专利名称：一种基于地中海富盐菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于地中海富盐菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用。
背景技术：
1977年，美国人Woese发现了地球上的第三种生命形式-古菌，才导致了生命三域学说的提出，即认为生命是由古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)所组成。古菌域包括泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)JlI古菌门(Korarchaeota)和纳古菌门(Nanoarchaeota)。古菌在遗传信息的传递方面(如DNA复制、转录、翻译等)与真核生物相似；而在中心代谢(如产能)方面则与细菌接近。因此，研究古菌不仅对于阐明生命运动的基本规律、揭示生命起源和物种进化等方面具有重大意义，而且有助于了解更为复杂的真核生物 中的一些重要生物学过程。从生物技术的角度看，通常生长在极端环境条件下的古菌所产生的极端酶比普通酶更能耐受严酷条件(如高温、酸碱、有机溶剂等)，因而古菌在许多领域具有良好的应用前景。极端嗜盐古菌在系统进化树中位于古菌域的一个分支-广古菌门，它能生长在含有约2-5M NaCl的近饱和盐浓度(如晒盐场、盐湖和死海等)的环境中，且具有古菌的特质，极端嗜盐古菌日益引起生物学家的关注。另外，极端嗜盐古菌极具开发前景，如在这类微生物中存在大量可供开发的极端酶类、生物活性物质、可生物降解的塑料PHA和可作为纳米生物材料用于构造生物分子器件的紫膜等。近年虽然在分子遗传学方面有些进展，比如Polyethylene glycol (PEG,聚乙二醇)介导的极端嗜盐古菌原生质体转化方法的建立、基因敲除，基因互补和定点突变等技术在极端嗜盐古菌中的应用，但仅局限在某些种属中，不具有普遍适用性，从而限制了对其他菌株的深入研究。另外，一般用于极端嗜盐古菌抗性选择的主要是新生霉素、茴香霉素、莫维诺林和硫链丝菌素等，但这些抗性选择标记基因多来源于菌体自身基因突变后克隆得到的，应用于整合质粒载体系统转化后，易发生与菌体相应的内源基因发生高频同源重组，导致假阳性转化子的产生。且这些抗生素的选择压力较弱，常常得不到转化子。这种情况，极大地阻碍了对嗜盐古菌的深入系统的理论研究和基因工程开发。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组嗜盐古菌。本发明所提供的重组嗜盐古菌，按照包括如下步骤的方法制备得到使含有SEQIDNO :1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌。上述重组嗜盐古菌中，所述含有SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌为地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)。
上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)为保藏编号为CGMCC I. 2087的地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)。上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述使含有SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的功能丧失为敲除所述出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO : I所示蛋白的编码基因；上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述敲除是通过同源重组实现的；上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述同源重组通过如下同源重组载体实现所述同源重组载体按照包括如下步骤的方法构建将SEQ ID NO :2中第1-602位核苷酸所示DNA沿着从KpnI至BamHI的方向插在载体pUBP的KpnI和BamHI位点间,得到的重组载体记作中间重组载体JfSEQ ID NO 2中第1419-1985位核苷酸所示DNA沿着从BamHI至PstI的方向插在载体PUBP的BamHI和PstI位点间，得到的重组载体即为所述同源重组载体； 上述任一所述重组嗜盐古菌中，所述SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第611-1408位核苷酸所示DNA分子;2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自5'末端第512-1408位核苷酸所示DNA分子;3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90 %以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。本发明的另一个目的是提供一种试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述任一所述的重组嗜盐古菌和如下重组质粒载体；所述重组质粒载体中至少含有供外源基因插入的多克隆位点和如下其它三个元件在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQ ID NO :I所示蛋白的编码基因的表达盒；所述供外源基因插入的多克隆位点不与所述其它三个元件重叠。上述试剂盒中的重组质粒载体中既含有大肠杆菌质粒复制子(即在大肠杆菌中复制所需的复制原点)又含有用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒，方便在大肠杆菌中进行基因操作及在嗜盐古菌中进行遗传操作。上述任一所述试剂盒中，所述重组质粒载体中的各个元件之间的排列顺序没有要求。优选的，所述重组质粒载体中的各个元件之间不相互重叠。上述任一所述试剂盒中，所述重组质粒载体按照包括如下步骤的方法制备得到将SEQ ID NO 2中第512-1408位核苷酸所示基因插在载体pUBP的多克隆位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体。上述任一所述试剂盒中，所述重组质粒载体具体按照包括如下步骤的方法制备得到将SEQ ID NO 2中第512-1408位核苷酸所示基因沿着从EcoRI至KpnI的方向插在载体pUBP的EcoRI和KpnI位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体。该质粒的物理图谱如图I所示，其多克隆位点包括的限制性内切酶酶切位点有SphI,PstI,BamHI，KpnI和EcoRI等酶切位点各一个，两个HindIII酶切位点；这些内切酶识别位点可以方便的进行外源片段的克隆及其衍生载体的构建。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中包括筛选培养基I和/或筛选培养基II ;每I升所述筛选培养基I由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCUMgSO4 · 7H20、KCl、FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水组成，其中各组分在所述筛选培养基I中的浓度为酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸钠I. Og/L、柠檬酸钠3. Og/L、NaC1200g/L、MgSO4 ·7Η20 20g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 ·7Η20 0. 36g/L、MnCl2 ·4Η20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5-F0A 250mg/L ;所述筛选培养基I的pH值为7· 1-7. 2 ；(此为筛选双交换菌株的培养基) 每I升所述筛选培养基II由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCUMgSO4 ·7Η20、KC1、FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4Η20和水组成，其中各组分在所述筛选培养基II中的浓度为酸水解酪素 5. Og/L、谷氨酸钠 I. Og/L、柠檬酸钠 3. Og/L、NaCl 200g/L、MgSO4 · 7H2020g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L ;所述筛选培养基 II 的 pH 值为7. 1-7. 2。(此为筛选单交换菌株的培养基)上述任一所述试剂盒在如下I)或2)或3)中的应用也属于本发明的保护范围I)敲除上述任一所述重组嗜盐古菌的基因组中目的基因；2)在上述任一所述重组嗜盐古菌中过表达外源基因；3)研究菌(Haloferax mediterranei)的基因组中待测基因的功能。本发明的另一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第611-1408位核苷酸所示DNA分子;2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自5'末端第512-1408位核苷酸所示DNA分子;3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围；SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因在基因工程中作为选择标记的应用也属于本发明的保护范围。所述基因工程是与含有SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的极端嗜盐古菌相关的基因工程。所述SEQ ID NO 1所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第611-1408位核苷酸所示DNA分子；
2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自5'末端第512-1408位核苷酸所示DNA分子;3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90 %以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。本发明的遗传操作系统，包含2个组分，一部分为整合质粒载体pHFX，另一部分为Hfx. mediterranei Δ pyrF尿卩密唳营养缺陷型宿主菌。该遗传操作系统可作为一个高效的基因敲除系统，可以对Hfx. mediterranei进行广泛的 基因功能研究和代谢途径阐明。实验证明，用本发明系统进行遗传转化获得阳性重组子的频率大大提高。本发明丰富了嗜盐古菌中的选择标记基因，增加选择的压力，易于阳性转化子的筛选，利于对嗜盐古菌展开系统的大规模的功能基因组学分析，并从中发现嗜盐古菌这个群体中共性和个性的遗传代谢、进化生态、物种起源等的机理。本发明为极端嗜盐古菌的研究和开发提供了重要工具，将在极端嗜盐古菌的研究和开发中发挥重要作用。
图I为整合质粒载体pHFX构建过程示意2为PyrF蛋白氨基酸序列与Halobacterium sal inarum Ura3蛋白(NCBI编号AF187997)多序列比对示意3为pyrF基因RT-PCR的琼脂糖凝胶电泳图谱图4为利用pHFX整合质粒载体敲除目的基因原理不意5为pyrF基因上下游结构图与Hfx. mediterranei Δ pyrF突变体PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图及Southern blot验证结果图6为crtB基因上下游结构图与Hfx. mediterranei Δ pyrF Δ crtB突变体PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图及Southern blot验证结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。地中海富盐菌(Haloferax mediterranei) CGMCC I. 2087购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。pUCm-T载体购自Beyotime，产品目录号为D2006。载体pUBP 在文献“Han, J. , Q. Lu, et al. (2007). " Molecular characterizationof thephaEC(Hm), genes, required for biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate)in the extremelyhalophiIic Archaeon Haloarcula marismortui. " Applied andEnvironmental Microbiology 73(19) :6058-6065.’’中公开过,公众可从中国科学院微生物研究所获得。实施例I、乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶PyrF及其编码基因的获得对地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)CGMCC I. 2087进行基因组测序,研究其结构，结果该基因组中有一个orf被注释为pyrF。设计一对引物P1/P2进行PCR扩增pyrF编码基因及其启动子序列，引物序列如下Pl 5/ GGCGAATTCGTTTTCTTGTGTGCGGTT3' (EcoRI)P2 5/ GTTGGTACCTTACCGGTACTGGTTCAG3' (KpnI)以地中海富盐菌(Haloferax mediterranei) CGMCC I. 2087的基因组为模板,用引物对Pl和P2为上下游引物进行PCR扩增，得到897bp长度的PCR产物。上述PCR扩增程序为94°C 3min预变性；然后94°C 30s、57°C 30s、72°C 60s进行30个循环；72°C再延伸7min。扩增体系为25 μ I。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明在pUCm_T载 体中插入的基因序列如SEQ ID N0:2中自5'端第512-1408位核苷酸所示，其中SEQID NO:2第512-610位核苷酸为基因PyrF的启动子区域，第611-1408位核苷酸为基因PyrF的编码框，第582-589位核苷酸序列为启动子核心序列；基因PyrF编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示(记作PyrF蛋白)。表明引物对P1/P2扩增得到了 897bp的序列，正确。实施例2、pyrF基因功能鉴定及Hfx. mediterranei Δ pyrF的构建每升AS-168培养基按照如下方法制备将5. Og酸水解酪素(casamino acids),
5.Og 酵母提取物(yeast extract), I. Og 谷氨酸钠(sodium glutamate), 3. Og 朽1 檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO4 · 7Η20，2· Og KCl，O. 36g FeSO4 · 7H20 和 0. 36mg MnCl2 · 4H20 溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至I升，pH 7. 1-7. 2。酸水解酪素购自Bacto Difco，产品目录号为223120。酵母提取物购自0X0ID，产品目录号为LP0021。I. RT-PCR 检测 Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 中 pyrF 基因的转录情况。I)培养条件挑取地中海富盐菌(Haloferax mediterranei) CGMCC I. 2087 单菌落于AS-168培养基37°C摇床，200rpm,培养4天。2) RNA 提取取灭菌的 I. 5ml EP 管收集 I. 5ml 菌液，4°C，12000rpm，离心 lmin，用移液枪吸尽上清。加入Iml TRIzol试剂(invitrogen)裂解菌体,有机溶剂抽提去除细胞碎片、脂类和蛋白，得到总RNA，溶解于20-30 μ I DEPC水中。取1.5μ1 RNA溶液加入到300 μ I TE溶液中，用Beckman DU800测定其浓度，对照为300 μ I TE加入I.5μ I DEPC水。测得0D260/280为2. 02，说明RNA的纯度符合下一步的实验要求。计算得到RNA的浓度为
6.28 μ g/ μ I ο 取总 RNA 15 μ g 用 RNase-free RQlDNase (Promega)处理，50 μ L 体系(DNasebuffer 5 μ I, DNase 5μ 1,15μ g RNA, DEPC 水补足至 50 μ I)，37°C 反应 4_5h ;70°C，IOmin失活DNase，以此作为RT模板。3) RT-PCR 检测根据pyrF的核苷酸序列，设计一对RT-PCR引物pyrFRTF/pyrFRTR,引物序列如下pyrFRTF 5/ TTCGTCCTCTGTCGCACCTCT3'pyrFRTR 5' CTGGTTCAGCCGCTCTTTG3'以DNase消化后的RNA为模板，利用OneSt印RT-PCR试剂盒(Qiagen公司)，根据说明书步骤进行RT-PCR。程序分为两步第一步，利用RT-PCR后引物pyrFRTR，以总RNA为模板，将目的RNA反转录成cDNA ;第二步，利用引物对pyrFRTF/pyrFRTR，以上步的cDNA为模板，进行PCR。以未经Dnase消化的总RNA作阴性对照。结果如图3所示泳道I为RT-PCR条带381bp ;泳道2为未经Dnase消化的总RNA模板阴性对照；泳道M为IOObp DNAladdermarker ο从图3可以看出pyrF基因是活跃转录的。另外,通过检索基因组注释,发现该基因在基因组中仅有一个拷贝，有利于后续基因的敲除、互补和营养缺陷型菌株的获得。2.敲除 Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 中的 pyrF 基因，获得 Hfx.mediterraneiΔpyrFI) PUBP Δ pyrF 的构建<1>用于敲除pyrF的同源重组双交换臂的PCR扩增根据SEQ ID NO 2中pyrF基因编码 序列及其上下游核苷酸序列，设计了一对双/单交换鉴定引物P3/P4及两对双交换臂的扩增引物pyrFFl/pyrFRl和pyrFF2/pyrFR2 P3 TGTTGTGGGTTGTCGAAC,(与 SEQ ID NO 2 中 4S3-5OO 匹配)P4 CGAGGCCCATGATAAGTC,(与 SEQ ID NO 2 中 1502-1519 匹配)，pyrFFl 5/ GCTGGTACCCGTCAACATGGCGTACATCC3' (KpnI)pyrFRl 5/ GCGGGATCCAGTGCGACGACCGTATGTAAG3; (BamHI)pyrFF2 5/ GCGGGATCCATCACAGACTGGCACTGGACT3' (BamHI)pyrFR2 5/ ATACTGCAGGCGTCTGGATGCGTCTCCT3' (PstI)以Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 的基因组 DNA 为模板，用引物对 pyrFFl/pyrFRl扩增破坏pyrF的双交换左臂602bp,如图5A所示。PCR扩增程序为94°C 3min预变性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 40s进行30个循环;72°C延伸7min。扩增体系为25 μ L·将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对pyrFFl/pyrFRl扩增得到了 602bp的序列，具有SEQ ID NO :2的自5'端第1-602位核苷酸序列；以Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 的基因组 DNA 为模板，用引物对 pyrFF2/pyrFR2扩增敲除pyrF的双交换右臂567bp，如图5A所示。PCR扩增程序为94°C 3min预变性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 40s进行30个循环;72°C延伸7min。扩增体系为25 μ L·将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对pyrFF2/pyrFR2扩增得到了 567bp的序列，具有SEQ ID NO 2的自5'端第1419-1985位核苷酸序列。<2>敲除pyrF的整合质粒载体pUBP Δ pyrF的构建将经限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切的载体pUBP和PCR产物左臂602bp，T4DNA ligase 16°C连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；测序结果表明片段602bp (其核苷酸序列为序列表中序列2的自5'末端第1-602位核苷酸序列)已经正确插入载体pUBP的BamHI和KpnI位点间(沿着从KpnI至BamHI的方向)，将其命名为重组载体PUBP602。将经PstI和BamHI双酶切的重组载体pUBP602和PCR产物右臂567bp，连接酶T4DNA ligase 16°C连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段567bp (其核苷酸序列为序列表中序列2的自5'末端第1419-1985位核苷酸序列)已经正确插入载体PUBP602的PstI和BamHI位点间(沿着从BamHI至PstI的方向)，得到含有左臂602bp和右臂567bp的双交换整合质粒载体，并将其命名为pUBP Δ pyrF。该质粒中左臂602bp和右臂567bp连在一起构成的片段记作ApyrF。
2)构建 Hfx. mediterranei Δ pyrF利用pUBP Δ pyrF 的双交换臂与 Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 基因组中的pyrF进行同源重组，敲除pyrF基因，具体步骤如下<DpUBP Δ pyrF 转化 Hfx. mediterranei米用文献(Cline,S. ff. , ff. L. Lam, et al. (1989). " Transformation methodsforhalophilic archaebacteria. " Can T Microbiol 35(1) 148-152.)所述 PEG 介导的转化方法，将 pUBP Δ pyrF 转化地中海富盐菌(Haloferax mediterranei) CGMCC I. 2087,转化后在含有3mg/L莫维诺林的AS-168 (AS-168培养基+3mg/L莫维诺林)固体平板上筛选转化子，能在含有3mg/L莫维诺林的AS-168上生长的克隆即为成功转入pUBP Δ pyrF的重组菌。<2>筛选和验证pUBP Δ pyrF发生整合的单交换菌株 对步骤〈1>得到的转化子分别进行PCR验证抽取总DNA，以引物对P3/P4进行PCR反应，PCR扩增程序为94°C 3min预变性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 60s进行30个循环；72°C延伸7min。扩增体系为25μ1。产生1037bp和222bp条带的菌为目的单交换菌株。单交换筛选原理发生单交换时,pUBP ApyrF质粒整合入Hfx. mediterranei基因组同源区域，在单交换菌株中存在一个拷贝的完整的PyrF基因和一个拷贝的ApyrF，以完整的PyrF基因为模板，扩增得到1037bp，以ApyrF为模板，扩增得到222bp，因此，以单交换菌株的基因组为模板可扩增出大小分别为1037bp和222bp的两条带。PCR鉴定结果如图5B所示泳道I为单交换菌；泳道3为pUBP Λ pyrF质粒阳性对照；泳道4为地中海富盐菌(Haloferax mediterranei) CGMCC I. 2087野生型阴性对照。从图中看出，阴性对照的的PCR产物大小1037bp，阳性对照的PCR产物大小222bp，泳道I的PCR产物大小分别为1037bp和222bp，说明对应的菌株为目的单交换菌株。<3> 双交换菌株 Hfx. mediterranei Δ pyrF 的筛选将步骤〈2>筛选到的pyrF单交换菌株在不含莫维诺林的液体AS-168培养基中传代培养50代，重复转接培养4次后将传代培养的培养液稀释IO7涂布固体AS-168培养基平板，培养一周左右。挑取单克隆同时在AS-168固体平板上及含3mg/L莫维诺林的AS-168的固体培养基上划线。一周后，挑取在抗性平板(含3mg/L莫维诺林的AS-168的固体培养基)上不生长但在非抗性平板(AS-168固体平板)上生长的单菌落，即为目的双交换菌株，记作重组菌 Hfx. mediterranei Δ pyrF。PCR验证抽提重组菌Hfx. mediterranei Δ pyrF的基因组DNA作为模板，同样以引物对P3/P4进行PCR验证，反应体系和条件与筛选单交换菌株相同。扩增只得到222bp一条带的菌株为目的双交换菌株。Southern blot 验证参照 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I (Roche)说明书进行,先提取重组菌Hfx. mediterranei Δ pyrF的基因组DNA及对照菌株Hfx. mediterranei野生型的基因组DNA,用限制性内切酶SalI进行消化,消化后的产物用于杂交(图5A)。Southern blot中使用的探针为上述pyrF的双交换右臂567bp片段，并用地高辛标记。杂交得到1608bp条带的菌株为双交换菌株，杂交得到2424bp条带的菌株为Hfx. mediterranei野生型菌株。PCR鉴定结果如图5B所示泳道2为双交换菌株。泳道2中显示PCR产物大小为222bp，说明对应的菌株为发生双交换导致pyrF基因缺失的地中海富盐菌Hfx.mediterranei。Southern blot鉴定结果,见图5C。泳道I为野生型，泳道2为双交换菌株。Southern blot结果显示双交换菌株仅含有1608bp小片段，野生型对照菌株含有2424bp大片段，表明得到的目的双交换菌株正确。整合质粒载体pUBP Δ pyrF中的SEQ ID NO 2中第1-602位核苷酸所示DNA和SEQID NO 2中第1419-1985位核苷酸所示DNA与Hfx. mediterranei中的完整基因pyrF发生同源重组，使缺失突变株Hfx. mediterranei Δ pyrF中缺失了基因pyrF中的SEQ ID NO 2中第603-1418位核苷酸。<4>Hfx. mediterranei Δ pyrF 对 5_ 氟乳清酸(5-F0A)抗性检测每升AS-168SY培养基按照如下方法制备将5. Og酸水解酪素，I. Og谷氨酸钠，
3.Og 柠檬酸钠，200g NaCl，20g MgSO4 · 7Η20，2· Og KCl，O. 36g FeSO4 · 7H20 和 0. 36mg MnCl2 · 4H20溶于蒸馏水，用蒸馏水容至I升，得到的混合物即为AS-168SY培养基，用IOMNaOH 手动调节 pH 7. 1-7. 2。将Hfx. mediterraneiΔpyrF 和 Hfx. mediterranei CGMCC I.2087 野生型分别划线于添加终浓度为SOyg/ml尿嘧啶(Uracil)和终浓度为250 μ g/ml 5-氟乳清酸(5-Fluorooroticacid, 5-F0A)的AS-168SY培养基，于37 °C培养，一周后观察菌的生长情况。结果Hfx. mediterranei ApyrF突变体获得了 5-F0A抗性，为尿卩密唳营养缺陷型菌株，而野生型菌株受到抑制，不能长出单菌落，为尿嘧啶原养型。这是因为，地中海富盐菌Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087体内存在从头合成尿嘧啶核苷酸的途径，因而能以5-F0A(5-fluoroorotic acid)为底物代谢产生对细胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-fluorouracil)，因此野生型菌株在含有5-F0A的培养基中不能存活；而基因pyrF(Orotidine 5' -phosphatedecarboxylase)正是尿卩密唳核苷酸合成途径最后一步的关键酶，Hfx. mediterranei ApyrF中缺失了 pyrF基因，失去了尿喃唳核苷酸合成能力，并失去了催化5-F0A产生细胞毒性化合物5-FU能力，因而Hfx. mediterranei Δ pyrF能在有
5-F0A的培养基上生长，并且培养基中需要含有尿嘧啶。pUBP这个质粒不具备在Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087中复制的复制子，因而不能单独转，只能在克隆入同源片段后靠同源重组才能整合进基因组。上述实验只是提供了一个间接证据，证明该基因pyrF确实在尿嘧啶核苷酸合成途径中起作用，而图2的蛋白多序列比对结果显示，PyrF蛋白序列与已报道的Hbt.Salinarum中的Ura3有69%的序列相似性,可以证明该基因确实编码乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶。pyrF基因功能的阐明，有助于后续敲除和表达载体的构建，可以作为一个十分有效地选择标记基因应用于其他遗传操作系统。实施例3、构建基于pyrF基因的整合质粒载体pHFX将实施例I中PUCm-PyrF (含pyrF全长且含自身启动子)用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切并切胶回收目的基因pyrF片段；将载体pUBP用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，回收载体大片段，将载体大片段与目的基因PyrF片段用T4DNA ligasel6°C连接过夜，构建过程如图I所示。然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆快抽检测，并提质粒进行测序，结果在载体pUBP的EcoRI和KpnI位点间沿着从EcoRI至KpnI的方向插入了 SEQ ID NO 2中第512-1408位核苷酸所示基因，表明构建的重组载体正确，将阳性重组载体记作pHFX。载体pHFX中含有如下四个元件在大肠杆菌中复制所需的复制原点，即大肠杆菌质粒复制子E. coli ori ;用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因AmpK(氨苄青霉素抗性基因)的表达盒；乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶的编码基因pyrF的表达盒；供外源基因插入的多克隆位点。上述四个元件均不相互重叠，各个元件之间的排列顺序没有特别要求。该载体pHFX的物理图谱如图I所示，其多克隆位点包括的限制性内切酶酶切位点有SphI，PstI，BamHI，KpnI和EcoRI等酶切位点各一个，两个HindIII酶切位点；这些内切 酶识别位点可以方便的进行外源片段的克隆及其衍生载体的构建。多克隆位点在基因pyrF的表达盒的上游，不与大肠杆菌中复制所需的复制原点、抗性选择标记基因AmpK(氨苄青霉素抗性基因)的表达盒和乳清苷-5'-单磷酸脱羧酶的编码基因pyrF的表达盒重叠。载体pHFX中，既含有大肠杆菌质粒复制子(即在大肠杆菌中复制所需的复制原点)又含有用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒)，方便在大肠杆菌中进行基因操作及在嗜盐古菌中进行遗传操作。载体pHFX中不具备在Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087中复制的复制子,但可以在克隆入同源片段后靠同源重组整合入Hfx. mediterranei的基因组。该载体中pyrF基因可以赋予Hfx. mediterranei Δ pyrF尿卩密唳核苷酸从头合成能力，因而能在尿嘧啶营养缺陷型培养基AS-168SY上生长，因而达到正向选择转化子的目的。至此，整合质粒载体pHFX结合实施例2中得到的Hfx. mediterranei ApyrF组成了一个高效的基因敲除系统，可以对Hfx. mediterranei进行广泛的基因功能研究和代谢途径阐明。Hfx. mediterranei Δ pyrF和载体pHFX组成遗传操作系统的原理Hfx.mediterranei内存在从头合成尿卩密唳核苷酸的途径，因而能以5-F0A(5_fluorooroticacid)为底物代谢产生对细胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-f IuorouraciI)。而pyrF (Orotidine 5' -phosphatedecarboxylase)正是尿卩密唳核苷酸合成途径最后一步的关键酶，该基因缺失突变后的菌将失去尿嘧啶核苷酸合成能力和失去催化5-F0A产生细胞毒性化合物5-FU能力，从而Hfx. mediterranei Δ pyrF能在含有5-F0A的培养基上生长,野生型却不能。将含有外源基因的待整合质粒载体pHFX转化Hfx. mediterranei ApyrF后，首先质粒载体pHFX与Hfx. mediterranei ApyrF发生单交换,然后再发生双交换,最后实现目的基因的敲除。实施例4、系统的应用-敲除八氢番茄红素合成酶crtB基因利用Hfx. mediterranei Δ pyrF 和 pHFX AcrtB 敲除 Hfx. mediterranei Δ pyrF 中的crtB基因，具体步骤如下I、敲除crtB的整合质粒载体pHFXA crtB的构建I)用于敲除crtB的同源重组双交换臂的PCR扩增根据SEQ ID NO 3中crtB基因编码序列及其上下游核苷酸序列，设计了两对双交换臂的扩增引物 crtBFl/crtBRl 和 crtBF2/crtBR2 crtBFl 5/ ATACTGCAGGTGCGGCGTGTGGGTACTTC3' (PstI)
crtBRl 5/ AATGGATCCCCGCGTACCGTCCCTGTCAC3' (BamHI)crtBF2 5/ GGTGGATCCGTTTGGTCGTTGATTTTTGA3' (BamHI)crtBR2 5' ACAGGTACCGGCTTCCCGTGTTTTTCATC3' (KpnI)以地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)CGMCC I. 2087 的 DNA 为模板，用引物对crtBFl/crtBRl扩增破坏crtB的双交换左臂504bp，如图6A所示。PCR扩增程序为940C 3min预变性；94°C 30s、57°C 30s,72°C 30s进行30个循环；72°C延伸7min。扩增体系为25 μ I。将PCR扩增产物片段连接到pUCm-T载体上进行测序，测序结果表明弓I物对crtBFl/crtBRl扩增得到了 504bp的序列，具有SEQ ID NO :3的自5'端第1-504位核苷酸序列；以 Hfx. mediterranei CGMCC I. 2087 的 DNA 为模板，用引物对 crtBF2/crtBR2 扩增敲除crtB的双交换右臂528bp，如图6A所示。PCR扩增程序为94°C 3min预变性；94°C 30s、57°C 30s,72°C 30s进行30个循环；72°C延伸7min。扩增体系为25 μ I。将PCR扩增产物片段连接到PUCm-T载体上进行测序，测序结果表明引物对crtBF2/crtBR2扩增得到了 528bp的序列，具有SEQ ID NO 3的自5'端第1534-2061位核苷酸序列。2)敲除crtB的整合质粒载体pHFX Δ crtB的构建将经限制性内切酶BamHI和PstI双酶切的载体pHFX和PCR产物左臂504bp，T4DNA ligase 16°C连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；测序结果表明片段504bp (其核苷酸序列为序列表中序列3的自5'末端第1-504位核苷酸序列)已经正确插入载体pHFX的PstI和BamHI位点间(沿着从PstI至BamHI的方向)，将其命名为重组载体PHFX504。将经KpnI和BamHI双酶切的重组载体pHFX504和PCR产物右臂528bp，连接酶T4DNA ligase 16°C连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序；结果表明片段528bp (其核苷酸序列为序列表中序列3的自5'末端第1534-2061位核苷酸序列)已经正确插入载体PHFX504的BamHI和KpnI位点间(沿着从BamHI至KpnI的方向)，得到含有左臂504bp和右臂528bp的双交换整合质粒载体，并将其命名为pHFX Δ crtB。左臂504bp和右臂528bp —起构成重组片段,记作Δ crtB。2、敲除 Hfx. mediterranei Δ pyrF 中的 crtB利用pHFX Δ crtB 的双交换臂与 Hfx. mediterranei Δ pyrF 基因组中的 crtB进行同源重组以敲除crtB基因(原理示意图见图4)，构建crtB缺失突变株Hfx.mediterranei Δ pyrF Δ crtB,具体步骤如下I)单交换菌株的构建、筛选及验证方法米用文献(Cline,S. ff. , ff. L. Lam, et al. (1989). " Transformation methodsforhalophilic archaebacteria. " Can .I Microbiol 35(1) 148-152.)所述 PEG 介导的转化方法，将pHFXA crtB转化Hfx. mediterranei Δ pyrF,转化后涂布筛选培养基II固体平板，在该固体平板上能正常生长的菌为发生单交换的菌。每I升所述筛选培养基II由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCUMgSO4 ·7Η20、 KCUFeSO4 · 7Η20,MnCl2 · 4Η20和水组成，其中各组分在所述筛选培养基II中的浓度为酸水解酪素 5. 0g/L、谷氨酸钠 I. 0g/L、柠檬酸钠 3. 0g/L,NaCl 200g/L、MgS04 · 7H2020g/L、KCl2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L ;所述筛选培养基 II 的 pH 值为 7. I。(此为筛选单交换菌株的培养基)单交换菌株验证进行PCR验证抽取单交换菌株的总DNA，以引物对crtBFl/crtBR2 进行 PCR 反应，PCR 扩增程序为-MV 3min 预变性；94°C 30s,57°C 30s、72°C 60s 进行30个循环；72°C延伸7min。扩增体系为25μ1。以发生单交换的菌的基因组为模板，扩增出大小分别为1032bp和206 1bp的两条带的为目的单交换菌株。单交换筛选的原理因为发生crtB单交换时，载体pHFX Λ crtB通过双交换左臂或双交换右臂全部整合到Hfx. mediterranei ApyrF的基因组上。一方面,为了区分单交换菌株与未转化的Hfx. mediterranei ApyrF,筛选培养基II中不含有尿卩密唳；单交换菌株中含有了 PyrF基因，菌自身便可以合成尿嘧啶，因此单交换菌在不含有尿嘧啶的AS-168SY固体平板便能生长；而未转化的Hfx. mediterranei ApyrF中不含有pyrF基因，不能自身合成尿嘧啶，不能在不含有尿嘧啶的固体平板上生长。另一方面，crtBFl/crtBR2扩增出大小分别为1032bp和2061bp的两条带的菌为目的单交换菌株；发生单交换的菌中含有一个拷贝的完整的crtB基因，还含有另一个拷贝的Λ crtB，以发生单交换的菌的基因组为模板用引物crtBFl/crtBR2进行PCR扩增，可扩增出大小分别为1032bp和206Ibp的两条带，1032bp是对AcrtB的扩增结果，206 Ibp是对完整的crtB基因的扩增结果。2)双交换菌株的构建、筛选及验证方法将步骤I)筛选到的crtB单交换菌株在液体AS-168SY(添加终浓度50 μ g/mlUracil)培养基中传代培养50代，将传代培养的培养液稀释IO7涂布于筛选培养基I的平板，37°C培养一周左右。挑取单克隆划线于筛选培养基I的平板，能在筛选培养基I的平板上生长的菌落为发生双交换的菌，记作Hfx. mediterranei Δ pyrF Δ crtB。每I升所述筛选培养基I由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCUMgSO4 · 7H20、KCl、FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水组成，其中各组分在所述筛选培养基I中的浓度为酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸钠I. Og/L、柠檬酸钠3. Og/L、NaC1200g/L、MgSO4 ·7Η20 20g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 ·7Η20 0. 36g/L、MnCl2 ·4Η20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5-F0A 250mg/L ;所述筛选培养基I的pH值为7. 1-7. 2 ；双交换菌株验证PCR验证以Hfx. mediterranei Δ pyrF Δ crtB的基因组DNA作为模板，以引物对crtBFl/crtBR2进行PCR扩增，反应体系和条件与单交换菌株验证相同。扩增结果为1032bp条带的应为目的双交换菌株。Southern blot 验证方法参照 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarterKit I (Roche)说明书进行，具体为先提取 Hfx. mediterranei Δ pyrF Δ crtB 的基因组DNA及对照菌Hfx. mediterranei Δ pyrF的基因组DNA,用限制性内切酶Smal/Kpnl进行消化，消化后的产物用于杂交(图6A)。Southern blot中使用的探针为上述crtB的双交换右臂528p片段，并用地高辛标记。杂交结果为2452bp条带的为目的双交换菌株，杂交结果为3481bp条带的为对照菌Hfx. mediterranei ApyrF,该条带由图6A所示的Smal/Kpnl双酶切位点之间的片段产生。双交换菌株筛选验证原理发生双交换后，单交换菌中的完整的crtB基因被替换，质粒pHFX Δ crtB从单交换菌的基因组中脱离，因此双交换菌株中只含有一个拷贝的Λ crtB且不再含有完整的crtB基因和pyrF基因。一方面，筛选培养基I需含有尿嘧啶和5-F0A ;因为双交换菌中不含有pyrF基因，自身不能合成尿嘧啶，且不能以5-F0A为底物代谢产生细胞毒性物质5-氟尿嘧啶，因此能在含有5-F0A的培养基中生长；而单交换菌株中含有PyrF基因，能以5-F0A为底物代谢产生细胞毒性物质5-氟尿嘧啶，因此不能在含有5-F0A的培养基中生长；所以筛选培养基I中需含有尿嘧啶和5-F0A。另一方面，用引物crtBFl/crtBR2对双交换菌株基因组进行扩增时，只得到一条得到1032bp的条带的菌为目的双交换菌株；因为双交换菌株中含有AcrtB，当用引物crtBFl/crtBR2对双交换菌株基因组进行扩增时，其实是对Λ crtB的扩增结果，因此只得到一条得到1032bp的条带。整合质粒载体pHFXA crtB中的SEQ ID NO 3中第1-504位核苷酸所示DNA和SEQ ID NO 3中第1534-2061位核苷酸所示DNA与Hfx. mediterranei Δ pyrF中的完整基因crtB发生同源重组，使缺失突变株Hfx. mediterranei Δ pyrF Δ crtB中缺失了基因crtB中的SEQ ID NO:3中第505-1533位核苷酸。3)单交换菌株与双交换菌株验证 PCR鉴定结果如图6B所示泳道I为双交换菌株扩增结果，泳道2为单交换菌株扩增结果，泳道3为pHFXA crtB质粒阳性对照，泳道4为Hfx. mediterranei Δ pyrF阴性对照。从图中看出，阴性对照的PCR产物大小2061bp，阳性对照的PCR产物大小1032bp，泳道2的PCR产物大小分别为1032bp和2061bp，说明单交换菌株鉴定正确，单交换菌株为pHFXΔ crtB质粒发生单交换整合入Hfx. mediterranei ApyrF基因组同源区域的重组菌株。泳道I的PCR产物大小为1032bp，说明双交换菌株鉴定正确。Southern blot鉴定结果，见图6C。泳道I为单交换菌株杂交结果，泳道2为双交换菌株杂交结果。泳道I的杂交条带为3481bp，泳道2的杂交条带为2452bp ;对照菌株Hfx. mediterranei ApyrF得到3481bp大片段。表明得到的单交换菌株和双交换菌株均正确。实施例5、效果验证实验组将pHFX Δ crtB转化Hfx. mediterranei Δ pyrF,筛选单交换菌株，得到的发生单交换的重组菌为目的重组子。转化方法及筛选方法与实施例4中所述一致。具体实验条件及结果如表I所示。对照组将pUBP ApyrF 转化地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)CGMCC1. 2087，筛选单交换菌株，得到的发生单交换的重组菌为目的重组子。转化方法及筛选方法与实施例2中所述一致。具体实验条件及结果如表I所示。以上实验均设3次重复，结果取平均值土标准差。重组率计算公式重组率=每板重组子数/转化所用质粒量。表I
权利要求
1.ー种重组嗜盐古菌，按照包括如下步骤的方法制备得到使含有SEQ ID N0:1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌。
2.根据权利要求I所述的重组嗜盐古菌，其特征在干所述含有SEQID N0:1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌为地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)。
3.根据权利要求I或2所述的重组嗜盐古菌，其特征在于所述使含有SEQID NO 1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的编码基因的功能丧失为敲除所述出发嗜盐古菌中的SEQ ID NO 1所示蛋白的编码基因； 和/或，所述敲除是通过同源重组实现的； 和/或，所述同源重组通过如下同源重组载体实现所述同源重组载体按照包括如下步骤的方法构建将SEQ ID NO 2中第1-602位核苷酸所示DNA沿着从KpnI至BamHI的方向插在载体pUBP的KpnI和BamHI位点间，得到的重组载体记作中间重组载体；将SEQID NO 2中第1419-1985位核苷酸所示DNA沿着从BamHI至PstI的方向插在载体pUBP的BamHI和PstI位点间，得到的重组载体即为所述同源重组载体； 和/或，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第611-1408位核苷酸所示DNA分子； 2)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第512-1408位核苷酸所示DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.ー种试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的重组嗜盐古菌和如下重组质粒载体；所述重组质粒载体中至少含有供外源基因插入的多克隆位点和如下其它三个元件在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQID NO I所不蛋白的编码基因的表达盒； 所述供外源基因插入的多克隆位点不与所述其它三个元件重叠。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述重组质粒载体按照包括如下步骤的方法制备得到将SEQ ID NO 2中第512-1408位核苷酸所示基因插在载体pUBP的多克隆位点间，得到的重组载体即为所述重组质粒载体。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括筛选培养基I和/或筛选培养基II ; 每I升所述筛选培养基I由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgSO4 · 7H20、KC1、FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水组成，其中各组分在所述筛选培养基I中的浓度为酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸钠I. Og/L、柠檬酸钠3. Og/L、NaC1200g/L、MgSO4 · 7H2020g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5_F0A250mg/L ;所述筛选培养基I的pH值为7· 1-7. 2 ； 每I升所述筛选培养基II由酸水解酪素、谷氨酸钠、柠檬酸钠、NaCl、MgS04 ·7Η20、Κ(1、FeSO4 ·7Η20、Μη(12 ·4Η20和水组成，其中各组分在所述筛选培养基II中的浓度为酸水解酪素 5. Og/L、谷氨酸钠 I. 0g/L、柠檬酸钠 3. 0g/L,NaCl 200g/L、MgSO4 · 7H2020g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L ;所述筛选培养基 II 的 pH 值为 7. 1-7. 2。
7.权利要求4-6中任一所述试剂盒在如下I)或2)或3)中的应用1)敲除权利要求1-3中任一所述重组嗜盐古菌的基因组中目的基因； 2)在权利要求1-3中任一所述重组嗜盐古菌中过表达外源基因； 3)研究菌(Haloferaxmediterranei)的基因组中待测基因的功能。
8.ー种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质 a)由SEQID NO 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将SEQID NO : I所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶活性的由a)衍生的蛋白质。
9.权利要求8所述蛋白的编码基因； 和/或，所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示1)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第611-1408位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第512-1408位核苷酸所示DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
10.含有权利要求9所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒； 和/或，SEQ ID NO :I所示蛋白的编码基因在基因工程中作为选择标记的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基于地中海富盐菌和pyrF基因的遗传操作系统及其应用。该遗传操作系统包括重组嗜盐古菌和重组质粒载体；重组嗜盐古菌按照包括如下步骤的方法制备得到使含有SEQ ID NO1所示蛋白的编码基因的出发嗜盐古菌中的SEQ IDNO1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到的重组菌为所述重组嗜盐古菌；重组质粒载体中至少含有如下元件在大肠杆菌中复制所需的复制原点、用于筛选大肠杆菌转化子的抗性选择标记基因的表达盒、SEQ ID NO1所示蛋白的编码基因的表达盒、供外源基因插入的多克隆位点。该遗传操作系统可作为一个高效的基因敲除系统，可以对Hfx.mediterranei进行广泛的基因功能研究和代谢途径阐明。实验证明，用本发明系统进行遗传转化获得阳性重组子的频率大大提高。
文档编号C12N1/15GK102676415SQ20111005445
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者刘海龙, 向华 申请人:中国科学院微生物研究所