专利名称：一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，涉及该菌株的培养方法、生物学特性及该菌株发酵物对受到6tlCo Y射线辐射的免疫细胞(人淋巴瘤细胞Jurkat细胞)的保护作用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年2月25日，保藏编号CGMCC No. 4608，分类命名链霉菌属(Streptomyces sp.)。
背景技术：
随着人类对星际深空的探索，空间辐射问题的研究越来越受到重视。航天员进入太空，受到的空间辐射主要来自银河宇宙辐射(GCR)、太阳粒子事件(SPE)和地球辐射带(ERBs)的侵扰，辐射粒子主要是质子和重离子，属于电离辐射。电离辐射对人体的损伤主要 包括对造血系统、免疫系统、及人体遗传物质DNA的损伤，其中最直接的是对细胞DNA的损伤。免疫系统是辐射损伤的敏感系统，其中淋巴细胞敏感性最高。辐射直接对机体造成的三种危害是，放射性疾病、遗传性疾病和癌症。目前有关抗辐射药尤其是抗航空航天辐射药的研究报道很少，少数的用中药、海藻抗辐射活性的研究主要用于抗癌的化疗，这种辐射与航天辐射具有较大差别。极地生境特殊，酷寒和高辐射使生活在此环境微生物通常具有较好的抗辐射活性，可能产生结构新颖的抗辐射物质，而相较于植物、动物资源来说，微生物采集不破坏生态环境，生长周期短，容易人工培养、实现产业化，是最有前途的可持续性利用资源。国内外有关极地微生物药用的研究多集中在抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面，未见抗辐射研究方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，还涉及菌株筛选试验用免疫细胞人淋巴瘤细胞Jurkat细胞作为抗辐射活性筛选的模型细胞，6tlCo Y射线作为电离辐射源的应用方法。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年2月25日，保藏编号CGMCC No. 4608,分类命名链霉菌属(streptomyces sp.)。本发明提供了该极地放线菌的来源，生物学特性，培养方法，发酵物的化学处理方法，发酵物对体外免疫细胞的毒性作用， 该发酵物对受到辐射的免疫细胞的明显保护作用。本发明的目的是由以下技术方案实现的，通过研究获得了一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于菌株属于链霉菌属(streptomyces sp.),其保藏编号CGMCC No. 4608，该菌株从北极楚科奇海沉积物中分离获得，该菌株菌落干燥，不透明，表面具灰色粉状物，与培养基结合紧密，正面灰白色，背面黄褐色，其基内菌丝发育良好，气生菌丝丰茂，菌丝体细长有分枝，相互交织成网状，孢子丝呈链状；好气，革兰氏染色阳性，不抗酸，不运动，细胞壁I型，以左旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征性组分，该菌能液化明胶，水解淀粉，不产生类黑色素和酪氨酸酶，该菌能利用葡萄糖、蔗糖、D-木糖、D-果糖、L-阿拉伯糖和甘露糖，不能利用L-鼠李糖、棉子糖和肌醇。所适合的培养基成分为淀粉20-25g，KNO3 l_2g，K2HPO4 O. 5-0. 6g，MgSO4O. 5-0. 6g, FeSO4 0. 01-0. 02g, NaCl 6_7g，MgCl2 · 6H20 0. 46-0. 50g, KC10. 06-0. 07g,海泥浸提液200-250ml，水800-750ml，pH 7-8 ;121°C灭菌15_18min，培养条件为温度为18-20°C ;振荡速度150r/min，培养15-16天，常规分离获得菌液和菌丝体两部分。所述的菌液部分经甲醇脱盐后，经乙酸乙酯、正丁醇300ml*3萃取，获得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分，菌丝体用甲醇100ml*3磁力搅拌lhr*3提取、离心，获得甲醇提取液部分，其四部分样品溶液经旋转蒸发浓缩，获得四部分样品浸膏。所述的四部分样品浸膏对Jurkat细胞的毒性作用测试该菌株发酵物小于100 μ g/ml时对Jurkat细胞不具有细胞毒活性。所述的四部分样品浸膏对人淋巴瘤细胞Jurkat细胞作为抗辐射活性筛选的模型细胞，Jurkat细胞的浓度为2*105个/ml，6tlCo Y射线辐射剂量为2. OGy，剂量率O. 667Gy/min0所述的四部分样品浸膏受到6°Co Y射线辐照的Jurkat细胞的保护作用的测试，该菌发酵物乙酸乙酯部分、正丁醇部分和甲醇部分三部分样品对受到辐照的Jurkat细胞具有保护作用。本发明的应用效果在于极地生境链霉菌ZF3-388具有抗辐射活性，其发酵物通过初步提取后，其乙酸乙酯部分、正丁醇部分和甲醇部分三部分样品均对受到6°Co Y射线辐照的Jurkat细胞有明显的保护作用；毒性实验显示，各部分样品在浓度为100μ g/ml，对Jurkat细胞不具有细胞毒活性；并且该菌通过实验室条件培养驯化，已能在普通环境下培养，利于大量发酵。
图I为辐照剂量对细胞生长的影响。
具体实施例方式本发明如图I通过以下实施例详细说明本发明技术方案的实施，但不应以此限定本发明的实施范围。实施例I :极地生境放线菌ZF3-388的生物学特性利用常规的形态及生理生化指标进行测试，具体方式包括平板菌落培养观测、显微立体结构观测、革兰氏染色、明胶液化实验、淀粉水解实验、酪氨酸酶实验、常见碳源利用实验。通过以上实验，确定其生物学特征为菌落干燥，不透明，表面具灰色粉状物，与培养基结合紧密，正面灰白色，背面黄褐色，其基内菌丝发育良好，气生菌丝丰茂，菌丝体细长有分枝，相互交织成网状，孢子丝呈链状；好气，革兰氏染色阳性，不抗酸，不运动，细胞壁I 型，以左旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征性组分，该菌能液化明胶，水解淀粉，不产生类黑色素和酪氨酸酶，该菌能利用葡萄糖、蔗糖、D-木糖、D-果糖、L-阿拉伯糖和甘露糖，不能利用L-鼠李糖、棉子糖和肌醇。
实施例2 :极地生境放线菌ZF3-388的培养方式优化I、以高氏一号培养基为基础，进行培养基成分初步优化，利用常规正交试验设计，考察碳源(淀粉、葡萄糖、蔗糖)的不同水平以及氮源(KNO3)的不同水平，确定其较适合培养基成分为淀粉 20-25g, KNO3 l_2g，K2HPO4 O. 5-0. 6g，MgSO4 O. 5-0. 6g，FeSO4
0.01-0. 02g，NaCl 6_7g，MgCl2 *6H20 0. 46-0. 50g,KC10. 06-0. 07g，海泥浸提液 200_250ml，水 800-750ml, 121。。灭菌 15_18min。2、采用常规优化方法，设置培养温度、培养时间、转速、以及pH值的不同水平，考察其对活性的影响，确定其较适培养条件为PH 7-8 ;温度为18-20°C ;振荡速度150r/min，培养15-16天。实施例3 :极地生境放线菌ZF3-388发酵液分离提取及细胞毒活性测试采用常规方法分离，发酵物离心转速为4000转/min，离心20min，将其分成菌液和菌丝体两部分。菌液部分经甲醇脱盐后，用乙酸乙酯、正丁醇300ml*3萃取，获得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分。菌丝体用甲醇100ml*3磁力搅拌lhr*3提取，离心(转速为4000转/min，离心20min)，获得甲醇提取液部分。以上四部分样品溶液经旋转蒸发浓缩，获得四部分样品浸膏，进行体外抗辐射活性筛选备用。细胞毒活性测试方法分为空白对照组、实验组，每组5个复孔。空白对照组为Jurkat细胞；实验组为Jurkat细胞中加入发酵液粗提物。发酵液初提物浓度设置为400μ g/ml，200l·! g/ml，100l·! g/ml，用细胞培养液溶解，O. 2μπι微孔滤膜过滤除菌。测试方法采用MTS法将浓度为2*105个/ml的Jurkat细胞加入96孔板，空白对照组加入IOml细胞培养液，实验组加入IOml不同浓度梯度的样品。37°C、5% CO2细胞培养箱孵育48hrs后，每孔加入MTS 20 μ I后继续孵育4hrs，酶标仪490nm、630nm测OD值。利用单因素方差分析方法对实验数据进行处理分析。实验结果显示发酵物四部分粗提物样品在100 μ g/ml时，P > O. 05。故可认为极地生境放线菌ZF3-388发酵液粗提物浓度在100 μ g/ml时，对Jurkat细胞不具有细胞毒活性，可用于人体抗辐射应用。实施例4:6°Co Y射线辐照剂量和辐照后培养时间的选择I、设定分组剂量实验室空白对照组、路上空白对照组、实验组(O. 5，I. O，2. O，3.0,4. OGy照射)，每组5个复孔。实验室空白对照组留在实验室Jurkat细胞；路上空白对照组去辐照实验室路上的Jurkat细胞；实验组0.5，I. 0,2. 0,3. 0,4. OGy60Co Y 射线辐照的 Jurkat 细胞。
Jurkat细胞辐照后再培养时间24，48，72小时，随后进行用MTS法测定的Jurkat细胞存活实验。2、方法MTS法。选定浓度的Jurkat细胞加入96孔板，于37°C、5% CO2细胞培养箱孵育指定的时间后，加入MTS 20 μ I后继续孵育4小时，酶标仪490nm、630nm测OD值。实验室空白对照组4个96孔板，分别0，24，48，72小时测OD值。路上空白对照组4个96孔板，分别0，24，48，72小时测OD值。实验组:0.5,1.0,2.0,3.0,4. OGy,每个剂量3块板，分别24，48，72小时测OD值。表I不同福照剂量孵育不同时间对Jurkat细胞影响(x 土 s, η = 5)
权利要求
1.一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于菌株属于链霉菌属(streptomyces sp.),其保藏编号CGMCC No. 4608,该菌株从北极楚科奇海沉积物中分离获得，该菌株菌落干燥，不透明，表面具灰色粉状物，与培养基结合紧密，正面灰白色，背面黄褐色，其基内菌丝发育良好，气生菌丝丰茂，菌丝体细长有分枝，相互交织成网状，孢子丝呈链状；好气，革兰氏染色阳性，不抗酸，不运动，细胞壁I型，以左旋二氨基庚二酸和甘氨酸为特征性组分，该菌能液化明胶，水解淀粉，不产生类黑色素和酪氨酸酶，该菌能利用葡萄糖、蔗糖、D-木糖、D-果糖、L-阿拉伯糖和甘露糖，不能利用L-鼠李糖、棉子糖和肌醇。
2.根据权利要求I所述的具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于，所适合的培养基成分为淀粉 20-25g, KNO3 l_2g，K2HPO4 O. 5-0. 6g，MgSO4 O. 5-0. 6g，FeSO4 0. 01-0. 02g, NaCl 6_7g，MgCl2 · 6H20 0. 46-0. 50g, KCl 0. 06-0. 07g,海泥浸提液200-250ml，水 800-750ml，pH 7-8 ;121°C灭菌 15_18min，培养条件为温度为 18_20°C;振荡速度150r/min，培养15-16天，常规分离获得菌液和菌丝体两部分。
3.根据权利要求2所述的具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于所述的菌液部分经甲醇脱盐后，经乙酸乙酯、正丁醇300ml*3萃取，获得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分，菌丝体用甲醇100ml*3磁力搅拌lhr*3提取、离心，获得甲醇提取液部分，其四部分样品溶液经旋转蒸发浓缩，获得四部分样品浸膏。
4.根据权利要求3所述的具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于所述的四部分样品浸膏对Jurkat细胞的毒性作用测试该菌株发酵物小于100yg/ml时对Jurkat细胞不具有细胞毒活性。
5.根据权利要求3所述的具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于所述的四部分样品浸膏对人淋巴瘤细胞Jurkat细胞作为抗辐射活性筛选的模型细胞，Jurkat细胞的浓度为2*105个/ml，6tlCo Y射线辐射剂量为2. OGy，剂量率O. 667Gy/min。
6.根据权利要求3所述的具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于所述的四部分样品浸膏受到6°Co Y射线辐照的Jurkat细胞的保护作用的测试，该菌发酵物乙酸乙酯部分、正丁醇部分和甲醇部分三部分样品对受到辐照的Jurkat细胞具有保护作用。
全文摘要
本发明提供一株具有抗航天辐射活性的极地生境放线菌，其特征在于该菌株从北极楚科奇海沉积物中分离获得，属于链霉菌属(Streptomyces sp.)，其保藏编号CGMCC No.4608，本发明的应用效果在于极地生境链霉菌ZF3-388具有抗辐射活性，其发酵物通过初步提取后，其乙酸乙酯部分、正丁醇部分和甲醇部分三部分样品均对受到60Co γ射线辐照的Jurkat细胞有明显的保护作用；毒性实验显示，各部分样品在浓度为100μg/ml，对Jurkat细胞不具有细胞毒活性；并且该菌通过实验室条件培养驯化，已能在普通环境下培养，利于大量发酵。
文档编号C12R1/465GK102676412SQ20111005407
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者史振平, 张久明, 李勇枝, 田黎, 盖宇清, 薛春美, 郭志峰, 高建义 申请人:中国航天员科研训练中心, 青岛科技大学