂交，获得子一代F1植株与野生型 Kasalath完全一致，说明ksrl为隐性突变。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株与短根植株的分离比为264/81 = 3. 26，卡方检测结果为0. 44 < X2a05 = 3. 84，正常植株与短根植株的比例符合一对基因控制的3 1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体，命名该基因为 KSRl。实施例ISRl基因的粗定位利用筛选到多态性标记对21个F2的突变单株进行初定位分析。结果发现相关基因与第4染色体的标记RM1223表现紧密连锁，21个单株全部扩增出与Kasalath对照相同的带型，说明突变相关基因KSRl与标记RM1223连锁，且距离较近。实施例ISRl基因的精细定位在初定位的基础上，根据Gramene (http://www. gramene. org)网站上提供的数据，合成了 RM1223附近的20对引物，其中有8对在水稻品种Kasalath和Nipponhare间表现多态性。利用这些多态性的标记，我们分析了 735个F2单株，将KSRl基因定位于分子标记RM17169和RM17182之间约245kb的范围内，与RM17169有2重组子，与RM17182有1个重组子。为了进一步缩小范围，我们利用在这个区域内公布的水稻品种Nipponbare和9311 的序列，分析他们的差异，用引物设计软件I^rimerfremier 5. O设计了 7对InDel引物。经过多态性筛选，其中有2对表现多态性，分别为44472 和4-M856K。序列为4-24725KU-5’ TTGAGATTACATGCGAAATG3 ’4-24725KL-5，TATCAACCAGTACATCGTCTAC3，4-24856KU-5，AGTTGGTGACAATCTCATTGAAC3，4-24856KU-5，GCTTTACTGAAACGCCATTG3，。用这2对引物我们对F2定位群体进行扩增，分别筛选出2个和O个重组个体，且标记44472 和RM17169的重组子是相同的，这样把基因KSRl定位在了标记44472 和 RM17182之间约155kb范围内。实施例4KSR1基因克隆和鉴定通过精细定位，将基因定位到了 1551Λ的区间内，这个区间共有21个预测的基因， 通过生物信息学分析，对NCBI登录号为0s04g0497200基因的cDNA进行测序，最终发现的编码区cDNA的鸟嘌呤(G-1591)突变成了胸腺嘧啶(T)，造成编码的甘氨酸(Gly-531)突变为色氨酸(Trp)，从而引起植株根系长度变短，定名为基因KSR1。KSRl基因全长cDNA的获得水稻kasalash和ksrl叶片总RNA的提取采用上海生工RNA提取试剂盒(SK1321)， 以Oligo (dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，用弓丨物 primer 1 (5，一CGCAGCCACAGCCATGTAC—3，)禾口 primer 2 (5，一GACCAAACGAAC CGAAACA-3’ )进行PCR扩增反应，反应条件如下反应体积20ul，其中含有模板(cDNA)primer 1 禾口 primer 2dNTP二甲基亚砜(DMSO)LA Taq DNA 聚合酶10*Taq DNA聚合酶缓冲液用双蒸水补足至20 μ 1体积。反应程序如下
5
2 μ 1 (2ng) 终浓度各0. 2 μ M 终浓度各150 μ M 1 μ 1 IU
2μ 1
940C，变性3分钟；然后94°C变性30秒，61 °C退火30秒，72°C延伸2分钟，扩增洲个循环；最后在72°C下延伸10分钟。扩增产物用上海生工的DNA凝胶回收试剂盒(BBI，BS354)按产品说明书进行纯化，然后与PMD18-T载体(TaKaRa，D101A，市售)在16°C下连接5小时，构建重组载体 PMD18-KSR1。42°C热激90秒将重组载体pMD18_KSRl转化大肠杆菌DH5 α (市售)，转化物在含有氨苄青霉素的LB平板培养基(市售)上生长，挑取克隆，提取质粒，送交上海生工测序。测序结果表明，扩增到的片段的核苷酸序列如序列表1所示，将该片段命名为KSRl基因，KSRl基因全长1872bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2所示。实施例5KSR1等位基因克隆和鉴定在图位克隆其他短根突变体基因过程中，发现了两个与KSRl基因等位的突变体， 分别为ksr98和ksrl09。与ksrl不同，ksr98在cDNA编码区的鸟嘌呤(G-1M6)变成了胸腺嘧啶(T)，造成编码的甘氨酸(Gly-516)变为精氨酸(Arg) ；ksrl09在cDNA编码区的腺嘌呤(A-178)变成了 T，造成编码赖氨酸(Lys-60)的密码子成终止密码子(TAG)，导致蛋白质合成的提前终止。ksrl突变体由野生型的甘氨酸(Gly-531)突变为色氨酸(Trp)，ksr98突变体由野生型的甘氨酸(Gly-516)突变为精氨酸(Arg)，这些单核苷酸的突变都可能引起蛋白质构象的变化，导致蛋白质失活；ksrl09腺嘌呤(A-178)被突变成了 T，造成编码赖氨酸 (Lys-60)密码子成终止密码子(TAG)，导致蛋白质合成的提前终止。这三个突变体都表现为相同的短根表型，因此KSRl蛋白序列的改变或KSRl基因的碱基序列改变都可能导致水稻根系长度变短，呈现如图1所示的短根表型。
权利要求
1.一种水稻根系长度相关蛋白，其特征为如下a)或b)的蛋白a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表SEQID NO :2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水稻根系长度相关的由a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的一种水稻根系长度相关蛋白的基因，其特征为所述基因是如下1)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示DNA分子；2)在严格条件下可与序列表SEQID NO :1所示的核苷酸序列杂交且编码所述根系长度相关蛋白的DNA分子；3)与1)的基因有90%以上的同源性，且编码所述根系长度相关蛋白的DNA分子。
3.含有权利要求3所述的基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述的基因的转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求2所述的水稻根系长度相关蛋白的编码基因在改变水稻根系长度中的应
全文摘要
本发明公开了一种水稻根系长度相关蛋白及其编码基因与应用，该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，属于β-1,4葡聚糖内切酶家族，与根系长度相关；该蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO1所示的碱基序列，该碱基序列若发生突变，如1591bp位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，编码的蛋白的531位Gly变为Trp，如1546bp位的鸟嘌呤被胸腺嘧啶取代，编码的蛋白的516位Gly变为Arg，如178bp位腺嘌呤被胸腺嘧啶取代，导致蛋白质合成的提前终止，这样该蛋白就抑制节间细胞的伸长和细胞壁纤维素合成，具体在植株表现为短根系，突变体根长只有正常野生型根长的20%左右。该蛋白及其编码基因的应用，可以为水稻的根系改良和杂交育种或转基因植物的开发创造了条件。
文档编号C12N1/21GK102161985SQ20111005462
公开日2011年8月24日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者丁沃娜, 宁永强, 朱世华 申请人:宁波大学