盐孢菌酰胺及其使用方法

专利名称：盐孢菌酰胺及其使用方法
相关申请的交叉参考本申请要求基于2004年4月30日提交的美国申请序列号10/838,157和2003年6月20日提交的美国申请序列号10/600,854的优先权，这两个申请的名称均为“盐孢菌酰胺(salinosporamide)及其使用方法”。
资助信息本发明中部分是在政府支持下进行的，美国国立卫生研究院国家癌症研究所授予的批准号为CA44848。美国政府享有本发明的一定权利。
背景技术：
发明领域本发明一般涉及抗肿瘤剂，特别是涉及盐孢菌酰胺及其作为抗肿瘤剂的应用。
背景信息特征是细胞增生不受细胞生长正常控制的肿瘤类疾病，是人类死亡的一个主要原因。化疗的临床经验表明，希望有新的更有效的细胞毒素类药物来治疗这些疾病。的确，由于对转移到不同部位的新的肿瘤和癌细胞类型的识别，以及由于抗肿瘤治疗方案作为一种主要的和附加的癌症医学疗法的有效性，抗肿瘤剂的使用已经增加。由于抗肿瘤剂是细胞毒素(对细胞有毒)，因此它们不仅会干扰肿瘤细胞的生长，而且也会干扰正常细胞的生长。抗肿瘤剂对肿瘤细胞的作用要大于对正常细胞的作用，原因是肿瘤细胞的生长很快。因此，抗肿瘤剂所作用的正常组织细胞是快速分裂的细胞，如骨髓(在低血细胞计数中见到)，毛囊(以脱发方式见到)以及GI粘膜上皮(引起恶心，呕吐，丧失食欲，腹泻)。通常，抗肿瘤剂具有任何种类的人类用药的最低治疗指数，从而产生了对生命造成威胁的重大潜在毒性。某些通常使用的抗肿瘤剂对特异性组织具有独特而急性的毒性。例如，长春花属生物碱对神经组织有重大毒性，而阿霉素对心脏组织有特异性毒性，博来霉素对肺部组织具有毒性。因此，对于有效抑制高增生性细胞的增生，同时具有低于现有抗肿瘤剂的IC50值，从而导致潜在的严重副作用显著下降的抗肿瘤剂，仍存在继续的需求。
发明概述本发明基于海洋放线菌菌株CNB392和CNB476的某些发酵产物是高增生性哺乳动物细胞的有效抑制剂这一发现。CNB392和CNB476菌株存在于小单孢菌科中，而且盐孢菌(Salinospora)这一属名(generic epithet)已经被提议用于这种专性海洋族群。由这种菌株产生的反应产物被归为盐孢菌酰胺，在治疗肿瘤疾病方面特别有效，这是由于其具有低分子量、低IC50值、高药效，以及癌细胞对真菌的选择性。在本发明的一种实施方式中，提供了具有结构(I)的化合物 其中
R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基(thioalkyl)，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基(oxyacyl)，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；E1至E4各自独立地为-O，-NR5或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；且x为0到8。在本发明的进一步实施方式中，提供了具有结构(II)的化合物 其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；
E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；以及x为0到8。在本发明的另一种实施方式中，提供了具有结构(III)的化合物 其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基，每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基，E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基，以及x为0到8。在本发明的又一种实施方式中，提供了具有结构(IV)的化合物
在本发明的另一种实施方式中，提供了具有结构(V)的化合物 在本发明的另一种实施方式中，提供了具有结构(VI)的化合物
在另一种实施方式中，提供了一种药物组合物，其包括存在于药学上可接受的载体中的至少一种结构I-VI的化合物。在另一种实施方式中，提供了制品，其包括包装材料和装在包装材料内的药物组合物，其中该包装材料包括指明该药物组合物可用于治疗细胞增生性疾病的标签，以及其中该药物组合物包括至少一种结构I-VI的化合物。在又一种实施方式中，提供了一种治疗哺乳动物细胞增生性疾病的方法。这样的方法可通过例如将治疗有效量的结构I-VI的化合物向所需的患者给药的方式进行。在另外的实施方式中，提供了制备结构I-VI的化合物的方法，该化合物具有抑制高增生性哺乳动物细胞增生的能力。这样的方法可通过例如对盐孢菌种的菌株CNB392(ATCC#＿＿＿)或CNB476(ATCC PTA-5275)培养物进行培养，并从该培养物中分离出结构I的至少一种化合物的方式进行。
附图简要说明

图1示出了本发明示例性化合物盐孢菌酰胺A的化学结构，其具有相对的立体化学。图2示出了说明“盐孢菌”系统发育的系统树。图3示出了用于治疗几种人类癌症的抗肿瘤剂，足叶乙甙的化学结构。图4比较了盐孢菌酰胺A和足叶乙甙的细胞毒素活性和剂量响应曲线。图5是描绘用于分离盐孢菌酰胺A的示例性分离方案的方块图。图6-14是用于阐明盐孢菌酰胺A结构的NMR，IR和UV光谱数据。图15是菌株CNB392和CNB476在其16S rDNA内具有的标记核苷酸，该标记核苷酸使这些菌株与小单孢菌科中的其它成员在系统发育学上区分开来。图16示出了本发明示例性化合物盐孢菌酰胺A(结构V)的化学结构，其具有绝对的立体化学。图17绘出了盐孢菌酰胺A的最终X-射线结构的ORTEP图(热椭圆形点图)，描述了其绝对立体化学。
发明详述在一种实施方式中，提供了具有结构(I)的化合物
其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；以及x为0到8。在本发明的进一步实施方式中，提供了具有结构(II)的化合物 其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；
E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；以及x为0到8。在一种实施方式中，提供了具有结构(III)的化合物 其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基，每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基，E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基，以及x为0到8。在本发明的又一种实施方式中，提供了具有结构(IV)的化合物
在本发明的另一种实施方式中，提供了具有结构(V)的化合物 在本发明的另一种实施方式中，提供了具有结构(VI)的化合物
此处所用的术语″烷基″是指具有1至约12个碳原子的单价直链或支链烃基，包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正己基，和类似基团。此处所用的术语″取代烷基″是指带有一个或多个取代基的烷基，这些取代基选自羟基，烷氧基，氢硫基，环烷基，取代环烷基，杂环基，取代杂环基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，芳氧基，取代芳氧基，卤素，氰基，硝基，氨基，酰胺基，-C(O)H，酰基，氧酰基，羧基，磺酰基，氨磺酰，砜基，和类似基团。此处所用的术语″低级烷基″是指具有1至约6个碳原子的烷基。此处所用的术语″链烯基″是指具有一个或多个碳碳双键以及约2至12个碳原子的直链或支链烃基，以及″取代链烯基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的链烯基。此处所用的术语″炔基″是指具有至少一个碳碳叁键以及约2至约12个碳原子的直链或支链烃基，而″取代炔基″是指进一步带有上述一个或多个取代基的炔基。此处所用的术语″芳基″是指具有6至14个碳原子的芳香基团，而″取代芳基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的芳基。此处所用的术语″杂芳基″是指含有一个或多个杂原子(例如N，O，S或类似原子)作为环结构一部分，以及具有3至14个碳原子的芳香基团，而″取代杂芳基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的杂芳基。此处所用的术语″烷氧基″是指-O-烷基-部分，其中烷基如上定义，而″取代烷氧基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的烷氧基。此处所用的术语″硫烷基″是指-S-烷基-部分，其中烷基如上定义，而″取代硫烷基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的硫烷基。此处所用的术语″环烷基″是指具有约3至约8个碳原子的含环烷基，而″取代环烷基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的环烷基。此处所用的术语″杂环基″是指具有一个或多个杂原子(例如N，O，S或类似原子)作为环结构一部分以及具有3至14个碳原子的环状(即含环)基团，而″取代杂环基″是指进一步带有一个或多个上述取代基的杂环基。在一些实施方式中，提供了结构I-III的化合物，其中E1，E3和E4为-O，而E2为-NH。在一些实施方式中，提供了结构I-III的化合物，其中R1和R2为-H，烷基或取代烷基，而R3为羟基或烷氧基。在一些实施方式中，R1为取代烷基。预期使用的示例性取代烷基包括卤化烷基，例如诸如氯化烷基。本发明的化合物可被配制成天然形式或盐形式的药物组合物。药学上可接受的非毒性盐包括碱加成盐(base addition salt)(采用自由羧基或其它阴离子基团形成)，其可来源于无机碱，例如钠，钾，铵，钙，或铁的氢氧化物，以及有机碱，例如异丙基胺，三乙基胺，2-乙基氨基-乙醇，组氨酸，普鲁卡因，和类似物。这类盐也可以用任何的自由阳离子基团形成为酸加成盐，通常是用无机酸如盐酸，硫酸或磷酸，或有机酸如乙酸，对甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，酒石酸，苦杏仁酸，和类似酸。本发明的盐包括采用无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸和类似酸对氨基基团进行质子化而形成的胺盐。本发明的盐也包括采用合适的有机酸如对甲苯磺酸、乙酸和类似酸对氨基基团进行质子化而形成的胺盐。本发明实践中预期采用的其它赋形剂是本领域普通技术人员可获知的那些赋形剂，如在United States Pharmacopeia Vol.XXII和National Formulary Vol.XVII，U.S.Pharmacopeia Convention，Inc.，Rockville，MD(1989)中可见到的那些赋形剂，这里将这些文献的相关内容引入作为参考。根据本发明的化合物可包含一个或多个不对称碳原子，因此可存在为外消旋物或外消旋混合物、单个的对映体、非对映异构混合物和单独的非对映异构体。术语″立体异构体″是指分子中不同基团仅在空间取向上互不相同的化合物。立体异构体具有相同的分子量，化学组成，以及结构，但原子的组合方式不同。也就是说，某些相同的化学部分在空间取向上有所不同，因此，当为纯化合物时，该化合物具有旋转偏振光平面的能力。然而，一些纯立体异构体的旋光度很小，以至于采用目前的仪器探测不到。这些化合物的所有这类异构体形式都清楚地包含在本发明的范围内。每个立体型的碳可以具有R或S构型。尽管本申请中举例的具体化合物被以特定的构型描绘，但也想象得出在任何给定的手性中心处具有相反立体化学的化合物或它们的混合物。当在本发明的衍生物中发现手性中心时，应该理解，本发明涵盖了所有可能的立体异构体。术语″光学纯的化合物″或″光学纯的异构体″是指手性化合物的单一立体异构体，而不管化合物的构型如何。本发明示例性的结构I化合物如下所示
盐孢菌酰胺A的分子结构中具有可被化学修饰以制造合成衍生物的各种官能团(内酯，卤代烷，酰胺，羟化物)。因此，示例性的本发明化合物盐孢菌酰胺A具有优异的形成合成和半合成衍生物的引导性结构。确实，可对盐孢菌酰胺A进行衍生以改进药物代谢动力学和药效学性质，这使得衍生物易于给药并增加了其作为抗肿瘤剂的利用度。对本发明的盐孢菌酰胺化合物进行化学修饰而制得本发明范围内的其它化合物的方法是本领域普通技术人员可获得的。在HTC-116细胞分析试验中，盐孢菌酰胺A显示出对人类结肠癌细胞具有强的细胞毒素活性。IC50值为11ng/mL，这几乎超过足叶乙甙(参见图3，IC50值为828ng/mL)的活性达2个数量级(参见图4)，足叶乙甙是一种用于治疗多种癌症的抗癌药物。这种高活性使本发明的盐孢菌酰胺成为用于治疗各种人类癌症的优异候选物，尤其是减慢了目前尚无治疗方案的顽固癌(refractile cancers)的生长。盐孢菌酰胺A对抑制哺乳动物细胞具有特效，对白念珠菌(Candida albicans)的抗真菌活性很小(IC50 250μg/mL)，且不具有抗细菌活性(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，尿肠球菌(Enterococcus faecium))。盐孢菌酰胺A的IC50远远低于目前已在使用或处于临床试验中的最强化疗剂。盐孢菌酰胺A是海洋放线菌菌株CNB392和CNB476的发酵产物。这些菌株是放线菌目的成员，其为高G+C革兰氏阳性菌。CNB392和CNB476的新颖性在于属这一级别上。这里所述的发明化合物由某些″盐孢菌″种产生。在一些实施方式中，本发明的化合物由″盐孢菌″种的菌株CNB392和CNB476产生。为此，根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于2003年6月20日将″盐孢菌″种的CNB392和CNB476菌株保藏在位于12301Parklawn Drive，Rockville，Md.20852U.S.A.的美国模式菌种收集中心的专利菌种存放处，ATCC保藏号分别为＿＿＿和PTA-5275。如同其它生物体的情况，″盐孢菌″种的特征易于变化。例如，可采用各种已知的物理和化学诱变剂，如紫外线、X-射线、γ-射线和N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍，进行处理，可得到特定菌株的重组体、变异体或突变体。保留了产生本发明化合物这个特性的特定菌株的所有天然的和诱发的变异体、突变体和重组体都落入本发明的范围内。本发明的化合物可例如通过细菌发酵而制备，其产生的化合物的量足以用于开发药物和用于临床试验。在一些实施方式中，本发明的化合物是通过在AlBfe+C或CKA-液体介质中对放线菌菌株CNB392和CNB476进行发酵而产生的。培养介质中还应该包括培养物生长和发育所必需的基本痕量元素。这类痕量元素在介质的其它组分中作为杂质存在，其存在量足以满足生物体的生长要求。如果发泡变成问题，需要向大规模的培养介质中加入少量的(即0.2mL/L)消泡剂如聚丙二醇(M.W.约为2000)。通过将有机代谢物吸附到安珀莱特(amberlite)XAD-16树脂上，使有机代谢物分离。例如，采用甲醇∶二氯甲烷1∶1洗脱XAD-16树脂而分离出盐孢菌酰胺A，每升培养物中得到的粗提取物为约105mg。然后采用反相快速色谱法，接着采用反相HPLC和正相HPLC，从初提取物中分离盐孢菌酰胺A，获得6.7mg盐孢菌酰胺A。图5给出了本发明化合物分离和分开方案的方块图。采用各种NMR技术、质谱、IR和UV光谱对盐孢菌酰胺A的结构进行解析，如图6-14所示。盐孢菌酰胺A的绝对结构，以及对盐孢菌酰胺A的整体结构的确认是采用单晶体X-射线衍射分析获得的(参见实施例3)。本发明还提供了包括包装材料和装在包装材料内的药物组合物的制品，其中所述的包装材料包括说明药物组合物可用于治疗癌症的标签，及其中所述的药物组合物包括本发明的化合物。因此，一方面，本发明提供了一种包括本发明化合物的药物组合物，其中所述的化合物的浓度为有效治疗细胞增生性疾病的浓度。本领域的普通技术人员可例如根据标准治疗方案或采用动物体内试验来确定该浓度。用作本发明制品的构成部分的药物组合物可以以固体、溶液、乳液、分散系、胶束、脂质体的形式和类似形式使用，其中最终的组合物含有一种或多种作为活性成分的本发明化合物，与适于经肠或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂相混合。用作本发明制品的构成部分的化合物可以例如与常规的无毒性药学可接受载体结合，形成片剂、颗粒剂、胶囊、栓剂、溶剂、乳液、悬浮液，以及其它适用的剂型。可以采用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、白明胶、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅胶、马铃薯淀粉、脲、中等链长的甘油三酯、右旋糖酐以及其它适于制备固体、半固体或液体形式制剂的载体。此外也可采用辅剂、稳定剂、增稠剂和着色剂以及香味剂。本发明的组合物可包含下述的其它治疗剂，并且例如，可采用常规的固体或液体载体或稀释剂，以及适于所需给药方式的药物添加剂类型(例如，赋形剂，粘结剂，防腐剂，稳定剂，调味剂等)，根据药物配制领域公知的技术，进行配制。本发明的药物组合物可以采用任何合适的方式给药，如口服给药，诸如以片剂、胶囊、颗粒或粉末形式；舌下给药；口腔给药；肠胃外给药，诸如通过皮下、静脉内、肌肉或脑池内的注射或输注技术(如作为无菌注射性水性或非水性溶液或悬浮液)；鼻腔给药，诸如通过吸入喷剂；局部给药，诸如采用乳膏或药膏形式；或者直肠给药，诸如以栓剂形式；以含有无毒性药学可接受载体或稀释剂的单位剂量制剂的形式。本发明的化合物可以例如以适于立即释放或延迟释放的形式进行给药。可采用包括本发明化合物的适当药物组合物，或者，特别在延迟释放的情况下，可采用装置，如皮下输注装置或渗透泵，实现立即释放或延迟释放。本发明的化合物也可以脂质体方式进行给药。本发明还提供了采用发明的结构(I)-(VI)的盐孢菌酰胺化合物来抑制哺乳动物细胞增生的方法，该方法是通过使这些细胞与其量足以抑制哺乳动物细胞增生的本发明盐孢菌酰胺化合物相接触而实现的。一种实施方式是抑制高增生性哺乳动物细胞增生的方法。在本发明中，″高增生性哺乳动物细胞″是指不受生长的特性限制，如编程性细胞死亡(细胞凋亡)的哺乳动物细胞。另一种优选实施方式是哺乳动物细胞为人类细胞时。本发明还提供了使哺乳动物细胞和至少一种本发明的盐孢菌酰胺化合物以及至少一种其它的抗肿瘤剂相接触的方法。在另一种实施方式中，提供了治疗哺乳动物细胞增生性疾病的方法，该方法包括给予患者所需的治疗有效量的结构(I)-(VI)的化合物。可采用本发明的方法有效治疗的细胞增生性疾病包括以肿瘤的形成为特征的疾病。如此，本发明的化合物就是抗肿瘤剂。此处所用的术语″肿瘤的″涉及异常生长的肿瘤，这类生长的发生是由于细胞增生不受到生长的通常限制。此处所用的术语″抗肿瘤剂″是抑制、消除、阻碍、或逆转细胞的肿瘤表型的任何化合物、组合物、混合物、共混物或掺和物。在一些实施方式中，肿瘤选自乳腺肿瘤，小细胞肺部肿瘤，非小细胞肺部肿瘤，结直肠肿瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中枢神经系统(CNS)肿瘤，卵巢肿瘤，前列腺肿瘤，软组织或骨肉瘤，头颈部肿瘤，包括甲状腺和非何杰金氏病的胃癌，胃部肿瘤，骨髓瘤，膀胱肿瘤，肾部肿瘤，包括甲状腺和非何杰金氏和何杰金氏病的神经内分泌性肿瘤。在一种实施方式中，肿瘤是结直肠肿瘤。目前癌症治疗中使用化疗，外科手术，放疗，采用生物反应调节剂进行的治疗，以及免疫疗法。每种治疗方式都有本领域普通技术人员公知的特异性适应症，可采用一种疗法或所有疗法实现肿瘤细胞的全部毁灭。本发明提供了利用一种或多种本发明盐孢菌酰胺的化疗法。而且，本发明也提供了联合利用本发明的盐孢菌酰胺化合物和其它抗肿瘤剂的联合化疗法，该联合化疗法一般比采用单独一种抗肿瘤剂更有效。因此，本发明的再一方面提供了组合物，其包括治疗有效量的至少一种本发明盐孢菌酰胺化合物与至少一种抗肿瘤剂。这类组合物也可与生理学容许的液体，凝胶或固体载体，稀释剂，辅剂和赋形剂一起提供。这类载体，稀释剂，辅剂和赋形剂可在United StatesPharmacopeia Vol.XXII和National Formulary Vol.XVII，U.S.Pharmacopeia Convention，Inc.，Rockville，Md.(1989)中找到，这里将其内容引入作为参考。其它的治疗方法可参见AHFS DrugInformation，1993版，美国医院处方服务机构(American HospitalFormulary Service)编辑，第522-660页，在此将其内容引入作为参考。可与本发明的盐孢菌酰胺化合物联合使用的抗肿瘤剂包括TheMerck Index，11th ed.Merck & Co.，Inc.(1989)pp.Ther 16-17中提供的那些抗肿瘤剂，在此将其内容引入作为参考。在本发明的进一步实施方式中，抗肿瘤剂可以是抗代谢物，其包括但不限于氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-氢硫基嘌呤，阿糖胞苷，羟基脲，以及2-氯脱氧腺苷。在本发明的另一种实施方式中，预期的抗肿瘤剂是烷基化试剂，其可包括但不限于环磷酰胺，美法仑，白消安，伯尔定(Paraplatin)，苯丁酸氮芥，以及氮芥。在本发明的进一步实施方式中，抗肿瘤剂是植物生物碱，其包括但不限于长春新碱，长春花碱，紫杉醇，以及足叶乙甙。在本发明的进一步实施方式中，预期的抗肿瘤剂是抗生素，其包括但不限于亚德里亚霉素(阿霉素)，道诺霉素，丝裂霉素c，以及博来霉素。在本发明的进一步实施方式中，预期的抗肿瘤剂是激素，其包括但不限于卡普睾酮，diomostavolone，丙酸酯，环硫雄醇，美雄烷，睾内脂，三苯氧胺，聚磷酸雌二醇，醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)，氟他胺，尼鲁米特，以及trilotane。在本发明的进一步实施方式中，预期的抗肿瘤剂包括酶或氨基吖啶衍生物，其中酶可包括但不限于左旋门冬酰胺酶，而氨基吖啶衍生物可包括但不限于安吖啶。其它的抗肿瘤剂包括Skeel，Roland T.，″Antineoplastic Drugs and Biologic ResponseModifierClassification，Use and Toxicity of Clinically Useful Agents，″Handbook of Cancer Chemotherapy(3rd ed.)，Little Brown & Co.(1991)中所述的那些抗肿瘤剂，在此将其内容引入作为参考。除了例如人类的灵长类动物之外，本发明的方法也可用于治疗各种其它的哺乳动物。例如，可被治疗的哺乳动物包括但不限于母牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，豚鼠，大鼠或其它的牛科，绵羊科，马科，犬科，猫科，啮齿目或鼠科动物。术语″治疗有效量″是指主题化合物的用量，其能引起研究者、兽医、医生或其它临床医生所探寻的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应，例如减轻细胞增生性疾病的影响/症状。术语″药学上可接受的″是指载体，稀释剂或赋形剂必须和制剂中的其它成分相容，并且对其接受者无害。术语″给予(administration of)″和或″提供(administering a)″化合物应该理解为，向需要治疗的个体提供本发明的化合物。给予本发明化合物可以在其它治疗剂或其它抗肿瘤剂给药之前、同时或之后进行。为进行本发明化合物给药的药物组合物可方便地以单位剂型存在，并且可采用制药领域任何公知的方法进行制备。所有的方法都包括使活性组分和载体结合的步骤，该载体构成了一种或多种辅助的组分。通常，药物组合物是通过将活性组分和液体载体或细分的固体载体或两者均匀紧密地结合，必要时再将产物制成所需制剂形式而制备的。在药物组合物中，活性目标化合物的含量足以产生对病程或病况的预期效果。含有活性组分的药物组合物可以为适合口服的剂型，如片剂，小药锭，锭剂，水性或油性悬浮液，可分散粉末或颗粒，乳液，硬或软胶囊，或糖浆或酏剂。用于口服的组合物可根据药物组合物制备领域公知的任何方法制备得到，并且这类组合物可含有选自甜味剂，调味剂，着色剂和防腐剂的一种或多种试剂，以获得药学上精致和可口的制剂。片剂含有活性组分，其与适于制造片剂的非毒性药学可接受赋形剂相混合。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；成粒和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘结剂，例如淀粉，白明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石。片剂可为未包衣的，也可采用已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而获得较长时间的持续作用。例如，可采用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可对片剂进行包衣而形成可控制释放的渗透性治疗片剂。用于口服的制剂也可以硬明胶胶囊存在，其中活性组分和惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土相混合；或者可以软明胶胶囊存在，其中活性组分与水或油介质如花生油，液体石蜡或橄榄油相混合。水性悬浮液含有活性材料，该活性材料与适于制造水性悬浮液的赋形剂相混合。这类赋形剂有悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯-吡咯烷酮，黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂，可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物，如聚环氧乙烷硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，如十七亚乙氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，如聚环氧乙烷山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物，如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液也可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。油性悬浮液可通过将活性组分悬浮于植物油如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油，或悬浮于矿物油如液体石蜡中而配制得到。油性悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡，硬石蜡或鲸蜡醇。可加入上述的甜味剂和调味剂以获得可口的口服制剂。可加入抗氧剂如抗坏血酸以保存这些组合物。适于通过加入水而制得水性悬浮液的可分散粉末和颗粒中含有与分散或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂预混合的活性组分。合适的分散或润湿剂以及悬浮剂的例子已在上文中列举。也可存在其他的赋形剂，例如甜味剂，调味剂和着色剂。可采用甜味剂，例如甘油，丙二醇，山梨糖醇或蔗糖配制成糖浆或酏剂。这类制剂还可含有缓和剂，防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌的可注射水性或油性悬浮液形式。该悬浮液可采用上述合适的分散或润湿剂以及悬浮剂，按照本领域的方法配制而成。无菌的可注射制剂也可以是存在于无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如存在于1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受载体和溶剂中有水、Ringer′s溶液(林格氏液)和氯化钠等渗溶液。此外，无菌的不挥发性油通常也可用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用包括合成的单-或二甘油酯在内的无刺激性不挥发性油。另外，脂肪酸如油酸也可用于制备可注射制剂。本发明的化合物也可以直肠给药的栓剂形式给药。这些组合物可通过将药物和合适的非刺激性赋形剂相混合而制得，其中的非刺激性赋形剂在常温下是固态，但在直肠温度下是液态，从而在直肠中融化而释放出药物。这类材料是可可油和聚乙二醇。在局部使用的情况下，可采用含有本发明化合物的乳膏、油膏、凝胶剂、溶液或悬浮液等。本发明的化合物和组合物可以与其他治疗剂相同的方式，在例如针对家畜的兽医应用中或针对人类的临床应用中向哺乳动物给药。一般来说，达到疗效所要求的剂量会随着应用类型和给药方式，以及单个主体的具体要求而有所不同。通常，剂量范围为主体体重的约0.001到1000μg/kg，更通常为主体体重的0.01到10μg/kg。可选地，这些范围内的剂量可在延长的时间段内，通常在超过24小时的时间段内进行持续输注，直到达到期望的治疗效果。然而，应该理解，对任何具体患者的具体剂量水平和剂量频率可以是不同的，并取决于各种因素，包括所采用的具体化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用时间长短，年龄，体重，一般健康状况，性别，食欲，给药方式和时间，排泄率，联合用药情况，具体病症的严重性，以及受治疗的主体。现在将参照以下非限定性实施例对本发明做更详细的描述。
实施例方法和材料HPLC-本发明化合物的纯化是在C18-固体相(Aldrich)上进行RP-MPLC法，在Kontes Flex-柱(15×7mm)上采用分步梯度而完成的。半制备性HPLC是在等度HPLC系统上进行的，该系统的正相柱Si-Dynamas-60(250×5mm)或反相柱C18-Dynamax-60上带有Waters泵6000H，流速为2mL/分钟，并带有差示折射率检测仪Waters R401。LC-MS-LC-MS色谱分析是在带有DAD和MSD 1100检测的Hewlett-Packard系统系列HP1100上进行的。在反相C18柱(AgilentHypersil ODS 5μm，柱尺寸为4.6×100mm)上进行分离，流速为0.7mL/分钟，采用的标准梯度为10％乙腈，15分钟；98％乙腈(Burdick &Jackson高纯度溶剂)。MS-检测是在ESI正离子模式下进行的，毛细管电压为3500eV，碎裂电压为70eV，质量范围m/z为100-1000。APCI-模式在流速为0.5mL/分钟、正离子检测、毛细管电压为3000eV、碎裂电压为70eV的条件下测定。NMR-NMR谱是在对1H或2D-NMR谱具有反相模式的Varian300MHz梯度场光谱仪上测得的。13C和DEPT谱是在Varian 400MHz的宽谱带仪器上测得的。参照物是内标四甲基硅烷(TMS，0.00ppm)。MS-EI-低分辨率MS-EI光谱是在带有扇形磁场设备(magneticsector field device)的Hewlett-Packard质谱仪上测得的，以20℃/分钟的加热速率升温到320℃，并直接注入进样。FTMS-MALDI-高分辨MS数据是在IonSpec Ultima FT质谱仪上以MALDI操作模式获得的。IR-红外光谱是在Perkin-Elmer FT红外光谱仪上采用NaCl窗测得的。
实施例1″盐孢菌″种的分离和表征培养物编号为CNB392和CNB476CNB392和CNB476在其16S rDNA内具有标记核苷酸，这在系统发育学上将这些菌株与所有其他的小单孢菌科成员区分开来(参见图15)。这些标记核苷酸已经被确认为是这组成员的决定性标记物，该组成员对钠也具有生理学生长需求。利用Ribosomal Database Project中1-31-01上所有存在的小单孢菌科成员将标记核苷酸排列到大肠杆菌(E.coli)位27-1492上。对″盐孢菌″分化枝，45个部分测序的形态型显示出所有来自位置207-468的标记核苷酸。这七个几乎全部测序的″盐孢菌″分离物(参见图2)显示出图15中的全部标记。菌株CNB392和CNB476在琼脂上形成了鲜橙色至黑色的菌落，并且不存在气生菌丝体。取决于细胞的生长阶段，产生了深棕色和鲜橙色的可扩散色素。孢子使菌落表面变黑，并负载在基质菌丝体上。营养菌丝体被微细地分支且并不分裂成碎片。孢子被单独地或成群地产生。对这些菌株，既没有观察到孢子囊的游动性，也没有观察到孢子的游动性。CNB392和CNB476对钠具有专性生长需求，不会在用于维持小单孢菌科其它属成员的通常介质中生长。已发现，CNB392和CNB476于30℃下在固体介质TCG或M1上最佳地生长。
TCG3g胰蛋白胨M110克淀粉5克酪胨 4克酵母提取物4克葡萄糖 2克蛋白胨18克琼脂(任选) 18克琼脂(任选)1升过滤海水 1升过滤海水发酵于35℃下，在1升的摇动AlBfe+C或CKA-液体介质中培养CNB392和CNB476达9天。4天之后，加入20克Amberlite XAD-16树脂(Sigma，非离子型聚合物吸附剂)。
AlBfe+C10克淀粉 CKA 5克淀粉4克酵母提取物 4mL水溶性物(50％)2克蛋白胨 2克鲱鱼粉1克CaCO32克海藻粉5mL KBr(水溶液，20g/l) 2克壳聚糖5mL Fe2(SO4)3×4H2O(8g/l) 1升过滤海水
1升过滤海水提取过滤XAD-16树脂，并先用1升乙酸乙酯，再用1升甲醇洗脱有机提取物。然后，用乙酸乙酯(3×200mL)提取滤液。XAD吸收的粗提取物为105mg。对人类结肠癌细胞HCT-116的分析试验得到的细胞毒性为IC50＜0.076μg/mL。
从CNB392分离出盐孢菌酰胺A在C 18反相(RP)色谱上采用分段梯度，对粗提取物进行快速色谱分析(图5)。HCT-116分析获得了两种活性级分，CNB392-5和CNB392-6。然后，在等度的RP-HPLC上对合并的活性级分(51.7mg，HCT-116＜0.076μg/mL)进行色谱分析，采用流速为2mL/分钟的85％甲醇作为洗脱液，并采用折射率检测。采用流速为2mL/分钟的乙酸乙酯∶异辛烷(9∶1)，在等度正相HPLC的硅胶上纯化活性级分CNB392-5/6(7.6mg，HCT-116＜0.076μg/mL)。分离出的盐孢菌酰胺A(图1)是无色的无定形固体，产率为每升6.7mg(6.4％)。在硅胶上进行的TLC分析(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)表明，盐孢菌酰胺A的rf＝0.6，在256nm处无UV消光或荧光，采用H2SO4/乙醇时是黄色，采用Godin试剂(香兰素/H2SO4/HClO4)时是暗红棕色。盐孢菌酰胺A可溶解于CHCl3，甲醇，以及其它极性溶剂如DMSO，丙酮，乙腈，苯，吡啶，N，N-二甲基甲酰胺和类似溶剂。1HNMR(d5-吡啶，300MHz)1.37/1.66(2H，m，CH2)，1.70，2.29(2H，m，CH2)，1.91(2H，宽，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，2.32/2.48(2H，ddd，3J＝7.0Hz，CH2)，2.85(1H，宽，m，CH)，3.17(1H，dd，3J＝10Hz，CH)，4.01/4.13(2H，m，CH2)，4.25(1H，d，3J＝9.0Hz，CH)，4.98(1H，宽，OH)，5.88，(1H，ddd，3J＝10Hz，CH)，6.41(1H，宽d，3J＝10Hz，CH)10.62(1H，s，NH).13C NMR/DEPT(d5-吡啶，400MHz)176.4(COOR)，169.0(CONH)，128.8(＝CH)，128.4(＝CH)，86.1(Cq)，80.2(Cq)，70.9(CH)，46.2(CH)，43.2(CH2)，39.2(CH)，29.0(CH2)，26.5(CH2)，25.3(CH2)，21.7(CH2)，20.0(CH3)
LC-MS(ESI)tr＝10.0分钟，流速0.7mL/分钟m/z(M+H)+314，(M+Na)+336；片段(M+H-CO2)+292，(M+H-CO2-H2O)+270，252，204.Cl图样(M+H，100％)+314，(M+H，30％)+316.
LC MS(APCI)tr＝11.7分钟，流速0.5mL/分钟，m/z(M+H)+314，片段(M+H-CO2-H2O)+270，252，232，216，160.Cl图样(M+H，100％)+314，(M+H，30％)+316.
EIm/z269，251，235，217，204，188(100％)，160，152，138，126，110，81.
FTMS-MALDIm/z(M+H)+314.1144FT-IR(cm-1)2920，2344，s，1819m，1702s，1255，1085s，1020s，797s.
分子式C15H20ClNO4，实施例2生物活性分析试验盐孢菌酰胺A对人类结肠癌细胞具有很强的活性，IC50值为0.011μg/mL(参见图4)。对抗细菌或抗真菌活性的筛选表明没有明显的活性，参见表1。
表1分析试验盐孢菌酰胺 A的IC50(μg/mL)HCT-116 0.011白色念珠菌 250白色念珠菌(耐两性霉素 NSA*B)
金黄色葡萄球菌(耐甲NSA*氧西林)尿肠球菌(耐万古霉素) NSA*NSA*＝无明显活性实施例3绝对立体化学的测定结构I的化合物从乙酸乙酯/异辛烷中结晶，得到单个立方晶体，其作为单斜晶系P2(1)进行衍射。3009不寻常的大单胞体积内容纳了四个独立的分子，其中对柔性氯乙基取代基，观察到不同的构象位置。从氯取代基的衍射各向异性，指定绝对结构，分辨出盐孢菌酰胺A的绝对立体化学为2R，3S，4R，5S，6S(图16和17)，Flack参数为0.01，而esd为0.03。尽管参照上述实施例，对本发明展开了描述，但应该理解，修饰和改变均落入本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受限于所附权利要求书。
权利要求
1.一种具有结构(I)的独立化合物 其中R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；以及X为0至8；限制性条件是所述独立化合物不具有化合物(VI)的结构
2.根据权利要求1所述的化合物，其中E1，E3和E4为-O，及E2为-NH。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2为-H、烷基或取代烷基，和R3为羟基或烷氧基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为取代烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述的取代烷基为卤化烷基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述的卤化烷基为氯化烷基。
7.药物组合物，包括权利要求1所述的至少一种化合物，该化合物存在于药学上可接受的载体中。
8.一种用来抑制高增生性哺乳动物细胞增生的药物组合物，其包括有效量药学上可接受的载体和权利要求1所述的化合物，限制性条件是所述化合物不具有化合物(V)的结构
9.根据权利要求8所述的药物组合物，进一步包括至少一种另外的抗肿瘤剂。
10.一种治疗哺乳动物细胞增生性疾病的方法，其包括将治疗有效量的具有结构(I)的化合物提供给需要的患者 R1至R3各自独立地为-H，烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫烷基，取代硫烷基，羟基，卤素，氨基，酰胺基，羧基，-C(O)H，酰基，氧酰基，氨基甲酸酯，磺酰基，氨磺酰，或砜基；每个R4独立地为烷基，取代烷基，链烯基，取代链烯基，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，环烷基，取代环烷基；E1至E4各自独立地为-O，-NR5，或-S，其中R5为-H或C1-C6烷基；以及X为0至8；从而治疗哺乳动物细胞增生性疾病，限制性条件是所述化合物不具有化合物(VI)的结构
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人的。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述疾病的特征是肿瘤形成。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤选自乳腺肿瘤，小细胞肺部肿瘤，非小细胞肺部肿瘤，结直肠肿瘤，白血病，黑素瘤，胰腺癌，中枢神经系统(CNS)肿瘤，卵巢肿瘤，前列腺肿瘤，软组织或骨肉瘤，头颈部肿瘤，包括甲状腺非何杰金氏病在内的胃癌，胃部肿瘤，骨髓瘤，膀胱肿瘤，肾部肿瘤，包括甲状腺和非何杰金氏及何杰金氏病在内的神经内分泌性肿瘤。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤是结直肠肿瘤。
全文摘要
本发明是基于如下发现海洋放线菌菌株CNB392和CNB476的某些发酵产物是高增生性哺乳动物细胞的有效抑制剂。CNB392和CNB476菌株存在于小单孢菌科中，而且盐孢菌这一属名已经被提议用于这种专性海洋族群。由这种菌株产生的反应产物被归为盐孢菌酰胺，在治疗肿瘤疾病方面特别有效，这是由于其具有低分子量、低IC50值、高药效，以及癌细胞对真菌的选择性。
文档编号C07D491/04GK1823070SQ200480020530
公开日2006年8月23日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月20日
发明者W·H·费尼科, P·R·詹森, T·J·明瑟, R·H·R·费林格 申请人:加利福尼亚大学董事会