专利名称：一种转Bar基因水稻的溯源检测方法
技术领域：
本发明属于农产品中转Bar基因水稻及其初级加工品的安全与溯源检测技术领域，具体涉及一种转Bar基因水稻的溯源检测方法。
背景技术：
随着我国经济的快速发展和人们对健康、环保和食品安全意识的提高，食品的溯源与安全检测技术特别是转基因食品检测技术已成为亟需解决的问题。我国是世界上最大的稻米生产国，常年水稻种植面积约3000万公顷以上，占世界水稻总种植面积的20%，稻谷总产近20000万吨，占世界稻谷总产的35. 7%，同时我国也是世界上最大的稻米消费国， 稻米产量对我国乃至世界农业的稳定有着极为重要的影响。由于常规育种难以克服物种亲缘界限，难以满足多样化发展的需求，而转基因技术可以打破物种界限，实现传统育种技术所不能做到的物种间的基因转移，是近些年来的发展热点也是未来的发展趋势。2009年11 月27日，中国做出一项里程碑式的决定为华中农业大学研发的两种转基因抗虫水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”颁发转基因水稻安全证书，这对其他类型转基因水稻的发展亦有着非凡的意义，而世界首例商业化转基因水稻为转Bar基因水稻，我国转Bar基因水稻也因其拥有良好的应用前景，已被批准进入环境释放阶段。但随着转基因农作物商品化速度的日益加快，社会公众对转基因产品的安全性和风险的关注程度与日俱增，同时近年国内外的非法转基因水稻污染事件时有发生，如2006年在香港及广州市场发现亨氏婴儿营养米粉中含有非法转基因水稻成分。一直以来，我国对转基因农产品的监管十分重视，2002年卫生部颁布了《转基因食品卫生管理办法》，要求对转基因植物及其加工产品进行定性检测，规定食品产品(包括原料及其加工的食品)中若含有基因修饰有机体或/和表达产物的，要进行标注，而同年开始实施的《农业转基因生物标识管理办法》也明确指出“凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因生物，应当进行标识；未标识和不按规定标识的，不得进口或销售。”检测是监管的前提，因此有必要在转Bar基因水稻商品化之前建立起一套有效的检测措施，以配合未来的监管工作，而PCR检测技术是目前国际上主流的转基因检测技术，但普通单重PCR检测效率偏低，难以满足实际检测中高通量的需求，巢式PCR虽然具有高效率，但对于实验条件及操作人员的技术要求较高，因此开发一种简单、准确、高效的转 Bar基因稻米多重PCR检测方法就显得十分必要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种准确、简捷、快速的转Bar基因水稻的溯源检测方法。本发明采用的目的可通过如下技术方案实现一种转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，包括如下步骤(1)提取水稻基因组DNA ；(2)以步骤(1)提取的水稻基因组DNA为模板，对35S启动子、NOS终止子、SPS水稻内源基因、Bar基因进行多重PCR扩增；(3)将扩增产物进行凝胶电泳，并根据电泳结果判定样品判断是否属于转Bar基因水稻或转Bar基因水稻制品；其中，所述的多重PCR扩增引物为
3 5 S-F5，-TAAC AGAACTCGCCGTAAAG-3，SEQ ID No. 13 5 S-R5，-ATAGTGGGATTGTGCGTC AT-3，SEQ ID No.2NOS-F5，-AAGATTGAATCCTGTTGCCG-3，SEQIDNo.3NOS-R5，-TAGTAAC ATAGATGACACCG-3，SEQ ID No.4Bar-F5，--CC AGAAACCC ACGTC ATGCC-3，SEQ ID No. 5Bar-R5，-C AGGAACCGC AGGAGTGGA-3，SEQIDNo.6SPS-F5，-TTGCGCCTGAACGGATAT-3 ‘SEQIDNo.7SPS-R5，-GGAGAAGC ACTGGACGAGG-3，SEQ ID No. 8。所述判断依据为如果凝胶电泳能够检测出35S启动子、Bar基因或NOS终止子以及SPS水稻内源基因特异性扩增产物条带则说明该样品为转Bar基因水稻或转Bar基因水稻。所述的多重PCR扩增反应体系为12. 5 μ L预混液，浓度均为10 μ mol/L的35S， NOS, Bar, SPS 引物分别为 0. 5,0. 5,0. 2，1. 0 μ L，IOOng 模板 DNA,加无菌水至 25 μ L ；其中所述的预混液由 12. 5U 的 DNA 聚合酶；dNTP 各 0. 4mmol/L ；50mmol/L KCl ； IOmmol/L Tris-HCl (pH8. 4) ；1. 5mmol/L MgCl2 组成。所述的多重PCR扩增反应条件为预变性94°C 5min;变性94°C lmin，退火57°C lmin，延伸 72°C lmin，40 个循环；72°C延伸 7min。所述的水稻基因组DNA提取包括以下步骤(A)称取2011^样品，粉碎后置于1.51^离心管中，加入20μ L 0. 25mol/L NaOH溶液，95°C 20s ；(B)加入 150 μ L 0. 25mol/L HCL 溶液和 150 μ L 0. 5mol/L Tris-HCL (pH = 8· 0)， 85 °C 3min ；(C)加入400 μ L的三氯甲烷，颠倒混勻离心管2-3次，静置10min ； 12000g离心 5min,上清液即为水稻基因组DNA提取液。DNA提取也可按照“GB/T 19495. 3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法”提取。步骤(1)提取的水稻基因组DNA提取液中水稻基因组20ng/μ 1以上，纯度达到在 Α260/280在1. 5-2. 0之间才能作为步骤O)多重PCR扩增反应模板。所述的样品为水稻稻米或稻米的初级加工品。所述的稻米的初级加工品为初级加工品为大米、米粉、米饭、米线、米酒酒糟等。所述步骤(3)中使用的凝胶电泳为使用3.0%的琼脂糖凝胶在85V条件下电泳 30mino
本发明的有益效果在于本发明针对转Bar基因稻米的35S启动子、NOS终止子、 SPS水稻内源基因、Bar基因设计了特异性引物，利用这四对引物对待检样品的DNA提取液进行四重PCR可以一次性完成目标基因的扩增，从而判定待测样品是否为转bar基因水稻或转bar基因水稻制品。本发明检测方法是一种bar基因的高通量检测方法，在保证检测准确性的同时，能一次性完成对转Bar基因稻米的定性检测，操作简单，减少了假阳性检测结果，缩短了检测时间，降低了检测成本，具有实际意义。
图1、阳性样品(转Bar基因米粉)的四重PCR检测结果。M :DL2000 ；K 空白对照；N 阴性样品；T 阳性样品。图2、转Bar基因酒糟四重PCR检测结果。M :DL2000 ；K 空白对照；N 阴性样品；S 转Bar基因酒糟；T 阳性样品。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明展开进一步的说明实施例11、实验材料阳性样品由香125S/Bar68-l抗除草剂转基因稻(中科院亚热带农业生态研究所)制作的米粉；阴性样品武育粳3号(江苏省农垦米业有限公司)；待检样品1 由转Bar基因水稻制作的酒糟；试剂GoTaqGreen Master Mix(2X), DL2000 分子质量标准。2、实验仪器仪器稳流稳压电泳仪(DY602S，生兴生物技术有限公司)；凝胶成像仪 (Universal HoodII型，BIO-RAD公司)；高速台式离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；核酸蛋白分析仪(NAN0DR0P-2000,Thermo Scientific公司)；基因扩增仪(9902型， Applied Biosystems ) ；巨(SG403AM, The Baker company)。3、实验具体步骤(1)模板DNA的提取(A)称取20mg样品(阴性材料及阳性材料需粉碎至8目以上)置于1. 5mL离心管中，加入 200yL 0. 25mol/LNa0H 溶液，95°C 20s ； (B)加入 150yL 0. 25mol/LHCL 溶液和 150 μ L 0. 5mol/LTris-HCL (pH = 8. 0),85 °C 3min ； (C)加入 400 μ L 的三氯甲烷，颠倒混勻离心管2-3次，静置IOmin ； 12000g离心5min，上清液可作PCR模板。以无菌水代替样品为
空白对照。(2) DNA样品浓度的测定 用NAN0DR0P-2000核酸蛋白分析仪检测所提DNA模板的质量浓度和纯度。
阴性样品DNA模板的质量浓度为38. 5ng/ μ 1，Α260/280为1. 61 ；阳性样品DNA模板的质量浓度为42. 2ng/y 1, A260/280为1. 73 ；待检样品DNA模板的质量浓度为40. 7ng/ μ 1，Α260/280 为 1. 58。
(3) PCR扩增反应依次添加反应体系12. 5 μ L预混液(包括12. 5U的DNA聚合酶，dNTP各0. 4mmol/ L，2XPCR缓冲液)；35S, NOS, Bar, SPS引物分别为0. 5，0. 5，0. 2，1. 0 μ L(引物浓度均为 10 μ mol/L)，IOOng DNA 模板，加无菌水至 25 μ L。引物信息如下表
权利要求
1. 一种转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，包括如下步骤(1)提取水稻基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的水稻基因组DNA为模板，对35S启动子、NOS终止子、SPS水稻内源基因、Bar基因进行多重PCR扩增；(3)将扩增产物进行凝胶电泳，并根据电泳结果判断样品是否属于转Bar基因水稻或转Bar基因水稻制品；其特征在于所述的多重PCR扩增引物为3 5 S-F5，-TAAC AGAACTCGCCGTAAAG-3，SEQ ID No. 13 5 S-R5，-ATAGTGGGATTGTGCGTC AT-3，SEQ ID No.2NOS-F5，·-AAGATTGAATCCTGTTGCCG-3 ‘SEQIDNo.3NOS-R5，-TAGTAAC ATAGATGACACCG-3，SEQ ID No.4Bar-F5，--CC AGAAACCC ACGTC ATGCC-3，SEQ ID No. 5Bar-R5，-C AGGAACCGC AGGAGTGGA-3，SEQIDNo.6SPS-F5，-TTGCGCCTGAACGGATAT-3 ‘SEQIDNo.7SPS-R5，-GGAGAAGC ACTGGACGAGG-3，SEQ ID No. 8所述判断依据为如果凝胶电泳能够检测出35S启动子、Bar基因或NOS终止子以及 SPS水稻内源基因特异性扩增产物条带则说明该样品为转Bar基因水稻或转Bar基因水稻制品。
2.根据权利要求1所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述的多重PCR扩增反应体系为12. 5 μ L预混液，浓度均为10 μ mol/L的35S，NOS, Bar, SPS 引物分别为0. 5,0. 5,0. 2，1. 0 μ L，IOOng模板DNA，加无菌水至25 μ L ；其中所述的预混液由 12. 5U 的 DNA 聚合酶；dNTP 各 0. 4mmol/L ；50mmol/L KCl ； 10mmol/L pH8. 4 Tris-HCl ； 1. 5mmol/L MgCl2 组成。
3.根据权利要求1所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述的多重PCR扩增反应条件为预变性94°C 5min;变性94°C lmin，退火57°C lmin，延伸72°C lmin，40 个循环；72°C延伸 7min。
4.根据权利要求1所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述的水稻基因组DNA提取包括以下步骤(A)称取20mg样品，粉碎后置于1.5mL离心管中，加入200 μ L 0. 25mol/L NaOH溶液， 95°C 20s ；(B)加入150 μ L 0. 25mol/L HCL溶液和 150 μ L 0. 5mol/L ρΗ8· OTris-HCL, 85°C 3min ；(C)加入400μ L的三氯甲烷，颠倒混勻离心管2-3次，静置IOmin ； 12000g离心5min， 上清液即为水稻基因组DNA提取液。
5.根据权利要求1所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于步骤 (1)提取的水稻基因组DNA浓度达到20ng/l·! 1以上，纯度达到在A26(V280在1. 5-2. 0之间才能作为步骤(2)多重PCR扩增反应模板。
6.根据权利要求4所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述的样品为水稻稻米或稻米的初级加工品。
7.根据权利要求4所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述的稻米的初级加工品为大米、米饭、米粉、米线或米酒酒糟。
8.根据权利要求1所述的转Bar基因水稻的多重PCR溯源检测方法，其特征在于所述步骤(3)中使用的凝胶电泳为使用3. 0%的琼脂糖凝胶在85V条件下电泳30min。
全文摘要
本发明属于农产品中转Bar基因水稻及其初级加工品的安全与溯源检测技术领域，具体公开了一种转Bar基因水稻的溯源检测方法。该检测方法包括如下步骤(1)提取水稻基因组DNA；(2)利用引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.8以步骤(1)提取的水稻基因组DNA为模板，对35S启动子、NOS终止子、SPS水稻内源基因、Bar基因进行多重PCR扩增；(3)将扩增产物进行凝胶电泳，分析并判断结果。本发明具有高通量的特点，在保证检测准确性的同时，能一次性完成对转Bar基因稻米的定性检测，操作简单，减少了假阳性检测结果，缩短了检测时间，降低了检测成本，具有实际意义。
文档编号C12Q1/68GK102154491SQ20111005425
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者周光宏, 宋尚新, 沈崇钰, 肖红梅, 邱良焱, 高峰 申请人:南京农业大学