非糖基化人甲胎蛋白、制备方法及其应用的制作方法

专利名称：非糖基化人甲胎蛋白、制备方法及其应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及非糖基化人甲胎蛋白、其在转基因动物和植物中的制备方法及其应用。
甲胎蛋白(AFP)是一种70kDa糖蛋白，由卵黄囊和胎肝产生。AFP在胎儿血清中的含量为毫克水平，在出生时，下降至纳克水平，在成人血清中通常也是纳克水平；当成人血清中AFP水平升高时，表明有卵黄囊肿瘤、肝细胞瘤或肝脏再生。AFP在胎儿发育期间的作用尚不清楚，尽管已经知道AFP保护妊娠中的胎儿免遭母体免疫攻击或者免遭母体雌激素的影响。
体外和体内实验证明，AFP既具有细胞生长刺激活性又具有细胞生长抑制活性，这取决于靶细胞、AFP相对浓度和其它细胞因子和生长因子的存在。例如，AFP可抑制多种肿瘤细胞的生长，具体地讲，抑制雌激素刺激的细胞生长。相反，AFP刺激正常胚胎成纤维细胞的生长。AFP也显示出具有免疫抑制效应和免疫增生效应。
为了开发利用AFP的各种生物学特性，有必要以有效而划算的方式得到足够量的该分子。已经证明，在重组系统中表达AFP是困难的，因为在真核细胞中表达野生型AFP通常会因为AFP在一个天冬酰胺残基(氨基酸233)上的差别糖基化而产生几种同工型。在原核系统中表达AFP通常产生错折叠和无活性的蛋白，它们聚集在一起，没有恰当的内部二硫键。这样错折叠的AFP必须经过纯化，然后在允许形成16个二硫键的条件下，经过困难而耗时的重折叠过程，以非常低的总收率产生有用的活性蛋白质。因为AFP的非糖基化形式与糖基化形式表现出相同的生物学特性，并且因为没有糖基化的变异性而允许产生更标准化、稳定的产品，所以非糖基化AFP优选用于商业生产。因此，需要有效方法，以生产非糖基化人AFP用于商业和治疗性应用。
发明概述本发明的特征为基本纯的核酸分子，所述分子编码非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)或其非糖基化片段。在一个实施方案中，编码ng.HuAFP的核酸分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874。
本发明的另一特征为包含非糖基化人甲胎蛋白的多肽。在本发明的这一特征的一个实施方案中，所述多肽是基本纯的并且具有SEQID NO6中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽是基本纯的并且具有SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
本发明还包括非糖基化重组HuAFP的生物活性片段及其类似物。在一个实施方案中，非糖基化重组HuAFP的生物活性片段包含SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列(结构域II)、SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列(结构域I+II)、或SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列(结构域II+III)、或两个或更多个上述氨基酸序列。
本发明的另一特征为基本纯的核酸分子，所述分子包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)启动子，所述启动子与ng.HuAFP编码序列操作性连接并且使ng.HuAFP能表达，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使细胞能分泌ng.HuAFP。在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或动物细胞(例如哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在一个理想的实施方案中，所述细胞将ng.HuAFP分泌到细胞培养基(即非生物体液)中。在另一个实施方案中，所述真核细胞是在转基因动物(例如哺乳动物，例如山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马或美洲驼)中。在又一个实施方案中，所述细胞是转基因动物的生物体液产生细胞，所述启动子使生物体液产生细胞中能表达ng.HuAFP，所述前导序列使ng.HuAFP能分泌到转基因动物的生物体液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中。
在一个实施方案中，表达ng.HuAFP的细胞是在转基因动物中，驱动ng.HuAFP表达的启动子是乳汁产生细胞特异性启动子，其使ng.HuAFP在动物的乳汁产生细胞中表达，所述前导序列使ng.HuAFP能分泌到动物乳汁中。在另一个实施方案中，表达ng.HuAFP的细胞是在转基因动物中，驱动ng.HuAFP表达的启动子是尿液产生细胞特异性启动子，其使ng.HuAFP在动物的尿液产生细胞中表达，所述前导序列使ng.HuAFP能分泌到动物尿液中。在又一个实施方案中，表达ng.HuAFP的细胞是在转基因动物中，驱动ng.HuAFP表达的启动子是血液产生细胞特异性启动子，其使ng.HuAFP在动物的血液产生细胞中表达，所述前导序列使ng.HuAFP能分泌到动物血液中。在再一个实施方案中，表达ng.HuAFP的细胞是在转基因动物中，驱动ng.HuAFP表达的启动子是淋巴液产生细胞特异性启动子，其使ng.HuAFP在动物的淋巴液产生细胞中表达，所述前导序列使ng.HuAFP能分泌到动物淋巴液中。
本发明的另一特征为非人类转基因生物，所述生物表达ng.HuAFP并将其分泌到生物体液(例如乳汁、尿液、唾液、精液或阴道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊内的液体、血液、汗液和泪液；或者是植物产生的水溶液，包括例如渗出液或吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜)中。在一个实施方案中，所述转基因生物是哺乳动物(例如例如山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马或美洲驼)、鸟类、爬行动物、两栖动物或植物。在另一个实施方案中，ng.HuAFP是由转基因表达，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)与ng.HuAFP编码序列操作性连接的启动子，致使所述启动子使所述生物的细胞能表达ng.HuAFP并能将蛋白分泌到生物体液中，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列能使所述生物的细胞将ng.HuAFP分泌到生物体液中。在又一个实施方案中，所述启动子是乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子，所述前导序列使ng.HuAFP能分别分泌到生物体的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。在再一个实施方案中，所述生物是小鼠或山羊。
本发明的另一特征为包括ng.HuAFP的非人类哺乳动物乳汁、尿液、血液或淋巴液。在一个实施方案中，ng.HuAFP是可溶性的，并且由非人类转基因哺乳动物产生，所述动物的乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞表达转基因，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子，致使所述启动子与ng.HuAFP编码序列操作性连接并且使得所述哺乳动物的乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞能够表达ng.HuAFP，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列能使乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞将ng.HuAFP分别分泌到所述哺乳动物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。
本发明的另一特征为通过下述步骤产生ng.HuAFP的方法(a)提供用转基因转导的细胞，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)与ng.HuAFP编码序列操作性连接的启动子，致使该启动子使细胞能表达ng.HuAFP，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使细胞能分泌ng.HuAFP；和(b)培养所述转导细胞，使得所述细胞表达并分泌ng.HuAFP。
在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母)或哺乳动物细胞(例如CHO细胞，或者乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞))。
本发明的另一特征为通过下述步骤产生ng.HuAFP的方法(a)提供包含转基因的转基因生物(例如哺乳动物(例如山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马或美洲驼)、鸟类、爬行动物、两栖动物或植物)，所述转基因具有(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ IDNO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)与ng.HuAFP编码序列操作性连接的启动子，致使该启动子使所述转基因生物的生物体液产生细胞能表达ng.HuAFP，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列能使所述生物体液产生细胞将ng.HuAFP分泌到转基因生物的生物体液中；和(b)从所述转基因生物中收集包含ng.HuAFP的生物体液。
在一个实施方案中，所述生物体液是乳汁、尿液、唾液、精液或阴道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊内的液体、血液、汗液或泪液；或者是植物产生的水溶液，包括例如渗出液或吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。在一个理想的实施方案中，所述生物体液是乳汁、尿液、血液或淋巴液，而ng.HuAFP分别是从乳汁、尿液、血液或淋巴液中纯化的。在另一个实施方案中，所述启动子是乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子，所述启动子使ng.HuAFP能分别在转基因生物体内乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞中表达。在又一个实施方案中，所述转基因生物表达ng.HuAFP并将其分泌在两种以上的生物体液(例如乳汁和尿液，乳汁和血液，尿液和血液，或乳汁、尿液和血液)中。
本发明的另一特征为治疗需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的从细胞培养基中纯化的ng.HuAFP。
本发明的另一特征为治疗需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的生物体液(例如乳汁、尿液、唾液、精液或阴道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊内的液体、血液、汗液和泪液；或者是植物产生的水溶液，包括例如渗出液或吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜)或其提取物，所述生物体液或其提取物包括从转基因非人类生物(例如哺乳动物(例如小鼠、山羊、绵羊、骆驼、母牛、猪、兔、马、公牛或美洲驼)、鸟类、爬行动物、两栖动物或植物)中获得的ng.HuAFP。在一个理想的实施方案中，n.g.HuAFP具有SEQ ID NO8所示的序列。在另一个实施方案中，所示生物体液是乳汁。在又一个实施方案中，ng.HuAFP是从转基因非人类生物的生物体液中纯化的(例如从哺乳动物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中纯化的ng.HuAFP)。在各种理想的实施方案中，所述方法可用于抑制或治疗免疫性疾病(例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、癌细胞生长)，以诱导骨髓细胞增殖(例如在骨髓移植之后，或者在给予化疗或放疗等骨髓毒性治疗之后)，或者作为免疫移植药(例如抑制自体反应性免疫细胞增殖，抑制移植器官的排斥(例如移植物抗宿主病)，或者移植或治疗自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、肌营养不良、系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病或银屑病)。
本发明的另一特征为治疗用组合物，所述组合物包含具有SEQ IDNO8所示氨基酸序列的ng.HuAFP。
本发明的另一特征为具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的ng.HuAFP在制备用于治疗经诊断患有或罹患诸如以下疾病的个体的药物中的用途癌症、类风湿性关节炎、肌营养不良、系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病或银屑病。
本发明的另一特征为具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的ng.HuAFP在制备用于促进细胞增殖(例如诱导骨髓细胞增殖(例如在骨髓移植之后，或者在给予化疗或放疗等骨髓毒性治疗之后))的药物中的用途。
本发明的另一特征为具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的ng.HuAFP在制备用做免疫抑制药(例如抑制自体反应性免疫细胞增殖；或抑制移植器官排斥(例如移植物抗宿主病))的药物中的用途。
在本发明的所有特征的一个实施方案中，ng.HuAFP是重组的(r.ng.HuAFP)。
在本发明的所有特征中，所述生物是动物(例如哺乳动物、鸟类、爬行动物或两栖动物)或植物。示例性的哺乳动物包括山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马和美洲驼。示例性的鸟类包括鸡、火鸡、鹅、鸵鸟、鹌鹑和鸭。示例性的植物包括来自以下种属拟南芥属(Arabidopsis)、苜蓿属(Medicago)、草莓属(Fragaria)、豇豆属(Vigna)、莲属(Lotus)、驴食豆属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petuna)、毛地黄属(Digtalis)、Majorana、Ciohorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Hererocallis、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭花属(Salpiglossis)、甜瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、黑麦草属(Lolium)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)或曼陀罗属(Datura)。所述植物也可选自松、矮牵牛、番茄、马铃薯、烟草、莴苣、向日葵、油菜、亚麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、莲藕、黄瓜、胡萝卜、茄子、花椰菜、辣根、牵牛、白杨、核桃、苹果、葡萄、芦笋、水稻、玉米(maize)、小米、洋葱、大麦、鸭茅草、燕麦、黑麦、小麦、玉米(corn)、苜蓿、草坪草、满江红、浮稻、水葫芦和西瓜，或者可以选自能够进行营养体增殖的水生植物或生长在水下的开花植物。
在本发明其它理想的实施方案中，所述生物体液是乳汁、尿液、唾液、精液或阴道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊内的液体、血液、汗液、泪液、植物渗出液、吐水液、木质部、韧皮部、树脂或花蜜。最好所述生物体液是乳汁。
在本发明其它理想的实施方案中，所述生物是哺乳动物并且ng.HuAFP由哺乳动物细胞表达，所述细胞负责产生蛋白并将其分泌到生物的生物体液中(例如乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞)。在理想的实施方案中，ng.HuAFP由哺乳动物的乳汁产生细胞在乳汁特异性启动子控制下进行表达，所述乳汁特异性启动子可选自αS-1酪蛋白启动子、αS2-酪蛋白启动子、β-酪蛋白启动子、γ-酪蛋白启动子、κ-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白(WAP)启动子、α-乳清蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)长末端重复序列(LTR)启动子。ng.HuAFP在以上任一启动子控制下表达，使所述多肽能分泌到哺乳动物的乳汁中。
在其它理想的实施方案中，ng.HuAFP由哺乳动物的尿液产生细胞在尿液特异性启动子控制下进行表达，所述尿液特异性启动子可选自尿斑蛋白(uroplakin)II启动子和尿调蛋白启动子。ng.HuAFP在以上任一启动子控制下表达，使ng.HuAFP能分泌到哺乳动物的尿液中。
在其它理想的实施方案中，ng.HuAFP由哺乳动物的血液产生细胞在血液特异性启动子(例如清蛋白启动子和甲胎蛋白启动子)控制下进行表达。在又一个理想的实施方案中，ng.HuAFP由哺乳动物的血液产生细胞在淋巴细胞特异性启动子控制下进行表达。ng.HuAFP在以上任一启动子控制下表达，使ng.HuAFP能分泌到哺乳动物的血液中。
在再一些理想的实施方案中，ng.HuAFP由哺乳动物的淋巴液产生细胞在淋巴液特异性启动子控制下进行表达。ng.HuAFP在淋巴液特异性启动子控制下表达，使ng.HuAFP能分泌到哺乳动物的淋巴液中。
在再一些理想的实施方案中，所述生物是鸟并且ng.HuAFP由鸟的细胞在禽类特异性启动子控制下进行表达，所述禽类特异性启动子可选自卵清蛋白启动子或apo-B启动子。ng.HuAFP在以上任一启动子控制下表达，使ng.HuAFP能分泌到羊膜液或者卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊周围的液体中。
在本发明的另一些实施方案中，所述生物是植物并且ng.HuAFP由植物细胞在植物特异性启动子控制下进行表达，所述植物特异性启动子可选自花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、CaMV 19S启动子、T-DNA甘露氨酸合成酶启动子、谷胱甘肽-S-转移酶同工型II(GST-II-27)启动子、地塞米松(DEX)启动子、细胞启动子、查耳酮合酶(CHS)启动子、PATATIN启动子、胭脂碱合酶(NOS)启动子、章鱼碱合酶(OCS)启动子、马铃薯(Solanum tuberosum)叶/茎(ST-LS)1启动子、大豆热激蛋白hsp17.5-E、hsp17.3-B启动子、Parasponia anderson血红蛋白启动子、苯丙氨酸氨裂合酶启动子、碧冬茄5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因启动子、蔗糖合酶启动子、叶绿素a/b(Cab)启动子、玉米rbcS启动子、豌豆rbcS-3A启动子、来自核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBICSO)的光诱导型启动子、脱落酸(ABA)效应基因序列启动子、ABA诱导型HVA1启动子、ABA诱导型HVA22启动子、rd29A启动子、23-kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、法国豆β-菜豆蛋白基因启动子、营养储藏蛋白(vspB)启动子、拟南芥cdc2a启动子、拟南芥SAG12启动子、病原体诱导型PR-1启动子、b-1，3葡聚糖酶启动子、醇脱氢酶(ADH)I启动子、ADH II启动子、苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)FIXD基因启动子、rol A启动子、rol B启动子和rol C启动子。ng.HuAFP在以上任一植物特异性启动子控制下表达，使ng.HuAFP能在植物的叶、茎、根或果实中产生，并且将ng.HuAFP分泌到植物的渗出液或吐水液、或者植物的木质部、韧皮部、树脂或花蜜中。
在其它实施方案中，ng.HuAFP在诱导型启动子控制下表达，因而对过量表达提供了时间和/或空间控制。在一个理想的实施方案中，诱导型启动子选自热激蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、MMTV-LTR启动子和蜕皮素启动子。调节ng.HuAFP表达的其它方式包括使用幕黎甾酮(muristerone)A和四环素/强力霉素选择。
本发明的其它特征和优势在以下详述和权利要求书中是显而易见的。
定义“生物体液”是指由哺乳动物、鸟类、两栖动物或爬行动物等生物产生的水溶液，其中含有由细胞分泌的蛋白，所述细胞浸泡在水溶液中。生物体液的实例包括例如乳汁、尿液、唾液、精液或阴道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊内的液体、血液、汗液和泪液；以及植物产生的水溶液，包括例如渗出液或吐水液、木质部、韧皮部、树脂和花蜜。还包括动物组织提取物以及植物提取物(其中包括芽、叶、根、茎和种子等任何植物结构的水性萃取液或有机萃取液)。植物提取物可以得自渗出液或吐水液。
“生物体液产生细胞”是指浸泡在生物体液中并将蛋白分泌到生物体液中的细胞。
“血液产生细胞”是指将蛋白分泌到血液中的细胞(例如肝上皮细胞、脾上皮细胞、骨髓细胞、胸腺上皮细胞、血管内皮细胞、骨髓细胞(例如淋巴细胞(例如B淋巴细胞或T淋巴细胞)和红细胞))。
“血液特异性启动子”是指在将蛋白分泌到血液中的细胞(例如肝上皮细胞、脾上皮细胞、骨髓细胞、胸腺上皮细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞(例如B淋巴细胞或T淋巴细胞))中，天然指导基因表达的启动子。血液特异性启动子的实例是清蛋白启动子/增强子，对其已有描述并可用于完成外源基因的肝特异性表达(参见例如Shen等，DNA 8101-108，1989；Tan等，Dev.Biol.14624-37，1991；McGrane等，TIBS 1740-44，1992；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690，1990；Shimada等，FEBS Letters 279198-200，1991)。甲胎蛋白基因启动子也特别有用。
“胚胎细胞”是指能够成为生物体所有体细胞和生殖细胞的祖细胞的细胞。示例性的胚胎细胞是胚胎干细胞(ES细胞)和受精卵母细胞。优选本发明的胚胎细胞是哺乳动物胚胎细胞。
本文所用的“外源”当指基因或多肽时，是指并非正常存在于动物体内的基因或多肽。例如，ng.HuAFP对山羊来说是外源的。
“表达载体”是指经遗传工程改造的质粒或病毒，其来自例如噬菌体、腺病毒、逆转录病毒、痘病毒、疱疹病毒或人工染色体，用于将与启动子操作性连接的ng.HuAFP编码序列转移到宿主细胞中，使编码的r.ng，HuAFP在宿主细胞中表达。
“人甲胎蛋白”或“HuAFP”或“rHuAFP”是指这样的多肽与Genbank检索号V01514所示成熟甲胎蛋白(氨基酸19-609)(SEQ IDNO4)具有基本上相同的氨基酸序列，并且由Genbank检索号V01514所示cDNA序列的核苷酸99-1874(SEQ ID NO3)编码，Morinaga等报道了所述多肽(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804604-4608，1983)。
“片段”当用于非糖基化HuAFP多肽时，是指长度为至少5个毗连氨基酸、优选至少10个毗连氨基酸、更优选至少20、50或100个毗连氨基酸、最优选至少200-400或更多个毗连氨基酸，并且最好在SEQ ID NO4中的第233位氨基酸包括谷氨酰胺残基代替天冬酰胺残基。HuAFP片段及其类似物优选保留生物活性。HuAFP片段及其类似物描述于例如美国专利第5,965,528号和第5,384,250号。
目标重组HuAFP片段包括但不限于结构域I(氨基酸1(Arg)-198(Ser)，SEQ ID NO9)、结构域II(氨基酸199(Ser)-390(Ser)，SEQ IDNO15)、结构域III(氨基酸391(Gln)-591(Val)，SEQ ID NO11)、结构域I+II(氨基酸1(Arg)-390(Ser)，SEQ ID NO16)、结构域II+III(氨基酸199(Ser)-591(Val)，SEQ ID NO17)和rHuAFP片段I(氨基酸267(Met)-591(Val)，SEQ ID NO14)。上述重组HuAFP片段的编号是根据缺失信号序列氨基酸1-18的成熟AFP序列而确定的。因此，HuAFP片段1位上的精氨酸残基相当于前体AFP氨基酸19。可以通过用例如谷氨酰胺取代SEQ ID NO4中的第233位上的天冬酰胺残基，产生上述HuAFP片段作为非糖基化片段。使用常规技术和测定，通过实验对片段的活性进行评价。
“人甲胎蛋白前体”是指这样的多肽与Genbank检索号V01514所示氨基酸1-609(SEQ ID NO2)具有基本上相同的氨基酸序列，并且由Genbank检索号V01514所示cDNA序列的核苷酸45-1874(SEQID NO1)编码。
“前导序列”或“信号序列”是指编码蛋白分泌信号、并且当与编码ng.HuAFP的下游核酸分子操作性连接时能指导ng.HuAFP分泌的核酸序列。前导序列可以是天然的人甲胎蛋白前导序列、人工衍生前导序列，或者可得自与用于指导ng.HuAFP编码序列转录的启动子相同的基因，或者来自从细胞中正常分泌的另一蛋白。
“淋巴液产生细胞”是指将蛋白分泌到淋巴液中的细胞(例如淋巴管上皮细胞和淋巴结细胞、淋巴细胞(例如B淋巴细胞和T淋巴细胞)和巨噬细胞)。
“淋巴液特异性启动子”是指在将蛋白分泌到淋巴液中的细胞(例如淋巴管上皮细胞和淋巴结细胞、淋巴细胞(例如B淋巴细胞和T淋巴细胞)和巨噬细胞)中，天然指导基因表达的启动子。
“乳汁产生细胞”是指将蛋白分泌到乳汁中的细胞(例如乳腺上皮细胞)。
“乳汁特异性启动子”是指在将蛋白分泌到乳汁中的细胞(例如乳腺上皮细胞)中，天然指导基因表达的启动子，其包括例如酪蛋白启动子、例如α-酪蛋白启动子(例如αS-1酪蛋白启动子和αS2-酪蛋白启动子)、β-酪蛋白启动子(例如山羊β-酪蛋白基因启动子(DiTullio，BioTechnology 1074-77，1992)、γ-酪蛋白启动子和κ-酪蛋白启动子；乳清酸性蛋白(WAP)启动子(Gorton等，BioTechnology 51183-1187，1987)；β-乳球蛋白启动子(Clark等，BioTechnology-7487-492，1989)；α-乳清蛋白启动子(Soulier等，FEBSLetts.29713，1992)。也包括在乳腺组织中特异性激活、并因此用于本发明的启动子，例如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)长末端重复序列(LTR)启动子。
“操作性连接”是指当合适的分子(例如转录激活蛋白)连接调节序列时，基因和一个或多个调节序列的连接方式允许基因表达。
“植物”是指植物全株、植物部分、植物细胞或植物细胞组。可用于本发明方法的植物种类通常和可用于转化技术的高等植物种类一样广泛，包括单子叶植物和双子叶植物。植物包括各倍数水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体。
“启动子”是指足以指导转录的最小序列。在本发明中也包括这样的启动子元件其足以使启动子依赖性基因表达受到细胞类型特异性、组织特异性、时间特异性或者被外来信号或试剂诱导的控制；这些元件可位于天然基因的5′或3′或内含子序列区。
“纯化的”或“基本纯的”是指分泌到生物体液(例如乳汁、尿液、血液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊周围的液体、吐水液、木质部、韧皮部、树脂或树液)中的ng.HuAFP与生物体液中天然存在的其它组分(例如蛋白质、脂肪和水)部分或完全分离，因此相对于生物体液中存在的未纯化的ng.HuAFP，增加了ng.HuAFP的有效浓度。
“非糖基化人甲胎蛋白”或“ng.HuAFP”是指与上述成熟人甲胎蛋白具有基本上相同的氨基酸序列的多肽，只是在SEQ ID NO4中的第233位氨基酸包含一个从天冬酰胺残基变为谷氨酰胺残基的突变(如SEQ ID NO6所示)，从而消除了一个糖基化位点。非糖基化人甲胎蛋白前体的核酸序列包含SEQ ID NO5所示序列的核苷酸45-1874。
“ng.HuAFP分泌信号”或“ng.HuAFP信号肽”或“ng.HuAFP前导序列”或“ng.HuAFP信号序列”是指与Genbank检索号V01514所示氨基酸1-18(核苷酸45-98所编码)具有基本上相同氨基酸序列的多肽。在蛋白质成熟和胞外分泌过程中，蛋白分泌信号从ng.HuAFP上切割下来。
“基本纯的核酸分子”是指不含本发明核酸分子所来源的生物体天然存在的基因组中的基因的核酸分子。因此该术语包括例如重组DNA分子，所述分子掺入到载体中；掺入到自主复制质粒或病毒中；或者掺入到原核生物或真核生物基因组DNA中；或者其以独立于其它序列的分离的分子(例如通过PCR或限制性内切核酸酶消化而产生的cDNA或基因组片段或cDNA片段)存在。它也包括作为杂合基因部分的重组DNA以及相应mRNA，所述杂合基因含有对所述基因来说并非天然的核苷酸序列或编码额外的多肽序列。
“治疗有效量”是指当给予患者时，能抑制或刺激由人甲胎蛋白调节的生物活性的非糖基化人甲胎蛋白或其片段的用量。所述生物活性包括抑制肿瘤细胞增殖或自体反应性免疫细胞增殖，或者刺激细胞(例如骨髓细胞)增殖。治疗有效量可以随包括医学适应症、给药时间长短和给药途径等诸多因素而变化。例如，系统给予ng.HuAFP的范围可以在0.1ng-10g/kg体重，优选范围在1ng-1g/kg体重，更优选范围在10ng-100mg/kg体重，最优选范围在25μg-10mg/kg体重。
“转化”、“转染”或“转导”是指将外源分子导入细胞中的任何方法。脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、微注射、核转移(参见例如Campbell等，Biol.Reprod.49933-942，1993；Campbell等，Nature 385810-813，1996)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、转导(例如噬菌体、腺病毒、逆转录病毒或其它病毒转移)、电穿孔和生物射弹转化就是本领域技术人员已知的几个可以使用的方法。
“转化细胞”、“转染细胞”、“或“转导细胞”是指通过重组DNA技术引入编码ng.HuAFP的核酸分子的细胞(或细胞后代)。所述核酸分子可以稳定掺入到宿主染色体中，或者可以以附加体形式保留。
“转基因”是指人为插入到细胞或其祖先中、并且成为由该细胞发育而来的动物的基因组组成部分的任何核酸分子。所述转基因可包括对转基因动物来说部分或完全是外源(即外来)的基因，或可以是与动物内源基因具有同一性的基因。
“转基因的”是指任何细胞，所述细胞包含人为插入到细胞或其祖先中、并且成为由该细胞发育而来的动物的基因组组成部分的任何核酸分子。优选所述转基因动物是转基因哺乳动物(例如小鼠、山羊、绵羊、骆驼、母牛、猪、兔、马、公牛或美洲驼)。优选所述核酸分子(转基因)人为插入到核基因组(即染色体)中，尽管所述转基因也可以以附加体形式保留(例如由含有Epstein-Barr病毒oriP等复制起点的载体携带)。
“尿液产生细胞”是指将蛋白分泌到尿液中的细胞(例如膀胱上皮细胞或肾上皮细胞)。
“尿液特异性启动子”是指在将蛋白分泌到尿液中的细胞(例如膀胱上皮细胞)中，天然指导基因表达的启动子。尿液特异性启动子的实例是尿斑蛋白II基因启动子和尿调蛋白基因启动子。
附图简述

图1是对含有hAFP的载体进行操作以产生基因组hAFP β-酪蛋白表达构建体BC934的示意图。
图2A和图2B是用于表达rHuAFP或ng.HuAFP并将其分泌到乳汁中的山羊β-酪蛋白/rHuAFP转基因(图2A)和β-酪蛋白/ng.HuAFP转基因(图2B)的结构示意图。
图3是蛋白质印迹图，显示转基因小鼠乳汁样品中存在rHuAFP。第1-3泳道hAFP。第1泳道50ng hAFP(相当于0.5mg/ml)；第2泳道100ng hAFP(相当于1.0mg/ml)；第3泳道200ng hAFP(相当于2.0mg/ml)；第4泳道阴性(非转基因)小鼠乳汁；第5-10泳道rHuAFP。第5泳道BC934-1-7，d9，(4μL-1∶40)；第6泳道BC934-1-8，d9，(4μL-1∶40)；第7泳道BC934-1-56，d9，(4μL-1∶40)；第8泳道BC934-1-59，d9，(4μL-1∶40)；第9泳道BC934-1-63，d9，(4μL-1∶40)；第10泳道BC934-1-64，d9，(4μL-1∶40)。
图4是蛋白质印迹图，显示转基因小鼠乳汁样品中存在ng.HuAFP。第1泳道hAFP(50ng)；第2泳道hAFP(100ng)；第3泳道分子量标准品；第4泳道阴性(非转基因)小鼠乳汁；第5-10泳道ng.HuAFP。第5泳道BC1055-1-9(4μL-1∶40)；第6泳道BC1055-1-10(4μL-1∶400)；第7泳道BC1055-1-37(4μL-1∶400)；第8泳道BC1055-1-44(4μL-1∶40)；第9泳道BC1055-1-74(4μL-1∶40)；第10泳道BC1055-1-85(4μL-1∶40)。
图5是示意图，显示BC1055(ng.HuAFP)构建体和跨越5′β-酪蛋白和5′ng.HuAFP序列连接区的332bp PCR产物(标记“PCR产物”)的位置。也显示了PCR引物3′BC探针的位置，所述探针用于DNA印迹分析。
图6A和图6B是照片，显示从含有ng.HuAFP转基因的建立者山羊F093采取的血液和耳组织的PCR分析结果。图6A显示用山羊外显子7引物对(410bp产物)和hAFP特异性引物对(332bp产物)进行双PCR分析的结果。图6B显示仅用hAFP特异性引物对进行PCR分析的结果。这两个实验中的模板DNA是相同的。第1泳道DNA大小标准品；第2泳道非转基因山羊血液样品；第3泳道hAFP阳性山羊细胞系(克隆7)；第4泳道来自hAFP阳性流产胎F026的耳组织；第5泳道来自F093的血组织；第6泳道来自F093的耳组织。
图7是图片，显示建立者山羊F093的DNA印迹分析结果。将5μg DNA用EcoRI消化，进行电泳分离，转印到Genescreen Plus(NewEngland Nuclear)。将印迹与山羊β-酪蛋白探针杂交，洗涤，然后进行放射自显影。第1泳道λHindIII，分子量标记；第2泳道非转基因山羊耳组织DNA；第3泳道F026，hAFP阳性流产胎耳组织DNA；第4泳道F093，建立者山羊血DNA。
图8A和图8B是照片，显示建立者山羊F093的荧光原位杂交(FISH)分析结果。图8A显示F093培养白细胞中期染色体的代表性实例。白点和箭头指示转基因信号。染色体经DAPI染色后可见。放大倍数1000X。图8B显示F093培养白细胞间期核的代表性视野。转基因信号是白色的并用箭头指示。核DNA经DAPI染色后可见。放大倍数1000X。
发明详述本发明的特征为生物活性非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)、编码ng.HuAFP的核酸序列以及制备ng.HuAFP的方法。本发明的方法包括在细胞(例如原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞(例如巴斯德比赤酵母(Pichia pastoris))或哺乳动物细胞))中产生ng.HuAFP。在原核细胞中产生rHuAFP的方法可用于制备ng.HuAFP，该方法可参见美国专利第5,384,250号和第6,331,611号，所述文献通过引用结合到本文中。可用于在哺乳动物细胞中产生ng.HuAFP的方法，可参见美国顺序号09/936,020。Ausubel等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，New York，NY，第16.12.1-16.20-16页和第A.5.23-A.5.30页，1997)提供了各种哺乳动物表达系统和在哺乳动物细胞中表达重组蛋白的方法的详述。
本发明的方法也包括在转基因生物、特别是哺乳动物体中产生ng.HuAFP，所述哺乳动物例如反刍动物(例如母牛、绵羊和山羊)、马、骆驼、公牛、美洲驼、猪、兔和小鼠，但也包括在鸟类(例如鸡、火鸡、鹅、鹌鹑、鸭和鸵鸟)、两栖动物、爬行动物和植物中产生ng.HuAFP。所述转基因含有ng.HuAFP，所述ng.HuAFP包含经改变在前体AFP的第251位或者在缺失信号序列的成熟AFP的第233位含有天冬酰胺变为谷氨酰胺的一个取代的人AFP编码区。ng.HuAFP编码区与含有转录启动子的核酸序列下游融合。在启动子和所述蛋白编码区之间是编码蛋白分泌信号的前导序列。根据所用的启动子和分泌信号，表达的ng.HuAFP能分泌到转基因生物的生物体液例如乳汁、尿液、血液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊周围的液体、或吐水液中。转基因构建体中也可包括额外的核酸元件，例如转录增强子、转录和翻译终止序列、增强mRNA稳定性的3′非翻译区和增强表达的内含子。ng.HuAFP在转基因动物中表达，分泌到生物体液(例如乳汁、尿液、血液、淋巴液等)中，然后可以从这些液体中收集并纯化ng.HuAFP。
将ng.HuAFP分泌到转基因生物的生物体液(例如乳汁、尿液和淋巴液)中，有利于其纯化并避免去除血液产物和培养基添加剂，这些血液产物和培养基添加剂中的有些成分是有毒的、致癌的或具有感染性的。此外，含有ng.HuAFP的乳汁可直接供人或其它哺乳动物消费。ng.HuAFP在尿液中表达，允许使用雄性动物和雌性动物来生产ng.HuAFP。另外，一旦动物开始产生尿液，同时也产生ng.HuAFP。最后，从尿液中纯化ng.HuAFP相当简便，因为尿液通常只含少量蛋白质。
转基因构建体可用于在乳腺组织中表达ng.HuAFP转基因的启动子包括天然驱动乳腺特异性蛋白(例如乳蛋白)表达的启动子，尽管可以使用能将转基因产物分泌到乳汁中的任何启动子。这些启动子包括例如天然指导以下蛋白表达的启动子乳清酸性蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白(参见例如Drohan等，U.S.P.N.5,589,604；Meade等美国专利第4,873,316号；Karatzas等，美国专利第5,780,009号)。
可用于在泌尿组织中表达ng.HuAFP转基因的启动子是尿斑蛋白启动子和尿调蛋白启动子(Kerr等，Nat.Biotechnol.1675-79，1998；Zbikowska等，Transgenic Res.11425-435，2002)，尽管可以使用能将转基因产物分泌到尿液中的任何启动子。
转基因构建体优选包括启动子下游的前导序列。前导序列是编码蛋白分泌信号、并且当与下游编码ng.HuAFP的核酸分子操作性连接时能指导ng.HuAFP分泌的核酸序列。前导序列可得自与用于指导编码ng.HuAFP的核酸分子转录的启动子相同的基因(例如编码乳特异性蛋白的基因)。或者，可以使用编码天然人AFP蛋白分泌信号(Genbank检索号V01514氨基酸1-19)的前导序列；Genbank检索号V01514核苷酸45-101编码天然人AFP蛋白分泌信号。其它选项包括使用前导序列，所述序列编码通常从细胞中正常分泌的任何其它蛋白的蛋白分泌信号，编码人工蛋白分泌信号的人工前导序列，或杂合前导序列(例如山羊β-酪蛋白和人AFP前导序列的融合体)。
另外，所述转基因构建体优选包括转录终止位点(即转录mRNA的聚腺苷酸化信号)和翻译终止信号。所述转基因也可编码增加ng.HuAFP mRNA稳定性的任何3′非翻译区(UTR)，例如，牛生长激素基因、乳蛋白基因或珠蛋白基因的3′UTR。
所述转基因构建体也可包括转基因转录区上游或下游的转录增强子，例如病毒(例如SV40)或哺乳动物(例如酪蛋白)基因的增强子。
所述转基因构建体还可包括提高转基因表达水平的内含子。所述内含子可位于转录起始位点和翻译起始密码子之间、翻译终止密码子的3′，或者在转基因编码区内。所述内含子应包括5′剪接位点(即供体位点)、3′剪接位点(即受体位点)并且优选在这两个位点之间的至少有100个核苷酸。可以使用本领域已知的任何可增加转基因表达的内含子(例如来自反刍动物酪蛋白基因的内含子)。
ng.HuAFP转基因可以由环状质粒、粘粒载体或其它载体例如来自病毒的载体所携带。所述载体可含有便于其在原核细胞和真核细胞中复制的额外序列，例如药物选择标记(例如大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性，或哺乳动物细胞中的G-418抗性)和复制起点(例如用于在原核细胞中复制的colE1，用于在哺乳动物细胞中复制的oriP)。
动物启动子可用于在乳腺组织中表达ng.HuAFP的启动子包括天然驱动乳腺特异性多肽(例如乳蛋白)表达的启动子，尽管可以使用能将ng.HuAFP分泌到乳汁中的任何启动子。这些启动子包括例如天然指导以下蛋白表达的启动子乳清酸性蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白(参见例如Drohan等，美国专利第5,589,604号；Meade等美国专利第4,873,316号；Karatzas等，美国专利第5,780,009号)和美国专利第5,750,172号中描述的其它启动子。乳清酸性蛋白(WAP；Genbank检索号X01153)是啮齿动物的主要乳清蛋白，在妊娠后期和哺乳期专一在乳腺中以高水平表达(Hobbs等，J.Biol.Chem.2573598-3605，1982)。有关理想的乳腺特异性启动子的其它信息，参见例如Richards等，J.Biol.Chem.256526-532，1981(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，Nucleic Acids Res.128685-8697，1984(大鼠WAP)；Jones等，J.Biol.Chem.2607042-7050，1985(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee和Rosen，J.Biol.Chem.25810794-10804，1983(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242735-742，1987(人α-乳清蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.123895-3907，1984(牛α-S1和κ-酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等，Gene 6687-96，1988(牛β-酪蛋白)；Alexander等，Eur.J.Biochem.178395-401，1988(牛κ-酪蛋白)；Brignon等，FEBS Lett.18848-55，1977(牛α-S2酪蛋白)；Jamieson等，Gene 6185-90，1987，Ivanov等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369425-429，1988，和Alexander等，Nucleic Acids Res.176739，1989(牛β-乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie 69609-620，1987(牛α-乳清蛋白)。Mercier和Vilotte(J.Dairy Sci.763079-3098，1993)综述了各种乳蛋白基因的结构和功能。如果额外的侧翼序列用于优化表达的话，所述序列可采用现有序列作为探针来进行克隆。可使用已知关联核苷酸序列、或关联蛋白的抗体作为探针，通过筛选不同生物的文库，得到这些生物的乳腺特异性调节序列。
可用于表达ng.HuAFP并将其分泌到乳汁中的信号序列是乳特异性信号序列。理想的是，所述信号序列选自乳特异性信号序列，即来自分泌到乳汁中的蛋白的编码基因。最理想的是，所述乳特异性信号序列与上述乳汁特异性启动子相关。所述信号序列的大小对本发明并不重要。所需要的不过是所述序列具有足够大小以影响ng.HuAFP在例如乳腺组织中的分泌。例如，来自编码以下蛋白的基因的信号序列可用于本发明酪蛋白(例如α酪蛋白、β酪蛋白、γ酪蛋白或κ酪蛋白)、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白和乳清蛋白。也可使用来自其它分泌蛋白(例如肝细胞、肾细胞或胰腺细胞分泌的蛋白)的信号序列。
可用于在泌尿组织中表达重组多肽转基因的启动子是尿斑蛋白启动子和尿调蛋白启动子(Kerr等，Nat.Biotechnol.1675-79，1998；Zbikowska，等，Biochem.J.3657-11，2002；Zbikowski等，TransgenicRes.11425-435，2002)，尽管可以使用能将转基因产物分泌到尿液中的任何启动子。
可用于通过血液产生细胞或血清产生细胞(例如肝上皮细胞)表达ng.HuAFP并将其分泌到血液中的启动子是清蛋白启动子(参见例如Shen等，DNA 8101-108，1989；Tan等，Dev.Biol.14624-37，1991；McGrane等，TIBS 1740-44，1992；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690，1990；Shimada等，FEBS Letters 279198-200，1991)，尽管可以使用能将转基因产物分泌到血液中的任何启动子。也可以使用天然甲胎蛋白启动子(参见例如Genbank检索号AB053574、AB053573、AB053572、AB053571、AB053570和AB053569)。
可用于在精液中表达ng.HuAFP的启动子描述于美国专利第6,201,167号。
有用的禽类特异性启动子是卵清蛋白启动子和apo-B启动子。其它禽类特异性启动子是本领域已知的。卵清蛋白启动子可用于指导ng.HuAFP的表达，然后将其沉积在卵的卵白中。apo-B启动子也可用于指导重组多肽在肝脏中的表达，其中它将最终沉积在卵黄中。禽类的卵是表达大量重组多肽的最佳载体，其原因如下(1)大量蛋白包装在每个卵中，(2)能容易而非侵入性地收集卵并可储藏较长时间，和(3)卵是无菌的，而且与乳汁不同，卵不含细菌污染物。具体地讲，对于每个卵，鸟可在输卵管中产生3克清蛋白，其中50％以上的是卵清蛋白。另外在肝中产生3克(血清脂蛋白)并沉积在卵黄中。另外，因为鸟类与哺乳动物的进化差异，所以它们通常在免疫上不能识别哺乳动物蛋白，所以在鸟中表达ng.HuAFP，对鸟的生存和健康的不利影响更小。
用于本发明方法的其它启动子包括诱导型启动子。通常，重组蛋白在大多数真核表达系统中以组成型方式表达。加入诱导型启动子或增强子元件，对ng.HuAFP的过量表达提供了时间或空间控制，并且提供替代的表达机制。诱导型启动子包括热激蛋白、金属硫蛋白和MMTV-LTR，而诱导型增强子元件包括用于蜕皮素、幕黎甾酮A和四环素/强力霉素的元件。
Tet-On和Tet-Off基因表达系统(Clontech)是用于本发明方法的诱导系统的实例之一。该系统使用四环素(Tc)效应元件，以开(组成型关闭，用Tc诱导)或关(组成型打开，被Tc或强力霉素阻抑)的方式维持ng.HuAFP表达。
也可将选择标记掺入到ng.HuAFP转基因中，以便易于鉴定转化的细胞。选择标记通常有两个功能性类别隐性和显性。隐性标记通常是编码在宿主细胞(缺乏“标记”产物或功能的细胞)中不产生的蛋白的基因。胸苷激酶(TK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)的标记基因属于此类。显性标记包括编码赋予生长抑制化合物(抗生素、药物)抗性的产物的基因和/或允许宿主细胞在代谢限制环境中生长的基因。常用的此类标记包括突变型DHFR基因(所述基因赋予对甲氨蝶呤的抗性)；黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的gpt基因(所述基因允许宿主细胞在含有霉酚酸/黄嘌呤的培养基上生长)；和用于氨基糖苷3′-磷酸转移酶的neo基因(所述基因可赋予对以下药物的抗性G418、庆大霉素、卡那霉素和新霉素)。
转基因动物的产生通常通过微注射，将转基因构建体导入细胞中(Ogata等，美国专利第4,873,292号)。然后将微注射的胚胎转移到合适的母体中，结果生出转基因动物或嵌合动物，这取决于所述转基因整合时胚胎的发育期。可以让嵌合动物交配，以繁育出真正的种系转基因动物。
在某些转基因方法中，将转基因导入受精卵母细胞的原核中。对于某些动物例如小鼠来说，受精是在体内进行，受精卵经手术取出。在其它动物中，卵可以从活体中取出，或者从刚死的动物(例如屠宰场)中取出并在体外受精。
或者，可以将转基因导入胚胎干细胞(ES细胞)中。可以通过电穿孔、微注射、核转移或技术人员已知的用于转染细胞的任何其它技术，将转基因导入所述细胞中。转化细胞与其起源相同的动物的胚泡结合。转化细胞定植在胚胎中，在某些胚胎中，这些细胞形成所得嵌合动物的生殖细胞(Jaenisch，R.，Science 2401468-1474，1988)。
含有ng.HuAFP转基因的ES细胞也可用做核源，移植到去核受精卵母细胞中，由此产生转基因动物。更通常的是，来自胚胎、胎儿或成体组织并含有rHuAFP转基因的任何二倍体细胞都可以导入去核未受精的卵中。将克隆的胚胎植入合适母体并让其妊娠，由此产生完全的转基因动物(Wilmut等，Nature 385810-813，1997)。
一般而言，任何转基因的表达都取决于其整合位置和拷贝数。当通过传统方法(例如原核注射或产生嵌合胚胎)，得到具有合适转基因表达水平和组织特异性转基因表达模式的转基因动物之后，繁殖所述动物，以便得到具有相同转基因表达水平和模式的子代。该方法有一些局限。首先，在缺乏转基因生殖细胞的转基因嵌合体中，转基因不能遗传给子代。第二，因为让杂合转基因建立者与非转基因动物交配，仅有半数子代是转基因的。第三，妊娠周期长短和每次怀孕的子代数量进一步限制了转基因子代数量。最后，性别也限制了有用的转基因子代的数量。例如，只有雌性动物可用于产生在乳汁中表达的ng.HuAFP。因为诸多局限，核转移技术提供了优势，即在相对短的时间中，能够产生大量的遗传上相同的雌性转基因动物。
也可通过将转基因直接转移到分娩后动物的乳腺组织中，产生在其乳汁中表达ng.HuAFP的动物(Karatzas等，美国专利第5,780,009号)。所述动物在其生殖细胞中不含转基因，因而不产生转基因子代。
任何动物都可用于本发明。最好优选产生大量生物体液(例如乳汁)的动物。优选的动物是鸟类、爬行动物和两栖动物、以及反刍动物、有蹄类动物、驯养的哺乳动物和产奶动物。合适的鸟类包括鸡、鹅、火鸡、鹌鹑、鸭和鸵鸟。特别优选的动物包括小鼠、山羊、绵羊、骆驼、母牛、猪、兔、马、公牛和美洲驼。当然，这其中的各动物并不是同样有效表达ng.HuAFP的。例如，具体的生物体液特异性启动子(例如乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子)或信号序列在一种哺乳动物可能比在其它动物中更有效。然而，本领域技术人员可以通过本发明的以下描述和现有技术的知识容易地进行选择。当ng.HuAFP分泌到转基因动物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中时，所述动物每年应能产生至少1升、更好至少10升、25升或50升、最好100升、500升、1000升或10,000升或更多的乳汁、尿液、血液或淋巴液。最好从生物体所产生的产物中回收ng.HuAFP，所述产物例如乳汁、尿液、血液、羊膜液、或卵的卵黄囊、绒毛膜或尿囊周围的液体，但也可以从种子、毛发、组织或卵中回收。
可以产生在两种或三种生物体液中(例如在乳汁和尿液中，在乳汁和血液中，或在乳汁、尿液和血液中)产生ng.HuAFP的转基因动物。构建所述动物的方法之一是用至多3个构建体转化动物的胚胎细胞，其中所述构建体选自ng.HuAFP核酸分子，所述分子由能够从以下细胞表达和分泌重组多肽的启动子指导乳汁产生细胞、尿液产生细胞或血液产生细胞。按照该方法，双重或三重转化的细胞用于产生能在一种或多种其生物体液中表达ng.HuAFP的转基因动物。
因此，向哺乳动物(例如反刍动物)受精卵中微注射(或共微注射(co-microinjected))表达ng.HuAFP的2个或3个核酸分子，所述分子处于一个或多个例如以下启动子的控制下乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子。所产生的转基因动物将在其一种或多种乳汁、尿液、血液或淋巴液中分泌/产生ng.HuAFP。这将增加单位转基因动物产生ng.HuAFP的总产量。
这种能在一种或多种生物体液中产生ng.HuAFP的动物的第二个产生方法是独立产生胚胎干细胞，所述干细胞携带能表达ng.HuAFP并将其分泌到生物体液产生细胞(例如乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞)中的构建体。然后将一种或多种转化ES细胞类型与来自其相同来源的动物的胚泡结合，产生嵌合动物，然后将其繁育到纯合型。
这类双重或三重表达的动物具有若干优点。首先，两种性别的动物从其出生开始均可在尿液或血液等中产生ng.HuAFP，而雌性动物在泌乳的成年期还能在乳汁等中产生ng.HuAFP。其次，按照重组多肽变化的需要，可以增加(通过诱导泌乳)或减少(通过不诱导泌乳)任何单个雌性动物所产生的ng.HuAFP的数量。
在例如以下文献中可以找到产生转基因动物的方案White和Yannoutsos，Current Topics in Complement Research64th Forum inImmunology，第88-94页；Bader和Ganten，Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology，增刊3S81-S87，1996；TransgenicAnimal Technology，A Handbook，1994，Carl A.Pinkert编著，AcademicPress，Inc；美国专利第5,523,226号；美国专利第5,530,177号；美国专利第5,573,933号；PCT申请WO93/25071；PCT申请WO95/04744。产生转基因动物的其它方法是本领域已知的(参见例如Love等，Biotechnology 1260-63，1994；Naito等，Mol.Reprod.Dev.39153-161，1994；Chang等，Cell Biol.Int.21495-499，1997；Carscience等，Development 117669-675，1993；Pain等，Cell，Tissues，Organs 165212-219，1999；Pettite等，Development 108185-189，1990；Pettite等，载于Transgenic Animal Research Conference III(Tahoe City)，第32-33页，2001；Wright等，BioTechnology 9830-83，1991；Pursel等，J.Anim.Sci.71增刊31-9，1993；Wall等，Theriogenology 557-968，1996；Campbell等，Nature 38064-66，1996；Wilmut等，Nature 385810-813，1997；Cibelli等，Science 2801256-1258，1998；Wakayama等，Nature394369-374，1998)。
筛选表达ng.HuAFP的转基因动物产生候选转基因动物后，必须对其进行筛选，以便检测其细胞中含有并表达转基因的动物。通常可通过DNA印迹分析或通过使用PCR扩增候选转基因动物的DNA，检测动物组织中转基因的存在(参见例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York，NY，1998；另见Lubon等，U.S.P.N.5,831,141)。可通过任何标准免疫测定法，例如ELISA或蛋白质印迹分析，使用针对人AFP的抗体，测定乳汁、尿液、血液或淋巴液中表达的ng.HuAFP(参见例如Murgita等，U.S.P.N.5,384,250和Ausubel等，出处同上)。基于ELISA测定法，测定乳汁中转基因编码蛋白的工作实例，可参见Drohan等，U.S.P.N.5,589,604。
转基因植物使用本发明的构建体，许多植物宿主都可用于产生ng.HuAFP，所述植物宿主包括但不限于藻类、树木类、观赏植物类、温带水果类、热带水果类、蔬菜类、豆类、十字花科植物、单子叶植物、双子叶植物或任何商业或农业用植物。合适植物宿主的特别实例包括但不限于松、矮牵牛、番茄、马铃薯、烟草、莴苣、向日葵、油菜、亚麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、莲藕、黄瓜、胡萝卜、茄子、花椰菜、辣根、牵牛、白杨、核桃、苹果、葡萄、芦笋、水稻、玉米(maize)、小米、洋葱、大麦、鸭茅草、燕麦、黑麦、小麦、玉米(corn)、苜蓿、草坪草、能够进行营养体增殖的水生植物、满江红、浮稻、水葫芦、西瓜、生长在水下的开花植物，以及来自以下的种属拟南芥属、苜蓿属、豇豆属、草莓属、莲属、驴食豆属、三叶草属、胡卢巴属、柑橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、芸苔属、萝卜属、白芥属、颠茄属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、Ciohorium、向日葵属、莴苣属、雀麦属、金鱼草属、Hererocallis、龙面花属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、喇叭花属、甜瓜属、Browaalia、大豆属、黑麦草属、玉蜀黍属、小麦属、高粱属和曼陀罗属。
可以从能够产生ng.HuAFP的任何转基因植物中得到植物提取物。另外，如下所述，在植物中可表达转基因构建体，以产生ng.HuAFP，其可以从植物组织或从植物分泌物中分离。
植物启动子已经从不同植物中鉴定并分离出多种植物启动子，其描述可参见各专利，例如美国专利第5,391,725、5,536,653、5,589,583、5,608,150、5,898,096、6,072,050、6,184,440和6,331,663号。理想的植物启动子包括强植物启动子和非组织特异性或发育特异性植物启动子(例如在许多或所有植物组织类型中强表达的启动子)。理想的植物启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)和19S(CaMV 19S)基因启动子，所述启动子使几乎所有植物组织以高水平表达(Benefey等，Science 250959-966，1990；Odell等，Nature 313810-812，1985；Jensen等，Nature 321669-674，1986；Jefferson等，EMBO J.63901-3907，1987；Sanders等，Nuc.Acids Res.141543-1558，1987)。在CaMV 35S启动子中，发现结构域A(-90至+8)赋予的表达在根部组织特别强烈，而结构域B(-343至-90)赋予的表达看来在种子的子叶和幼苗以及在下胚轴的维管组织中最强(Benfey等，EMBO J.82195-2202，1989)。此外，通过CaMV 35S启动子的加倍，还可进一步增强该启动子的活性(即2-10倍之间)(参见例如Kay等，Science 2361299，1987；Ow等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.844870，1987；Fang等，Plant Cells 1141，1989)。
其它理想的植物启动子包括例如T-DNA甘露氨酸合成酶启动子和各种衍生物；诱导型启动子，例如玉米谷胱甘肽-S-转移酶同工型II(GST-II-27)基因启动子，其在响应外源安全剂的应用而被激活(WO93/01294，ICI Ltd)；GST-II-27基因启动子，其被某些用于促进植物生长的化合物诱导；地塞米松(DEX)启动子(Aoyama等，PlantJournal 11605-612，1997)；伸长组织特异性启动子(例如细胞启动子)；查耳酮合酶启动子(CHS)；和来自马铃薯的PATATIN启动子(Rocha-Sosa等，EMBO J.823-29，1989)，当希望在伸长组织和器官中表达时可采用该启动子。
其它合适的植物启动子包括例如胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子(其携带于根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的根瘤诱导质粒上；Ha和An，Nucleic Acids Res.17215-224，1989；An等，Plant Physiol.88547-552，1988)；马铃薯叶/茎(ST-LS)1基因(Stockhaus等，Plante Cell 1805-814，1989)；大豆热激蛋白hsp17.5-E或hsp17.3-B启动子(Gurley等，Mol.Cell Biol.6559-565，1986)；Parasponia andersoni血红蛋白启动子(Landsmann等，Mol.Gen.Genet.21468-73，1988)；苯丙氨酸氨裂合酶启动子(其在响应创伤而积累苯丙酸类衍生物的特定细胞类型中并且在木质部和花的正常发育过程中有活性)(Bevan等，EMBO J.81899-1906，1989)；碧冬茄5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因启动子(Benfey和Chua，Science244174-181，1989)；蔗糖合酶启动子。所有这些启动子都已用于产生在植物中表达的各类DNA构建体(参见例如PCT申请WO84/02913)。
对于某些应用来说，最好是在合适植物组织中以合适水平或在合适的发育时期调节ng.HuAFP的产生。为了达到该目的，对基因启动子进行了分类，每种在其具体的调节序列中各有自己的独特特征，显示出在响应环境、激素和/或发育信号时被调节。这其中包括负责热调节基因表达的基因启动子(参见例如Takahashi和Komeda，Mol.Gen.Genet.219365-372，1989)；负责光调节基因表达的基因启动子(例如拟南芥Cab2光合作用、叶特异性启动子)；描述于以下文献的玉米rbcS启动子Schffner和Sheen，Plant Cell 3997-1012，1991；豌豆rbcS-3A；来自核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBICSO，一种十分丰富的植物多肽；Coruzzi等，EMBO J.31671-1679，1984；Herrera-Estrella等，Nature 310115-120，1984)的光诱导型启动子；集光叶绿素蛋白复合体的叶绿素a/b结合蛋白(Cab)(Apel等，Eur.J.Biochem.85581-588，1978；Stiekema等，Plant Physiol.72717-724，1983；Thompson等，Planta 158487-500，1983；Jones等，EMBO J.42411-2418，1985)；或存在于豌豆中的叶绿素a/b结合蛋白基因，其描述于Simpson等，EMBO J.42723，1985；来自以下文献描述的小麦Em基因的激素调节基因表达(例如脱落酸(ABA)效应序列Marcotte等，Plant Cell 1969-976，1989；ABA-诱导型HVA1和HVA22以及描述于以下文献的大麦和拟南芥的rd29A启动子Straub等，Plant Mol.Biol.26617-630，1994，Shen等，Plant Cell 7295-307，1995；创伤诱导的基因表达(例如Siebertz等，Plant Cell 1961-968，1989中描述的wunI的基因表达)，器官特异性基因表达；玉米23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或以下文献描述的法国豆β-菜豆蛋白基因Bustos等，Plant Cell 1839-853，1989；以下文献描述的营养储藏蛋白启动子(大豆vspB)Sadka等，Plant Cell 6737-749，1994)，循环启动子(例如描述于以下文献的拟南芥cdc2a启动子Hemerly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893295-3299，1992)；衰老特异性启动子(例如描述于以下文献的拟南芥SAG12启动子Gan等，Science 2701986-1988，1995)；种子特异性启动子(例如胚乳特异性启动子或胚特异性启动子)；或病原体诱导型启动子(例如，PR-1或b-1，3葡聚糖酶启动子)。
广泛用于植物细胞转化的两个其它启动子是编码醇脱氢酶AdhI和AdhII的基因的启动子。这两个基因是在无氧生活开始后诱导的。在本发明再一个实施方案中，有利的是用操作性连接修饰或人工植物启动子的ng.HuAFP转基因构建体转化植物。通常用不同植物启动子的重组结构元件构建的所述启动子具有天然植物启动子所不具备的独特的表达模式和/或水平(参见Salina等，Plant Cell 41485-1493，1992，例如用顺式调节元件和启动子核心联合构建的人工启动子)。
也已观察到某些细菌启动子能在植物中表达，所述启动子包括美国专利第4,782,022号中介绍的苜蓿中华根瘤菌FIXD基因启动子。在发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中已经鉴定了一些启动子序列，称为rol A、B和C启动子(参见例如Schmulling等，Plant Cell 1665-670，1989；Sugaya等，Plant Cell Physiol.30649-654，1989)。Sugaya等(出处同上)介绍的rol C启动子位于细菌Ri质粒上，已知能在韧皮部细胞中表达。其它合适的启动子对于本领域技术人员来说是众所周知的。
另外，根据本发明，ng.HuAFP可以从表达的植物细胞中分泌，其通过将ng.HuAFP核酸序列与任何合适的分泌信号肽融合而实现。
用于表达本发明ng.HuAFP转基因构建体的材料可得自众多来源，包括美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockland，MD)；或得自任何种子公司，例如W.Atlee Burpee Seed Co.(Warminster，PA)、Park Seed Co.(Greenwood，SC)、Johnny Seed Co.(Albion，ME)或Northrup King Seeds(Harstville，SC)。
以下文献介绍了用于产生转基因植物的方法Ausubel等，出处同上；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；GeMn等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990；Kindle，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA871228-1232，1990；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biology 42205，1991；BioRad(Hercules，CA)Technical Bulletin #1687(生物射弹颗粒传递系统)。表达载体可选自以下文献中提供的载体例如载于Cloning VectorsA Laboratory Manual(Pouwels等，1985，附录，1987)；Clontech Molecular Biology Catalog(Catalog 1992/93 Toolsfor the Molecular Biologist，Palo Alto，CA)；及其中引用的参考文献。其它表达构建体描述于Fraley等(美国专利第5,352,605号)。
适于建立转基因植物的各种载体是公众可获得的，以下文献中介绍了所述载体Pouwels等(出处同上)、Weissbach和Weissbach(出处同上)和Gelvin等(出处同上)。可以修饰这些植物表达载体以便用于本发明，所述载体包括(1)编码ng.HuAFP的核酸序列，(2)启动子(例如赋予以下类型的表达的启动子诱导型或组成型表达、病原体或创伤诱导型表达、环境或发育调节型表达、或者细胞特异性或组织特异性表达)，(3)指导ng.HuAFP分泌的信号序列，(4)显性选择标记，(5)转录起始位点，(6)核糖体结合位点，(7)RNA加工信号，(8)转录终止位点，和/或(9)聚腺苷酸化信号。所述启动子和信号序列与ng.HuAFP核酸序列操作性连接。
为了在发育、细胞、组织、激素或环境表达中应用，合适的5′上游非编码区得自其它基因，例如得自在分生组织发育、种子发育、胚发育或叶片发育中被调节的基因。
植物表达载体也可任选包括RNA加工信号，例如内含子，其在有效的RNA合成和积累中已显示出重要性(Callis等，Genes and Dev.11183-1200，1987)。RNA剪接序列的位置可以显著地影响ng.HuAFP转基因在植物中的表达水平。鉴于这一事实，内含子可位于ng.HuAFP转基因内调节子编码序列的上游或下游，以调节基因表达水平。
另外，表达载体可包括5′和3′调节控制序列，所述序列通常存在于植物基因的5′区和3′区(An等，Plant Cell 1115-122，1989)。例如，表达载体中可包括3′终止区，以增加mRNA的稳定性。一个这样的终止区可衍生自马铃薯PI-II终止区。另外，其它常用终止子可衍生自章鱼碱合酶信号或胭脂碱合酶信号。
植物表达载体通常也含有显性选择标记基因，用于鉴定已被转化的细胞。用于植物系统的选择性基因包括编码抗生素抗性基因的基因，例如编码抗以下抗生素的基因潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素。光合作用所需基因在光合作用缺陷株中也可用作选择标记。最后，编码除草剂抗性的基因可用作选择标记；有用的除草剂抗性基因包括编码膦丝菌素乙酰转移酶并赋予对广谱除草剂BASTA(Hoechst AG，Frankfurt，Germany)的抗性的bar基因。
有效使用选择标记，有利于测定植物细胞对特定选择试剂的敏感性并确定该试剂杀死大多数(如果不是全部的话)转化细胞的有效浓度。一些用于烟草转化的抗生素的有效浓度包括例如75-100μg/ml(卡那霉素)、20-50μg/ml(潮霉素)或5-10μg/ml(博来霉素)。以下文献描述了选择除草剂抗性转化子的有效策略例如Vasil I.K.，Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants，第I、II、III卷，LaboratoryProcedures and Their Applications Academic Press，New York，1984。
植物转化对于植物表达载体的构建，几个标准方法可用于将载体导入植物宿主，从而产生转基因植物。一般而言，参见Methods in Enzymology第153卷(″Recombinant DNA Part D″)1987，Wu和Grossman编著，Academic Press and European Patent Application EP 693554。这些方法包括(1)土壤杆菌介导的转化(根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌)(参见例如Lichtenstein和Fuller，载于Genetic Engineering，第6卷，PWJ Rigby主编，London，Academic Press，1987；Lichtenstein，C.P.和Draper，J，.载于DNA Cloning，第II卷，D.M.Glover主编，Oxford，IRI Press，1985；Horsch等，Science 233496-498，1984；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803，1983)；(2)粒子传递系统(参见例如Gordon-Kamm等，Plant Cell 2603，1990；Klein等，Nature 32770-73，1987)；或BioRadTechnical Bulletin 1687，出处同上)；(3)微注射方案(参见例如Green等，出处同上)；(4)聚乙二醇(PEG)方法(参见例如Draper等，Plant CellPhysiol.23451，1982；Paszkowski等，EMBO J.32712-2722，1984；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76835，1988)；(5)脂质体介导的DNA摄入(参见例如Freeman等，Plant Cell Physiol.251353，1984)；(6)电穿孔方案(参见例如Gelvin等，出处同上；Dekeyser等，出处同上；Fromm等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 825824，1985；Fromm等，Nature 319791，1986；Sheen，Plant Cell 21027，1990；Jang和Sheen，Plant Cell 61665，1994)；(7)涡旋方法(参见例如Kindle，出处同上)，和花浸泡(floraldip)方法(参见例如Clough和Bent，Plant J.16735-743，1998)。转化方法对本发明来说并不重要。任何方法，只要能提供有效转化，都可以采用。因为新方法可用于转化作物或其它宿主细胞，所以它们可直接使用。
下面概述一个具体技术的实例，即土壤杆菌介导的植物转化。采用该项技术，将基因转化到植物细胞基因组中的通用方法分成两步。首先，在大肠杆菌中进行克隆和DNA修饰步骤，然后将含有目标基因构建体的质粒通过接合或电穿孔转移到土壤杆菌中。第二步，所得土壤杆菌菌株用于转化植物细胞。因此，对于通用型植物表达载体来说，所述质粒含有复制起点(允许其在土壤杆菌中复制)和高拷贝数的复制起点(其在大肠杆菌中起作用)。这方便了在大肠杆菌中进行转基因制备和检测，然后再转移到土壤杆菌中供随后导入植物中。所述载体可携带抗性基因，一个用于细菌选择，例如链霉素，而另一个在植物中起作用，例如编码卡那霉素抗性或除草剂抗性的基因。载体上也可存在限制性内切核酸酶位点，用于添加一个或多个转基因和定向T-DNA边界序列(border sequence)，所述序列当被土壤杆菌转移功能识别时，能确定将转移到植物中的DNA区。
在另一个实例中，植物细胞可通过将沉积有克隆DNA的钨微粒轰击到细胞中而进行转化。在轰击所用的Biolistic Apparatus(Bio-Rad)中，装满火药(22口径Power Piston Tool Charge)或气动爆破驱动塑料微粒通过枪筒。沉淀有DNA的钨微粒的等分悬浮液放在塑料微粒前端。后者在有孔的丙烯酸填料板上点火，所述孔非常小，不能让微粒通过。结果，塑料微粒击碎填料板，钨微粒通过板上的孔持续射向其靶标。对于本发明来说，靶标可以是任何植物细胞、组织、种子或胚。在微粒上导入细胞的DNA整合到细胞核或叶绿体中。
一般而言，目前，转基因在植物细胞中的转移和表达对于本领域技术人员来说是常规操作，业已成为植物基因表达研究和产生农业或商业用改良植物品种的主要工具。
可以评价转基因细胞系的ng.HuAFP表达水平。首先测定RNA水平的表达，以鉴定和定量测定表达阳性植物。采用RNA分析的标准技术，包括PCR扩增测定和溶液杂交测定，前者使用设计用来仅扩增转基因RNA模板的寡核苷酸引物；后者使用转基因特异性探针(参见例如Ausubel等，出处同上)。然后通过蛋白质免疫印迹分析，使用特异性抗体，分析RNA阳性植物的蛋白表达(参见例如Ausubel等，出处同上)。另外，可以按照标准方案，分别使用ng.HuAFP特异性核苷酸探针和抗体，进行原位杂交和免疫细胞化学，以确定转基因组织内表达的位点。
转基因植物的再生按照标准植物组织培养技术，植物表达载体转化的植物细胞可以从单细胞、愈伤组织或叶圆盘(leaf discs)等再生。本领域众所周知的是，来自几乎所有植物的各种细胞、组织和器官都可以成功培养，以再生出完整的植株；所述技术描述于例如Vasil等，出处同上；Green等，出处同上；Weissbach和Weissbach，出处同上；Gelvin等，出处同上；Methods in Enzymology第153卷，Wu和Grossman编辑，AcademicPress，1987；Methods in Enzymology，第118卷，Wu和Grossman编辑，Academic Press，1987。以下文献介绍了从培养的原生质体再生植物Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures 1124-176，MacMillanPublishing Co.New York，1983；Davey，Protoplasts(1983)-LectureProceedings，第12-29页，Birkhauser，Basal，1983；Dale，Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings，第31-41页，Birkhauser，Basel，1983；Binding，Plant Protoplasts，第21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985。
从生物体液中纯化AFP可使用标准蛋白质纯化技术例如亲和色谱法(参见例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1998；另见Lubon等，U.S.P.N.5,831,141)或本领域技术人员已知的蛋白质纯化的其它方法，从转基因生物的生物体液中纯化ng.HuAFP。当分离ng.HuAFP后，必要时，可通过例如高效液相色谱法(HPLC；例如参见Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistryand Molecular Biology，Work和Burdon编著，Elsevier，1980)进一步纯化。纯化后，ng.HuAFP的纯度至少为80％，优选90％，更优选95％，最优选99％。
从转基因生物的生物体液中纯化的ng.HuAFP的用途分泌到转基因生物(例如哺乳动物)的生物体液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中的或者可以从生物体液中纯化的ng.HuAFP可用作治疗药。例如，可以将本发明方法产生的ng.HuAFP给予需要抑制癌细胞生长的患者，以诱导骨髓细胞增殖(例如在骨髓移植之后，或者在给予化疗或放疗等骨髓毒性治疗之后)，或者作为免疫移植药(例如抑制自体反应性免疫细胞增殖，抑制移植器官排斥(例如移植物抗宿主病)或治疗类风湿性关节炎、肌营养不良、系统性红斑狼疮、重症肌无力或胰岛素依赖性糖尿病)。
生物体液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中存在的或从中纯化的ng.HuAFP可以通过技术人员已知的常规方法，以有效量单独给予或与药物可接受的载体或稀释剂联合、或者与其它治疗药联合给予。
治疗有效量的ng.HuAFP或其药物可接受的盐的药物制剂可与适于常规给药的药物可接受的载体一起经以下途径给予口服、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内或皮内；皮下注射；吸入；或通过使用滴眼剂或植入物)、鼻腔、阴道、直肠、舌下或局部。含有治疗有效量的ng.HuAFP的药物制剂最好通过皮下、肌内或静脉内给予。
在以下文献中可找到本领域众所周知的制剂制备方法例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版)，A.Gennaro编著，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA。按照本领域已知用于制备药物组合物的任何方法，可以固体或液体形式制备供口服用的组合物。组合物可任选含有甜味剂、矫味剂、着色剂、香料和/或防腐剂，以便提供更具适口性的制剂。供口服给药用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在所述固体形式中，将ng.HuAFP与至少一种惰性药物可接受的载体或赋形剂混合。这其中可包括例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、磷酸钠或高岭土。也可使用粘合剂、缓冲剂和/或润滑剂(例如硬脂酸镁)。还可用肠溶衣来制备片剂和丸剂。可用增强剂来制备供口服用的组合物，以利于将ng.HuAFP吸收到受体血流中。
供口服给药的液体剂型包括药物可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和软质明胶胶囊剂。这些形式含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或油性介质。除了所述惰性稀释剂之外，组合物也可包括辅料，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂。
供胃肠外给药用的制剂包括无菌水性或非水溶液剂、混悬剂或乳剂。合适溶媒的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、氢化萘和注射用有机酯，例如油酸乙酯。所述制剂也可含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可使用生物相容的、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，以控制组合物中ng.HuAFP或其它活性化合物的释放。其它用于含有ng.HuAFP的组合物的潜在的胃肠外给药系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。
可通过例如截留细菌的滤器过滤、通过向组合物中掺入消毒剂、或者通过将组合物进行辐照或加热，可以对液体制剂进行灭菌。或者，它们可以制备成无菌形式的固体组合物，临用前将其溶于无菌水或其它无菌注射介质中。
供直肠或阴道给药用的组合物最好是栓剂，除了活性物质外，还可含有赋形剂，例如可可脂或栓剂用蜡。供鼻腔或舌下给药用的组合物也可用本领域已知的标准赋形剂制备。吸入制剂可含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘油胆酸酯和脱氧胆酸的水溶液剂，或者可以是油溶液剂，用于以滴鼻剂或喷雾剂或凝胶剂形式给药。
组合物中ng.HuAFP的用量可以不同。本领域技术人员将会理解，可以依据给药时间、给药途径、制剂的特性、排泄率、患者病症的特点和患者年龄、体重、健康状况和性别等各种因素，对准确的个人剂量稍微进行调整。通常，给予的日剂量水平为0.1μg/kg至100mg/kg体重，可作为单剂量或分成多次剂量。对于大多数治疗来说，预期每周给予一次或两次的胃肠外剂量为10μg/kg至5.0mg/kg体重。预期对于某些疾病可以给予高剂量(高达5mg/kg)，以允许至多每月给予一次。考虑到各给药途径的效果不同和待治疗疾病不同，预期所需剂量可有很大差异。例如，预期口服给药通常比静脉内注射需要较高剂量水平。这些剂量水平的差异将采用本领域众所周知的标准经验性途径来调节。一般而言，ng.HuAFP的精确治疗有效量由主治医师根据上述因素来确定。
ng.HuAFP可以以缓释组合物形式给予，例如美国专利第5,672,659号和美国专利第5,595,760号中描述的那些组合物。速释组合物或缓释组合物的使用取决于待治疗病症的类型。如果病症是急性或超急性(over-acute)疾病的话，则需要用速释形式而不是用缓释组合物进行治疗。或者，对于预防性治疗或长期治疗而言，则通常需要缓释组合物。
实施例以下实施例用于举例说明本发明，不得解释为以任何方式对本发明的限制。
实施例1表达重组人AFP(rHuAFP)和非糖基化人AFP(ng.HuAFP)的转基因动物的产生材料与方法重组DNA方法重组DNA方法按照以下文献进行Sambrook，Fritsch和Maniatis(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1989)。基因组文库和cDNA文库用放射性标记的寡核苷酸探针进行筛选，所述探针来自人AFP基因(GenBank检索号M16110)开头(5′)、中间和末尾(3′)的编码外显子。这三个探针的序列如下所示
AFP15′-ATGAAGTGGGTGGAATCAATTTTTTTAATT-3′(SEQ ID NO18)AFP25′-ATTCATTTATGAGATAGCAAGAAGGCAT-3′(SEQ ID NO19)AFP35′-AAAAAATCATGTCCTACATATGTTCTCAA-3′(SEQ ID NO20)人AFP基因克隆人AFP基因约为19kb，含有15个外显子(14个编码)，其中间插14个内含子。人AFP基因的完整序列已由Gibbs等(Biochemistry 261332-1343，1987)报道，见Genbank检索号M16610。该基因最初是克隆到约15kb的两个片段中，然后结合在一起，产生表达蛋白。
人胎盘基因组文库(Stratagene，La Jolla，CA)的平均插入片段大小在9kb和23kb之间，首先，将该文库用一系列互补寡核苷酸探针进行筛选，这些探针能识别人AFP基因开头、中间和末尾的外显子。初次筛选不会产生任何阳性克隆。然后，采用聚合酶链式反应(PCR)制备2个较大的DNA探针，从人基因组DNA扩增AFP基因的开头区和末尾区。用这些探针再次筛选文库，产生大约15kb的2个重叠lambda(λ)噬菌体克隆，其共同跨越人AFP基因(图2)的长度。
通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用含有HuAFP cDNA(Genbank检索号J00077)的质粒例如pHuAFP(描述于Murgita等，U.S.P.N.5,384,250)作为模板，并使用以下寡核苷酸引物，获得含有人AFP全长编码区并缺失翻译起始序列的DNA片段NH2(5′-AAACTC GAG AAG TGG GTG GAA-3′；SEQ ID NO21)和COOH(5′-AAACTC GAG TTA AAC TCC CAA AGC-3′；SEQ ID NO22)。
每次PCR反应都使用34μl DNA模板、10μl 10pmol/μl 5′-引物、10μl 10X反应缓冲液、20μl 1mM四种dNTP、2μl DMSO和1μl DNA模板、10μl 10pmol/μl 5′引物、10μl 10pmol/μl 3′引物、1μl甘油、10μlDMSO和1μl Pfu DNA聚合酶。退火、延伸和变性温度分别为50℃、72℃和94℃，进行30次循环，使用Gene Amp PCR System 9600。按照生产商的说明书，使用Genecleau的方法(Bio 101；Vista，CA)，将得自PCR反应的1783bp DNA用Xho I消化，然后通过下述步骤进行纯化从0.7％TAE琼脂糖凝胶中分离片段，接着再用凝胶萃取。
基因组DNA构建体的构建对两个重叠λ噬菌体克隆进行鉴定，其跨越rHuAFP编码序列的长度。将这些噬菌体插入片段亚克隆到supercos载体，供后续操作用(图1，gtc913和gtc912)。将5′-侧翼区、gtc913起始ATG上游的额外序列和gtc912最后一个外显子下游的额外3′-侧翼序列都除去。另外，在5′端添加一个Kozak序列，以确保有效的翻译起始。这通过下述步骤完成将限制酶“接头”插入到基因序列中，用于合适序列的后续切割，留下完整的侧翼序列(图1)。第二，用这两个插入片段共用的酶，将各载体中的5′和3′片段切下，以便让它们能连接在一起形成完整的基因。使用酶BglI，因为它在5′片段的3′端切割一次，并且在3′片段的5′端的相同位点切割一次。然后，将所得两个片段连接在β-酪蛋白表达载体(GBC350)的XhoI位点上，产生BC934。通过分别操作BC934内部的Blpl片段，通过使用缺口(gapped)诱变，改变了233位的正常糖基化位点(N→Q)。随后，将3个BIpI片段以合适方向重新连接，产生BC1055(图2A和图2B)。
所述转基因载体(参见图1；参见Meade等，U.S.P.N.5,827,690)含有经改变的山羊β-酪蛋白基因，其中Xho I位点取代了基因的编码部分。山羊β-酪蛋白基因中缺失的部分从外显子2中的Taq I位点延伸到外显子7中的Ppu MI位点。外显子2除了含有15个氨基酸的分泌信号外还含有翻译起始密码子。为了产生山羊β-酪蛋白/人AFP转基因，将Xho I/Xho I HuAFP cDNA连接到山羊β-酪蛋白基因在Xho I位点的外显子2和外显子7之间。完整的转基因含有6.2kb的5′山羊β-酪蛋白序列、1.8kb HuAFP cDNA和7.1kb的3′山羊β-酪蛋白侧翼序列。
供微注射和转染用的DNA的制备通过使用SalI和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA)彻底消化质粒，将转基因DNA从载体骨架上分离出来。然后，对消化物进行琼脂糖凝胶电泳，使用1X TAE(Maniatis等，1982)作为跑胶缓冲液。含有对应于表达盒的DNA片段的凝胶区域在紫外灯(长波)下进行目测。将含有目标DNA的条带切下，在1X TAE中进行电洗脱，分离所述DNA。该方法可用于各表达盒。
电洗脱后，将DNA片段进行浓缩并进一步纯化。最后的洗脱是在125μl微注射缓冲液(10mM Tris pH7.5，0.2mM EDTA)中进行。恰好在用于微注射之前，将微注射储液的等分试样用微注射缓冲液稀释，使各片段的终浓度为0.5ng/ml。
转基因小鼠的产生胚胎收集、核转移和胚胎转移对于核转移，从胎儿组织或皮肤活检组织中分离体细胞，转导，然后如上所述进行进一步表征。将含有rHuAFP或ng.HuAFP构建体的转导和表征的体细胞放入培养基中，用于进行核转移程序。将DNA(用微注射缓冲液稀释)微注射到雄性原核中。
CD1雌性小鼠用激素刺激排卵，从输卵管采集受精卵。通过机械去除MII卵母细胞赤道板，给采集的卵母细胞去核。然后，将去核卵母细胞(胞质体)用单独分离的转导体细胞(核体)进行重新构建。重新构建后，偶联体(couplet，去核卵母细胞和体细胞)通过电脉冲而融合在一起，这同时激活了重建的胚胎。然后，将活化的胚胎放入培养基中。将重建的胚胎保持在培养基中达24-48小时(在CZB培养基中)，在胚胎转移之前评价胚胎活力和发育状况，或者将其立即转移到假孕受体CD 1雌性小鼠的输卵管内。
核转移和胚胎培养之后，将活的发育胚胎转移到合适的受体动物体内。用玻璃移液管准确插入输卵管内，向每只雌性受体的输卵管(位于CL同侧)中转移20-30个二细胞期胚胎或40-50个单细胞期胚胎(在少量培养基中)，然后让其发育至足月。
建立者动物的鉴定通过蛋白酶K消化、接着用NaCl抽提和乙醇沉淀，从小鼠尾组织中分离基因组DNA，然后通过聚合酶链式反应(PCR)进行分析，以测定仅存于转基因中的β-酪蛋白/甲胎蛋白连接DNA序列。山羊耳组织和白细胞按类似方式进行处理，但是DNA依次用饱和苯酚、苯酚异戊醇和氯仿抽提，再用乙醇沉淀。对于PCR反应，大约250ng基因组DNA用含有1.0单位Taq聚合酶的50ml PCR缓冲液(20mMTris(pH8.3)、50mM KCl和1.5mM MgCl2、100mM脱氧核苷酸三磷酸和各引物，其浓度为600nM)稀释，在MJ Research DNA Engine中用标准PCR循环条件进行扩增。以下引物用于该PCR反应寡聚GTC17 GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC(SEQ ID NO23)；寡聚AFP-PCR3 TTTGTAAACCTCTTGTAAAGTTACAAG(SEQ ID NO24)；寡聚GEX7F CCAGGCACAGTCTCTAGTCTA(SEQ ID NO25)；寡聚GEX7R GGACAGGACCAAGTACAGGCT(SEQ ID NO26)。
DNA印迹分析将5μg基因组DNA用100单位EcoRI消化，接着通过0.8％琼脂糖凝胶电泳。然后通过在0.4N NaOH和紫外交联(Stratalinker，Sratagene)的毛细管作用，将凝胶转印到带电的尼龙膜(Genescreen Plus，New England Nuclear)上。在含有20μg/ml变性鲱精DNA的杂交缓冲液(5X SSC、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、20mM磷酸钠、1X Denhardt液、0.5％SDS)中预杂交后，加入探针，将印迹在42℃保温过夜。印迹洗涤如下在1X SSC、1％SDS中于室温洗涤1次20分钟；在0.5XSSC、0.5X SDS中于室温洗涤1次20分钟；再在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃洗涤3次，每次20分钟。洗涤后，对印迹进行放射自显影。
蛋白质印迹采用Harlow和Lane的免疫印迹方法(AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory，1988)，进行蛋白的免疫测定。将乳汁样品在PBS中稀释到1∶20，与2X SDS凝胶加样缓冲液(50mM Tris HCl(pH 6.8)、2％SDS、10％甘油、10％β-巯基乙醇)按1∶1混合，于65℃加热2分钟，然后进行SDS-PAGE。在转移缓冲液(50mM Tris、380mM甘氨酸、0.1％SDS、20％甲醇)中通过电印迹将凝胶上的蛋白转移到Immobilon P膜上。为了进行免疫染色，将膜与封闭缓冲液(4％脱脂奶粉(BioRad，Hercules，CA)/含有0.01％吐温-20的PBS)在室温下(RT)保温1小时。再将膜与抗-hAFP抗体(1∶5000的封闭缓冲液)一起在室温下保温1小时。在dH2O中快速洗涤3次后，将膜与第二抗体(1∶10000的封闭缓冲液)一起在室温下保温1小时。然后，将膜在dH2O中洗涤3次，每次4分钟，其中在PBS/吐温-20中洗涤一次，然后在dH2O中再洗涤6次，再用化学发光底物(ECL)显影，最后进行荧光自显影。
从基因组DNA构建体获得的转基因小鼠的分析用PCR鉴定从基因组构建体BC1055获得的转基因雌性小鼠，列在表I中。来自这些动物的乳汁通过蛋白质印迹进行分析，通过与已知浓度的hAFP标准品进行比较，对其表达水平进行评价。该表达分析结果见表I和表II以及图3(rHuAFP)和图4(ng.HuAFP)。通常在原始建立者动物的第二代雌性上进行表达分析，以测试转基因的遗传和嵌合性。认为第二代表达水平的下降是因为多个转基因整合位点与下游表达位点的分离，并将其遗传给下一代。
表I.小鼠乳汁表达结果-BC934构建体
表II.小鼠乳汁表达结果-BC1055构建体
山羊胎儿成纤维细胞的分离和ng.HuAFP转基因的转染山羊胎儿成纤维细胞是从怀孕山羊(Genzyme TransgenicCorporation)的山羊胎儿组织中分离而来的。制备ng.HuAFP转基因(BC1055)和新霉素抗性基因的DNA片段，然后使用LipofectAmine，以1-2μg转基因DNA片段/106细胞，将其共转导到山羊胎儿成纤维细胞中。经G418选择后，分离新霉素抗性细胞集落。扩增分离的克隆，将选定的细胞系进行冷藏。将这些细胞系进行PCR分析，使用BC1055特异性引物，确定转基因的存在。另外，对细胞系进行FISH分析，证实转基因的整合(见下文)。
转基因建立者山羊的产生将从原核生物DNA中纯化的山羊β-酪蛋白-HuAFP的15.1kb片段以1.0μg/ml(溶于10mM Tris，pH7.5，0.1mM EDTA)的浓度，注射到所采集的胚胎的原核中，产生转基因山羊。然后，将注射的胚胎转移到受体母体中。通过聚合酶链式反应(PCR)和DNA印迹分析，分析血的基因组DNA，测定转基因的存在，从而鉴定建立者(Fo)转基因山羊。对于PCR分析，反应中使用用于产生HuAFP cDNA的同样的两个寡核苷酸。对于DNA印迹分析，将DNA在1％TBE琼脂糖凝胶上分离，转印到硝基纤维素上，然后用随机引物32P标记的1.8kbHuAFP cDNA进行探测。让经鉴定的建立者可以与非转基因动物交配，以产生转基因子代。或者，转基因子代可通过如上所述的核转移而获得。如上所述，转基因的遗传可以通过分析血液和其它组织的基因组DNA而检出。
建立者山羊F093的遗传分析一只健康母山羊(F093)于2002年3月11日出生。为了检测该山羊是否携带ng.HuAFP转基因，进行了血液和耳组织的PCR分析。开始，同时使用2个PCR引物对。第一对如图5所示，对转基因是特异性的，所得332bp产物跨越5′β-酪蛋白和5′ng.HuAFP序列的连接点。第二对引物对识别山羊β-酪蛋白外显子7(其在转基因构建体中并不存在)，得到439bp的产物。图6A和图6B显示ng.HuAFP转基因存在于山羊F093的血样和耳样中。已表征的转导细胞系用作阳性对照。携带ng.HuAFP转基因的流产胎儿耳组织也可用作阳性对照。
证实了基因型后，进行DNA印迹分析，以估计拷贝数并排除总转基因重排(图7)。所用的DNA探针是3′β-酪蛋白基因的XhoI/HindIII片段(图2，3′BC探针)，该片段存在于转基因和内源山羊β-酪蛋白基因中。通过比较转基因和内源基因的相对强度，可以估计转基因拷贝数。内源基因信号以两拷贝的基因存在于二倍体基因组中。如图7所示，F093样品中的2个条带看来其强度十分相似。扫描光密度测定法(Molecular Dynamics)证实1∶1的比率(F026流产儿的光密度测定为13∶1的比率)。
荧光原位杂交(FISH)分析采用标准培养和制备程序，以从山羊F093培养的血液淋巴细胞中得到中期核和间期核。使细胞核沉积在玻片上，与来自含有8kb人AFP基因组序列的构建体的洋地黄毒苷标记探针进行杂交。结合的探针用辣根过氧化物酶缀合的抗体进行扩增，然后用tyramide-缀合的异硫氰酸荧光素(FITC，绿色荧光染料)进行检测。核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色染料)进行复染。用MetaMorph软件得到FISH图像。
中期染色体和间期核的FISH图像显示图8所示的转基因。转基因信号位于大的常染色体中间的“q”。FISH分析与一个转基因整合位点的存在是一致的。
泌乳的诱导采用超过12天周期的激素疗法和手工刺激，诱导12月龄或更大的雌性动物泌乳。在前4天，给动物皮下注射溶于100％乙醇的0.1mg/kg雌二醇17-β和0.25mg/kg黄体酮。这样的日剂量分为早晚两次注射。每天触摸乳房一次，每天早上用手刺激乳头5-10分钟。每天用手工方法给泌乳的转基因雌性动物挤奶两次，将所得乳汁在-20℃冷藏。
蛋白质纯化含有rHuAFP或ng.HuAFP的转基因山羊乳汁经切向流过滤澄清，以除去酪蛋白胶团和其它污染蛋白质。所得含有rHuAFP或ng.HuAFP的滤液(乳清部分)通过22μm滤器过滤。通过加入等体积20mM咪唑(pH6.7)，调节pH和离子强度，然后，将溶液通过用20mM咪唑(pH6.7)平衡的含有Pharmacia Blue SEPHAROSE 6 Fast flow珠的柱子，从乳清部分纯化rHuAFP或ng.HuAFP。流出的rHuAFP或ng.HuAFP用装有Pharmacia Q HP珠并用20mM咪唑(pH6.7)平衡的柱子捕获。rHuAFP或ng.HuAFP用0-250mM NaCl的20mM咪唑(pH6.7)进行梯度洗脱。经蛋白质印迹、ELISA或考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶测定，将含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合并，并将NaCl浓度调节到725mM。然后，将该合并的流分加到装有Pharmacia PhenylHiSub珠并用1M NaCl、20mM咪唑(pH6.7)平衡的柱子上。将rHuAFP或ng.HuAFP用1-10mM NaCl的20mM咪唑(pH6.7)进行梯度洗脱。经蛋白质印迹、ELISA或考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶测定，将含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合并，然后超滤浓缩。
将浓缩样品加到用磷酸盐缓冲液平衡的SUPERDEX200 HR柱子上，完成rHuAFP或ng.HuAFP的最后纯化。经蛋白质印迹、ELISA或考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶测定，将含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合并。
以上结果证明，重组天然人AFP以及重组非糖基化形式的人甲胎蛋白(ng.HuAFP)被克隆并在几个转基因小鼠品系的乳汁中表达，作为基因组的“小基因(mini-gene)”。该基因的表达处于山羊β-酪蛋白调节元件的控制之下。在非嵌合小鼠(能将转基因遗传给后代的小鼠)中的表达水平的范围为1.0-20mg/ml。正如先前研究所预计的一样，基因组表达构建体看来显示出更高水平的ng.HuAFP表达，尽管ng.HuAFP在来自cDNA构建体的动物中表达也相当高(5-10mg/ml)。来自所有构建体的转基因产物与hAFP特异性抗体都具有免疫反应活性。
我们也产生了携带用于在小鼠中高水平表达ng.HuAFP的相同基因组转基因的建立者转基因山羊。对该山羊F093的若干组织进行遗传分析证实，她确实是转基因的并且在一个整合位点上携带大约两拷贝的ng.HuAFP转基因。
其他实施方案以下出版物介绍了将重组蛋白分泌到乳汁中的转基因动物的产生、检测和分析以及重组蛋白的纯化。这些出版物通过引用结合到本文中Hurwitz等，U.S.P.N.5,648,243(山羊)；Meade等，U.S.P.N.5,827,690(山羊)；DiTullio等，U.S.P.N.5,843,705(山羊)；Clark等，U.S.P.N.5,322,775(绵羊)；Garner等，U.S.P.N.5,639,940(绵羊)；Deboer等，U.S.P.N.5,633,076(母牛)；Drohan等，U.S.P.N.5,589,604(猪和小鼠)。Kerr等(Nat.Biotechnol.1675-79，1998)介绍了将重组蛋白分泌到尿液中的转基因动物的产生和分析，以及重组蛋白的纯化，所述文献通过引用结合到本文中。
本发明说明书所提到的所有出版物和专利申请都通过引用结合到本文中，其程度如同每篇出版物或专利申请具体而单独指明通过引用全部结合到本文中一样。
虽然本发明是通过其具体的实施方案进行描述的，但是，人们知道，可以作进一步修改，而且本申请可包括通常在遵循本发明原理的基础上对本发明的任何变化、用途或更改，包括对本发明公开内容的偏离，所述偏离是在本发明所属领域已知的或常规实践范围内并且可用于上文所提出的基本特征。
序列表<110>梅里麦克药品公司等(Merrimack Pharmaceuticals，Inc.et al.)<120>非糖基化人甲胎蛋白、制备方法及其应用<130>06727/012CN1<150>PCT/US2004/023474<151>2004-07-21<150>10/624,380<151>2003-07-22<160>26<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2027<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(45)...(1874)<400>1atattgtgct tccaccactg ccaataacaa aataactagc aacc atg aag tgg gtg 56Met Lys Trp Val1gaa tca att ttt tta att ttc cta cta aat ttt act gaa tcc aga aca 104Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg Thr5 10 15 20ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac caa 152Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr Gln25 30 35tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt gcc 200Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe Ala40 45 50cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg aaa 248Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val Lys
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atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc ttc cag1304Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln405 410 415 420aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct tac aca1352Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr Thr425 430 435aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc acc aga1400Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg440 445 450aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag gac aaa1448Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys455 460 465cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga cac tta1496Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu470 475 480tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc cag tgc1544Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys485 490 495 500tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc ttg gtg1592Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val505 510 515gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag ttc att1640Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile520 525 530ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa acg atg1688Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met535 540 545aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa ata aca1736Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr550 555 560gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg ttg gag1784Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu565 570 575 580aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa gag gga1832Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly585 590 595caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt taa1874
Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val *600 605attacttcag gggaagagaa gacaaaacga gtctttcatt cggtgtgaac ttttctcttt 1934aattttaact gatttaacac tttttgtgaa ttaatgaaat gataaagact tttatgtgag 1994atttccttat cacagaaata aaatatctcc aaa 2027<210>6<211>609<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>变异体<222>251<223>Xaa＝任何氨基酸<400>6Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr1 5 10 15Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu20 25 30Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr35 40 45Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser50 55 60Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp65 70 75 80Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu85 90 95Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp100 105 110Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His115 120 125Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro130 135 140Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn145 150 155 160Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro165 170 175Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys180 185 190Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr195 200 205Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys210 215 220Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Xaa Phe Thr Glu Ile Gln
245 250 255Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly260 265 270Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile275 280 285Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys290 295 300Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp305 310 315 320Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp325 330 335Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala340 345 350Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser355 360 365Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys370 375 380Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu385 390 395 400Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys405 410 415Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu420 425 430Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met435 440 445Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu450 455 460Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile465 470 475 480Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly485 490 495Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe500 505 510Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp515 520 525Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala530 535 540Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys545 550 555 560Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser565 570 575Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe580 585 590Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly595 600 605Val
<210>7<211>1776<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1776)<221>其他特征<222>699<223>n＝A或G<400>7aga aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct 48Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15tac caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt 96Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30ttt gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg 144Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45gtg aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag 192Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60tct tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt 240Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80tgc cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc 288Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95agc caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag 336Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110ccc act cca gca tcg atc cca ctt ttc caa gtt cca gaa cct gtc aca 384Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125agc tgt gaa gca tat gaa gaa gac agg gag aca ttc atg aac aaa ttc 432Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140
att tat gag ata gca aga agg cat ccc ttc ctg tat gca cct aca att480Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160ctt ctt tgg gct gct cgc tat gac aaa ata att cca tct tgc tgc aaa528Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175gct gaa aat gca gtt gaa tgc ttc caa aca aag gca gca aca gtt aca576Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190aaa gaa tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta624Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205atg aaa aat ttt ggg acc cga act ttc caa gcc ata act gtt act aaa672Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220ctg agt cag aag ttt acc aaa gtt can ttt act gaa atc cag aaa cta720Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Xaa Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240gtc ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg768Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255ctg gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct816Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270caa caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc864Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285acg ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa912Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300cct gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat960Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp305 310 315 320ttt aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt1008Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe325 330 335
gtt cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att1056Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile340 345 350cta aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag1104Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln355 360 365act gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag1152Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln370 375 380aaa tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc1200Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu385 390 395 400ttc cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct1248Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala405 410 415tac aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc1296Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile420 425 430acc aga aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag1344Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu435 440 445gac aaa cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga1392Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly450 455 460cac tta tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc1440His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly465 470 475 480cag tgc tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc1488Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser485 490 495ttg gtg gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag1536Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys500 505 510ttc att ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa1584Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln515 520 525acg atg aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa1632
Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln530 535 540ata aca gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg 1680Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu545 550 555 560ttg gag aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa 1728Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu565 570 575gag gga caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt taa 1776Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val *580 585 590<210>8<211>591<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205
Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Gln Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp305 310 315 320Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe325 330 335Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile340 345 350Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln355 360 365Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln370 375 380Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu385 390 395 400Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala405 410 415Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile420 425 430Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu435 440 445Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly450 455 460His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly465 470 475 480Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser485 490 495Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys500 505 510Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln515 520 525Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln530 535 540Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu545 550 555 560Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu565 570 575Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val580 585 590
<210>9<211>198<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser195<210>10<211>192<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr1 5 10 15Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr20 25 30Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His35 40 45Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp50 55 60
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Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe325 330 335Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile340 345 350Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln355 360 365Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln370 375 380Lys Tyr Ile Gln Glu Ser385 390<210>13<211>393<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr1 5 10 15Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr20 25 30Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His35 40 45Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp50 55 60Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser65 70 75 80Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln85 90 95Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro100 105 110Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser115 120 125Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg130 135 140Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly145 150 155 160Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu165 170 175Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser180 185 190Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu195 200 205Tyr Tyr Leu Gln Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro210 215 220Gln Leu Thr Ser Ser Ala Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala225 230 235 240Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys
245 250 255Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His260 265 270Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser275 280 285Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr290 295 300Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp305 310 315 320Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe325 330 335Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu340 345 350Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln355 360 365Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile370 375 380Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val385 390<210>14<211>325<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr1 5 10 15Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His20 25 30Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg35 40 45Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn50 55 60Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln65 70 75 80Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu85 90 95Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys100 105 110Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala115 120 125Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln130 135 140Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser145 150 155 160Ser Ala Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr165 170 175
Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala180 185 190Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro195 200 205Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg210 215 220Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro225 230 235 240Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala245 250 255Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu260 265 270Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile275 280 285Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln290 295 300Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg305 310 315 320Ala Ala Leu Gly Val325<210>15<211>192<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr1 5 10 15Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr20 25 30Lys Val Gln Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His35 40 45Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp50 55 60Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser65 70 75 80Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln85 90 95Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro100 105 110Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser115 120 125Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg130 135 140Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly145 150 155 160Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu
165 170 175Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser180 185 190<210>16<211>390<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>16Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Gln Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300
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<223>合成的<400>18atgaagtggg tggaatcaat ttttttaatt 30<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>19attcatttat gagatagcaa gaaggcat28<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成的<400>20aaaaaatcat gtcctacata tgttctcaa 29<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>21aaactcgaga agtgggtgga a 21<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>22aaactcgagt taaactccca aagc 24<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>23gattgacaag taatacgctg tttcctc27<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>24
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<223>合成的<400>25ccaggcacag tctctagtct a 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的<400>26ggacaggacc aagtacaggc t 2权利要求
1.一种核酸分子，所述分子编码非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)或其非糖基化片段。
2.权利要求1的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5所示序列的核苷酸45-1874。
3.一种核酸分子，所述分子包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接的启动子，所述启动子使ng.HuAFP能表达，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使细胞能分泌所述ng.HuAFP。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是大肠杆菌(E.coli)。
5.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是真核细胞。
6.权利要求5的核酸分子，其中所述真核细胞是酵母细胞或动物细胞。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述动物细胞是在转基因动物体内。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述转基因动物是哺乳动物。
9.权利要求8的核酸分子，其中所述哺乳动物是山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马或美洲驼。
10.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是转基因动物体内的生物体液产生细胞；所述启动子使所述ng.HuAFP能在所述生物体液产生细胞中表达；所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述转基因动物的生物体液中。
11.权利要求10的核酸分子，其中所述生物体液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
12.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是在转基因动物体内；所述启动子是乳汁特异性启动子，该启动子使所述ng.HuAFP能在所述动物的乳汁产生细胞中表达；所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述动物的乳汁中。
13.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是在转基因动物体内；所述启动子是尿液特异性启动子，该启动子使所述ng.HuAFP能在所述动物的尿液产生细胞中表达；所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述动物的尿液中。
14.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是在转基因动物体内；所述启动子是血液特异性启动子，该启动子使所述ng.HuAFP能在所述动物的血液产生细胞中表达；所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述动物的血液中。
15.权利要求3的核酸分子，其中所述细胞是在转基因动物体内；所述启动子是淋巴液特异性启动子，该启动子使所述ng.HuAFP能在所述动物的淋巴液产生细胞中表达；所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述动物的淋巴液中。
16.非糖基化HuAFP(ng.HuAFP)，其包含在SEQ ID NO4中的第233位上的谷氨酰胺残基。
17.一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列。
18.一种基本纯的非糖基化人甲胎蛋白的生物活性片段。
19.权利要求18的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO15中所示的氨基酸序列即结构域II、SEQ ID NO16中所示的氨基酸序列即结构域I+II或SEQ ID NO17中所示的氨基酸序列即结构域II+III，或者两个或两个以上的所述氨基酸序列。
20.一种非人类转基因真核生物，所述生物表达ng.HuAFP并将其分泌到生物体液中。
21.权利要求20的转基因生物，其中所述转基因生物是哺乳动物。
22.权利要求21的转基因生物，其中所述哺乳动物是山羊、绵羊、骆驼、牛、猪、兔、马或美洲驼。
23.权利要求21的转基因生物，其中所述生物体液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
24.权利要求21的转基因生物，其中所述ng.HuAFP是由转基因表达的，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)启动子，所述启动子与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接并且使得所述转基因生物的细胞能够表达ng.HuAFP并将蛋白分泌到生物体液中，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述转基因生物的所述细胞将所述ng.HuAFP分泌到所述生物体液中。
25.权利要求24的转基因生物，其中所述启动子是乳汁特异性启动子、尿液特异性启动子、血液特异性启动子或淋巴液特异性启动子，所述前导序列使所述ng.HuAFP能分别分泌到乳汁、尿液、血液或淋巴液中。
26.权利要求24的转基因生物，其中所述启动子是乳汁特异性启动子，所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到乳汁中。
27.权利要求26的转基因生物，其中所述转基因生物是山羊。
28.权利要求24的转基因生物，其中所述启动子是尿液特异性启动子，所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到尿液中。
29.权利要求28的转基因生物，其中所述哺乳动物是山羊。
30.权利要求24的转基因生物，其中所述启动子是血液特异性启动子，所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到血液中。
31.权利要求30的转基因生物，其中所述哺乳动物是山羊。
32.权利要求24的转基因生物，其中所述启动子是淋巴液特异性启动子，所述前导序列使所述ng.HuAFP能分泌到淋巴液中。
33.权利要求32的转基因生物，其中所述哺乳动物是山羊。
34.包含ng.HuAFP的非人类哺乳动物乳汁。
35.权利要求34的乳汁，其中所述ng.HuAFP是可溶的并由转基因非人类哺乳动物产生，所述动物的乳汁产生细胞表达转基因，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接的乳汁特异性启动子，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述乳汁产生细胞将ng.HuAFP分泌到所述哺乳动物的乳汁中。
36.包含ng.HuAFP的非人类哺乳动物尿液。
37.权利要求36的尿液，其中所述ng.HuAFP是可溶的并由转基因非人类哺乳动物产生，所述动物的尿液产生细胞表达转基因，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接的尿液特异性启动子，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述尿液产生细胞将ng.HuAFP分泌到所述哺乳动物的尿液中。
38.包含ng.HuAFP的非人类哺乳动物血液。
39.权利要求38的血液，其中所述ng.HuAFP是可溶的并由转基因非人类哺乳动物产生，所述动物的血液产生细胞表达转基因，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接的血液特异性启动子，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述血液产生细胞将ng.HuAFP分泌到所述哺乳动物的血液中。
40.包含ng.HuAFP的非人类哺乳动物淋巴液。
41.权利要求40的血液，其中所述ng.HuAFP是可溶的并由转基因非人类哺乳动物产生，所述动物的淋巴液产生细胞表达转基因，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸序列，(ii)与所述ng.HuAFP编码序列操作性连接的淋巴液特异性启动子，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述淋巴液产生细胞将ng.HuAFP分泌到所述哺乳动物的淋巴液中。
42.一种制备ng.HuAFP的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供用转基因转导的细胞，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)启动子，所述启动子与所述ng.HuAFP编码分子操作性连接并且使所述细胞能表达所述ng.HuAFP，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述细胞能分泌所述ng.HuAFP；和(b)培养所述转导细胞，其中所述细胞表达并分泌所述ng.HuAFP。
43.权利要求42的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
44.权利要求42的方法，其中所述细胞是真核细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞或动物细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述酵母细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
47.权利要求43的方法，其中所述细胞将所述ng.HuAFP分泌到细胞培养基中。
48.权利要求45的方法，其中所述动物细胞是乳汁产生细胞、尿液产生细胞、血液产生细胞或淋巴液产生细胞。
49.一种制备ng.HuAFP的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供包含转基因的转基因生物，所述转基因包含(i)编码ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)启动子，所述启动子与所述ng.HuAFP编码分子操作性连接并且使得所述转基因生物的生物体液产生细胞能够表达ng.HuAFP，和(iii)编码蛋白分泌信号的前导序列，所述前导序列使所述生物体液产生细胞能分泌所述rHuAFP；和(b)从所述转基因生物中收集包含所述ng.HuAFP的生物体液。
50.权利要求49的方法，其中所述生物体液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
51.权利要求50的方法，其中所述生物体液是乳汁。
52.权利要求51的方法，其中所述ng.HuAFP是从所述乳汁中纯化的。
53.权利要求49的方法，其中所述启动子是乳汁特异性启动子，所述启动子使所述转基因生物的乳汁产生细胞中能表达ng.HuAFP。
54.权利要求50的方法，其中所述生物体液是尿液。
55.权利要求54的方法，其中所述ng.HuAFP是从所述尿液中纯化的。
56.权利要求49的方法，其中所述启动子是尿液特异性启动子，所述启动子使所述转基因生物的尿液产生细胞中能表达ng.HuAFP。
57.权利要求50的方法，其中所述生物体液是血液。
58.权利要求57的方法，其中所述ng.HuAFP是从所述血液中纯化的。
59.权利要求49的方法，其中所述启动子是血液特异性启动子，所述启动子使所述转基因生物的血液产生细胞中能表达ng.HuAFP。
60.权利要求50的方法，其中所述生物体液是淋巴液。
61.权利要求60的方法，其中所述ng.HuAFP是从所述淋巴液中纯化的。
62.权利要求49的方法，其中所述启动子是淋巴液特异性启动子，所述启动子使所述转基因生物的淋巴液产生细胞中能表达ng.HuAFP。
63.一种治疗需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的ng.HuAFP，所述ng.HuAFP是从包含所述ng.HuAFP的细胞培养基中纯化的。
64.一种治疗需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的含有ng.HuAFP的非人类哺乳动物的乳汁。
65.一种治疗需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的ng.HuAFP，所述ng.HuAFP是从包含所述ng.HuAFP的非人类哺乳动物的生物体液中纯化的。
66.权利要求65的方法，其中所述生物体液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
67.一种包含ng.HuAFP的治疗组合物，所述ng.HuAFP包含SEQID NO8中所示的氨基酸序列。
68.ng.HuAFP在制备用于治疗免疫性疾病的药物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
69.权利要求68的用途，其中所述免疫性疾病是艾滋病(HIV)。
70.ng.HuAFP在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
71.权利要求70的用途，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、肌营养不良、系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病或银屑病。
72.ng.HuAFP在制备免疫抑制药中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
73.权利要求72的用途，其中所述免疫抑制药抑制或治疗自体反应性免疫细胞增殖或移植物抗宿主病。
74.ng.HuAFP在制备用于减轻化疗副作用或放疗副作用的药物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
75.ng.HuAFP在制备用于促进细胞增殖的药物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列。
76.权利要求44的方法，其中所述细胞将所述ng.HuAFP分泌到细胞培养基中。
全文摘要
本发明的特征为非糖基化人甲胎蛋白、制备方法及其应用。
文档编号C07K14/47GK1826350SQ200480020701
公开日2006年8月30日 申请日期2004年7月21日 优先权日2003年7月22日
发明者R·穆尔罗伊, I·克兰 申请人:梅里麦克药品公司