颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法

专利名称：颗粒淀粉水解酶在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法
技术领域：
本发明涉及丝状真菌宿主细胞，其可用于具有葡糖淀粉酶活性的异源颗粒淀粉水解酶(GSHE)的表达。本发明进一步涉及GSHE在由颗粒淀粉底物产生葡萄糖糖浆和其他终产物的方法中的用途，所述方法包括在颗粒淀粉的胶凝化温度(gelatinization temperature)或者低于该温度的温度，同时用淀粉液化淀粉酶(starch liquefying amylase)和GSHE接触颗粒淀粉底物。本发明进一步涉及包括GSHE和淀粉液化淀粉酶的酶组合物。
背景技术：
工业发酵主要使用葡萄糖作为产生各种蛋白质、酶、氨基酸、醇、有机酸、药物和其他化学品的原料。在许多应用中，葡萄糖是从碳底物如生物质(biomass)和淀粉的酶促转化产生的。淀粉在绿色植物中很丰富，以显微颗粒累积，直径在0. 5到175微米之间变化。这些淀粉颗粒的部分结晶性质使得其在冷水中具有不溶解性。结果，淀粉颗粒在水中的溶解需要大量的热能，以破坏颗粒的结晶结构，这导致部分地水解的淀粉的溶解。各种增溶方法已经被使用，这些方法包括直接和间接的加热体系，如通过蒸汽注入(stream injection) 的直接加热。(参见例如 STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY,由 R. L. Whistler 等人编著,第二版，1984，Academic Press Inc.，Orlando, FL ；STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, 由 G. M. A. Van Beynum 等人编著，Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc.，NY ；以及 THE ALCOHOL TEXTBOOK,第三版，由 K. Jacques, Τ. P. Lyons 和 D. R. Kelsall
1999, Nottingham University Press，UK)。一般地，为了将淀粉水解为葡萄糖，使用两个酶步骤。第一个步骤是液化步骤， 第二个步骤是糖化步骤。在液化步骤中，在存在已经加入的钙的情况下，使不可溶的淀粉颗粒在水中成为浆状物，通过加热使其凝胶化，通过热稳定α淀粉酶(EC 3.2.1.1， α-(1-4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)进行水解，产生糊精醪液(a mash of dextrins) 0所得到的醪液通常冷却到大约60-65°C。在糖化步骤中，可溶的糊精(糖)通过具有葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3，α-(1-4)-葡聚糖葡糖水解酶)活性的酶被进一步水解为右旋糖(葡萄糖)。 然后葡萄糖可以被用作最终产品或用作前体，被转化为其它在商业上重要的期望的最终产品，如果糖、山梨糖醇、醇、乳酸、抗坏血酸(ASA)中间产物和1，3_丙二醇。在20世纪50年代晚期，来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶就已经商业化，这些酶显著地改进了淀粉到葡萄糖的转化。另一个重要的改进发生在20世纪70 年代。从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)得到了一种热稳定的α淀粉酶，并且已经商业化，该热稳定的α淀粉酶具有改进的热稳定性、ρΗ稳定性和较低的钙依赖性(USP 3，9 12，590)。进一步的工业工艺已经为淀粉甜味剂行业采纳，用于酶液化过程 (USP5, 322，778)。这些工艺中的一些工艺包括，具有较低蒸气需求的低温工艺(105-110°C， 5-8分钟)，和高温工艺(148°C +/"55-8秒)，该工艺改进了淀粉颗粒的胶凝化作用， 从而导致改进的过滤特性以及液化淀粉底物的品质(Shetty等人，(1988)Cereal Foods World 33 :929_934)。尽管酶淀粉液化过程已经很好地被建立，但在产量损失、加工成本、能量消耗、ρΗ 调节、温度阈值、钙需求以及回生淀粉(retrograded amylase)水平方面的改进将是被期望的。尤其是，已知液化步骤残余的α淀粉酶，在糖化条件下，对工艺效率具有负面影响，并且残余的α淀粉酶在通过葡糖淀粉酶进行糖化之前必须被灭活。灭活通常通过在95°C将液化淀粉的PH降低到ρΗ 4. 2到4. 5来实现。液化过程的另一个缺点是还原基团的碱性异构化。碱性异构化导致形成一种二糖，即maltulose (4- α -D-吡喃葡萄糖基_D_果糖)的形成。Maltulose降低了葡萄糖的产量，这是由于它对葡糖淀粉酶和α淀粉酶的水解具有抗性。进一步地，很难对在高葡萄糖浓度下由活性葡糖淀粉酶催化的逆转反应产物的形成进行控制。来自黑曲霉的葡糖淀粉酶，在典型的糖化条件下，通常是热稳定的。因此，显著数量的葡糖淀粉酶活性可以保留到糖化反应后。此处讨论的一些问题的解决方案已经由不同研究者提出建议。例如，Leach等人(USP 4，113，509和USP 3，922，196)公开了一种方法，该方法通过用细菌α淀粉酶在低于淀粉胶凝化温度的温度温育颗粒淀粉，将颗粒淀粉(精制的)转化为可溶解的水解产物。然后将β淀粉酶用于水解，以产生高麦芽糖糖浆。欧洲专利申请0350737Α2公开了一种产生麦芽糖糖浆的方法，该方法通过使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α淀粉酶，在60°C水解来自玉米、小麦、马铃薯和甜薯的颗粒(纯化的)淀粉，没有传统的液化步骤(胶凝化作用之后是高温下的液化)。以前已经描述了使用葡糖淀粉酶将颗粒(粗)淀粉转化为葡萄糖的多步骤工艺， 该葡糖淀粉酶显示出粗淀粉水解能力(USP 4,618, 579) 0然而，只有60%的淀粉被水解，这因而导致大量的循环过程。改进颗粒淀粉转化的传统方法不仅是有利的，而且提供可使得由此所使用的酶的表达和产量增加的方法将是被期望的。例如，具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶——其具有改进的特性如增加的比活性、不同的PH范围和/或不同的糖基化水平，对于在工业淀粉转化中的应用可能是特别有利的。本发明不仅满足这些需求中的一些需求，而且导致了通过淀粉水解获得的各种最终产品的生产效率有所增加。
发明概述 本发明的一个实施方案涉及一种一步骤工艺，其用于将颗粒淀粉转化为葡萄糖， 这是通过在颗粒淀粉底物的胶凝化温度或低于该温度的温度水解颗粒淀粉，同时用内切作用的(endo-acting) α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的糖化酶——更特别地是具有颗粒淀粉水解活性的糖化酶，接触未胶凝化的淀粉底物来实现。相对于现有技术工艺，本发明在以下方面中的至少一个方面有益处和改进a) α 淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶在糖化作用中都有活性；b)淀粉底物以颗粒形式被使用，并且淀粉被水解；c)颗粒淀粉的溶解和糖化使用单一 pH ;d)相对于使用液化的淀粉底物的目前的糖化时间，使用颗粒淀粉的糖化时间要更短；e)与从液化的淀粉底物获得的葡萄糖糖浆相比，获得了具有降低的高级糖(higher sugar)含量的高葡萄糖糖浆；f)由于maltulose形成而造成的葡萄糖损失被降低；g)Milliard反应被消除或被降至最低程度；h)糖化后由于喷射蒸煮(jet cooking)所致的回生淀粉形成而形成碘阳性淀粉聚合物(Blue-Sac)的风险更低；i)省去了向淀粉浆状物中加入钙；和j)由于水解的淀粉不会堵塞过滤系统，过滤得到了改进。本发明所包括的方法和组合物提供了一种更加经济和有效的手段，来生产用于工业和特种化学品的葡萄糖供给料。在本发明的一个方面，提供了丝状真菌菌株，其用编码具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶(GSHE)的异源多核苷酸转化。优选的丝状真菌菌株是木霉菌菌株，更特别的是里氏木霉(T.reesei)菌株，其表达GSHE并且将GSHE分泌到培养基中。在该方面的一些实施方案中，本发明涉及在丝状宿主细胞中产生GSHE的方法，该方法包括用DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述DNA构建物包括一个启动子，启动子在该丝状真菌宿主细胞中具有转录活性，并可操作性地连接(operably linked)到编码GSHE 的异源多核苷酸上；在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主细胞，以允许表达GSHE ； 并产生GSHE。在其它实施方案中，编码GSHE的异源多核苷酸来源于灰腐质霉(Humicola grisea)的菌株或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的菌株。在一些实施方案中，GSHE与 SEQ ID NO :3具有至少90%序列同一性，或者与SEQ ID NO :6具有至少90%同一性。在进一步的实施方案中，回收由重组宿主细胞产生的GSHE。在第二个方面，本发明包括由重组的里氏木霉(Trichoderma reesei)的培养物所产生的发酵液(fermentation broth)，其中里氏木霉包含编码与SEQ ID NO :3具有至少 90%序列同一性或与SEQ ID NO 6具有至少90%序列同一性的GSHE的异源多核苷酸。在第三个方面，本发明涉及用于由颗粒淀粉底物产生葡萄糖糖浆的一步工艺，所述工艺包括(a)在等于或低于淀粉底物的胶凝化温度的温度，同时用α淀粉酶和具有葡糖淀粉酶活性的颗粒淀粉水解酶(GSHE)接触干固体含量(ds)为10-55%的颗粒淀粉底物浆状物，和(b)允许α淀粉酶和GSHE发挥作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉，得到葡萄糖糖浆。在一个实施方案中，至少95%的颗粒淀粉被水解。在第二个实施方案中，葡萄糖糖浆的产率按重量计是至少90%。在第三个实施方案中，颗粒淀粉底物的干固体含量在大约 15到40%之间。在第四个实施方案中，水解颗粒淀粉的时间在大约5小时到100小时的范围内。在第五个实施方案中，α淀粉酶是具有EC 3.2. 1. 1的酶。在第六个实施方案中，α 淀粉酶来源于芽孢杆菌(Bacillus)，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株。在进一步的实施方案中，α淀粉酶来源于重组的芽孢杆菌菌株。在第七个实施方案中，GSHE是来源于灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var. thermoidea)菌株或泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var. kawachi)菌株的葡糖淀粉酶。在第八个实施方案中，GSHE是来源于重组的木霉菌菌株的葡糖淀粉酶，尤其是里氏木霉菌株，其表达编码灰腐质霉GSHE或泡盛曲霉河内变种GSHE的异源基因。在第九个实施方案中，该方法进一步包括分离葡萄糖糖浆，尤其是通过过滤进行分离。在第十个实施方案中，来自葡萄糖糖浆的葡萄糖被进一步转化为果糖。 在第十一个实施方案中，该一步工艺的温度为大约50到大约70°C。在第十二个实施方案中，该工艺的PH为pH 4. 5到6. 5。在第四个方面，本发明涉及用于由颗粒谷物淀粉底物产生葡萄糖糖浆的一步工艺，所述工艺包括(a)在大约55-65°C的温度和大约5. 0到6. 0的pH，用来源于芽孢杆菌的α淀粉酶和来源于真菌的具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同时接触干固体含量 (ds)为25-45%的颗粒淀粉底物浆状物，并且允许α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉，获得葡萄糖糖浆。在一个实施方案中，至少80%的颗粒淀粉被水解，葡萄糖糖浆的产率按重量计是至少90%。在第二个实施方案中，葡糖淀粉酶是来源于重组的里氏木霉的GSHE，其表达编码灰腐质霉GSHE或泡盛曲霉河内变种GSHE的异源多核苷酸。在第五个方面，本发明涉及水解颗粒淀粉的方法，该方法包括用α淀粉酶和来源于木霉菌菌株的具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶，同时接触干固体含量为20-55% 的颗粒淀粉浆状物，其中木霉菌菌株包含编码来源于灰腐质霉的GSHE的异源多核苷酸；并且允许α淀粉酶和葡糖淀粉酶作用一段足够的时间，以水解颗粒淀粉。在一个实施方案中，至少90%的颗粒淀粉被水解。在第二个实施方案中，颗粒淀粉是玉米淀粉或小麦淀粉。 在第三个实施方案中，GSHE以大约0. 5到1. OGSHE单位的Humicola GA/克淀粉的浓度提供给浆状物；α淀粉酶以大约0. 1到0. 5kg/MT淀粉的浓度提供给浆状物，浆状物的pH被调节到大约PH 4. 5到6. 0 ；浆状物的温度被调节到大约55到65°C。在第六个方面，本发明涉及用于产生葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括用α淀粉酶和颗粒淀粉水解酶(GSHE)同时接触颗粒淀粉底物，以得到葡萄糖糖浆，其中GSHE是由丝状真菌菌株分泌的，所述真菌菌株包含异源多核苷酸，其编码来源于腐质霉菌株的GSHE，并且其氨基酸序列与SEQ ID NO :3具有至少90%同一性。在一个实施方案中，葡萄糖被进一步转化为期望的终端产物。在第七个方面，本发明涉及酶组合物，该酶组合物包括α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶。在一个实施方案中，α淀粉酶来源于芽孢杆菌属某种，GSHE来源于灰腐质霉GSHE。在第二个实施方案中，GSHE来源于木霉菌属菌株，该菌株通过遗传工程被改造，以包含编码灰腐质霉GSHE的多核苷酸。在第三个实施方案中，该组合物的pH介于 4. 5和6. 5之间。在第四个实施方案中，α淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌菌株。在进一步的实施方案中，该酶组合物中α淀粉酶与GSHE的比率是15 1到1 15。在第八个方面，本发明涉及用于产生高果糖淀粉基糖浆(high fructose starch based syrup)的工艺，包括将通过本发明所包括的方法获得的葡萄糖糖浆转化为果糖基糖浆。在第九个方面，本发明涉及产生终端产物(end product)的方法，其中对通过本发明所包括的方法获得的葡萄糖糖浆进行发酵。在该方面的一些实施方案中，终端产物是醇，优选地是乙醇。在该方面的进一步的实施方案中，发酵与接触步骤同时进行，在其它实施方案中，相对于接触步骤，发酵被独立地随后予以进行。在仍然进一步的实施方案中，发酵产物从发酵液中分离出来。在第十个方面，本发明涉及用于产生残余淀粉(residual starch)的方法，该方法通过分离根据本发明的方法产生的葡萄糖糖浆，并保留包括残余淀粉的组合物来实现。在一个实施方案中，该残余淀粉被用于终端产物的生产。在第二个实施方案中，残余淀粉被循环，与GSHE和α淀粉酶在低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度同时接触。


图1 灰腐质霉GSHE的核苷酸序列。图1提供了基因组DNA序列，其编码具有葡糖淀粉酶活性的天然灰腐质霉高温变种颗粒淀粉水解酶(GSHE) (SEQ ID NO :1)。推定的内含子是黑体字并加有下划线。图2Α:灰腐质霉GSHE蛋白质序列。图2Α提供了灰腐质霉高温变种GSHE的信号序列和成熟氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。推定的信号序列是黑体字并且加有下划线。图2Β 灰腐质霉成熟GSHE蛋白质序列。提供了灰腐质霉高温变种GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。图3提供了 pTrex3g_N13质粒的示意性说明，其被用于表达编码灰腐质霉GSHE的核酸，并且其含有真菌表达载体侧翼的XbaI位点，其中a) cbhl启动子是里氏木霉纤维二糖水解酶启动子，b)H. grisea glal是编码SEQ ID NO 3的灰腐质霉GSHE的多核苷酸，c) cbhl终止子是里氏木霉纤维二糖水解酶终止子，和d)amdS是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶标记基因。图4 提供了图 3 的 pTrex3g_N13 质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO 11) (10738bp)。图5 里氏木霉表达重组的灰腐质霉GSH-GA。图5提供了 SDS-PAGE凝胶，说明了灰腐质霉高温变种GSHE在一个代表性发酵程序中的表达，用里氏木霉克隆进行，正如实施例1中所描述的。泳道1代表商业来源分子量标记物SeeBlue (Invitrogen)；泳道2是空白组；泳道3表示在48小时时的rGSHE表达；泳道4表示在56小时时的rGSHE表达；泳道 5表示在64小时时的rGSHE表达。图6提供了编码泡盛曲霉河内变种GSHE的基因组DNA序列(SEQ ID NO 4)。推定的内含子是黑体字并加有下划线。图7A 泡盛曲霉河内变种GSHE前体蛋白质序列。图7A提供了泡盛曲霉河内变种 GSHE的信号序列和成熟氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。信号序列是黑体字并且加有下划线。图7B提供了泡盛曲霉河内变种GSHE的成熟氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。图8A和8B示意性说明了 pH稳定性，以天然灰腐质霉 高温变种GSHE (nGSHE)和在里氏木霉宿主中表达的灰腐质霉高温变种GSHE(RGSHE) (SEQ ID NO 3)的％残余活性表示， 正如实施例1中所描述的。图9示意性说明了天然的灰腐质霉高温变种GSHE和在里氏木霉宿主中表达的灰腐质霉高温变种GSHE对玉米淀粉的水解，在一段时间内进行测量，表示为mg葡萄糖/mg蛋白质，正如实施例1中所描述的。
图10 里氏木霉表达的河内曲霉GSHE。图10提供了 SDS-PAGE凝胶，说明了泡盛曲霉河内变种GSHE在一个代表性发酵程序中的表达，用里氏木霉克隆进行，正如实施例2 中所描述的。泳道1代表商业来源分子量标记物SeeBlue (Invitrogen)；泳道2描述在162 小时时的rGSHE表达；泳道3是对照组，描绘在162小时时的未转化的里氏木霉宿主。图 11是一般性示意图，该图示意性说明了利用颗粒淀粉底物的低能量葡萄糖生产的本发明工艺的一个实施方案。图12图示了，在进行本发明的工艺前，典型的玉米淀粉颗粒的扫描电子显微照片 (a)；以及在进行本发明所包含的工艺之后，残余淀粉的扫描电子显微照片(b_d)。发明详述在一些方面，本发明依赖于在遗传工程和分子生物学领域所使用的常规技术和方法。下述来源包括了在本发明中有用的一般技术的描述Sambrook等人， MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL(2ndEd.，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL(1990)；和 Ausubel 等人编著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。除非本文另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语，具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,2D ED. ， Johnffiley and Sons, New York(1994), 禾口 Hale&Markham， THE HAPPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)为普通技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般词义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等价的任何方法和材料可以在本发明的实践或实验中使用，但还是描述了优选的方法和材料。现在，将通过仅仅使用下述定义和实施例的参考方式，对本发明进行详细描述。本文中参考的所有专利和公开文献，包括这些专利和公开文献中所公开的所有序列，都被特别地明确地引入作为参考。数字范围包括定义该范围的数值在内。除非另有指明，核酸以5’到3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限定，通过参考作为整体的说明书，可以得到本发明的各个方面或实施方案。A.定义正如此处所用，术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化合物构成的任何材料， 包括具有式(C6HltlO5)x的直链淀粉和/或支链淀粉，其中X可以是任何数目。尤其是，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更特别地是植物小麦、大麦、 玉米、黑麦、大米、高梁、豆类、木薯、黍、马铃薯、甜薯和木薯粉(tapioca)。术语“颗粒淀粉”指未蒸煮(粗)淀粉，其还没有进行胶凝化作用。术语“淀粉胶凝化作用”意指淀粉分子的溶解，形成粘性悬液。术语“胶凝化温度”指淀粉底物开始发生胶凝化的最低温度。确切温度取决于具体的淀粉底物，进一步可能依赖于获得该淀粉的植物种类的特定品种以及生长条件。术语“DE”或“葡萄糖当量(dextrose equivalent) ”是测量总还原糖浓度的一个行业标准，基于干重量以D-葡萄糖进行计算。未水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，D-葡萄糖的DE为100。术语“葡萄糖糖浆”指含有葡萄糖固体的含水组合物。在一个实施方案中，葡萄糖糖浆将包括至少90%的D-葡萄糖，在另一个实施方案中，葡萄糖糖浆将包括至少95%的 D-葡萄糖。在一些实施方案中，术语“葡萄糖”、“葡萄糖糖浆”和“右旋糖”可被交替使用。术语“总糖含量(tot alsugar content) ”指在淀粉组合物中存在的总糖含量。术语“干固体含量(ds) ”指浆状物的总固体(以％表示)，基于于重量来计算。“白利(Brix) ”指一种熟知的液体比重计标度，用于量度在给定温度下溶液的糖含量。白利标度测量的是每100克含水糖溶液中存在的蔗糖的克数(总的溶解固体含量)。 白利测量值通常通过使用液体比重计或折光计来获得。术语“淀粉液化酶(starch-liquefying enzyme) ”指可实现颗粒淀粉液化的酶。 例证性的淀粉液化酶包括α淀粉酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)。术语“淀粉酶(amylases)，，指催化淀粉水解的酶。术语“α-淀粉酶(E.C.3.2. 1. 1类)”指催化α-1，4_糖苷键水解的酶。这些酶也已经被描述为在含有1，4- α -连接的D-葡萄糖单元的多糖中实现1，4- α -D-糖苷键的外切或内切水解的那些酶。用于描述这些酶的另一个术语是糖原酶(glycogenase)。例证性的酶包括α -1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α -1,4-glucan4-glucanohydrase glucanohydrolase)。在此处可被交替使用的术语“糖化酶(saccharification enzyme) ”和“葡糖淀粉酶(glucoamylase) ”指淀粉葡糖苷酶类别的酶(E. C. 3. 2. 1. 3，葡糖淀粉酶，α _1，4_D_葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原末端释放葡糖残基。这些酶也水解α-1，6和α-1，3-键，尽管是以比α-1，4_键低得多的速率水解。正如此处所用，术语“颗粒淀粉水解酶(GSHE) ”或“具有颗粒淀粉水解活性的酶” 特别地指这样的酶，其具有葡糖淀粉酶活性，并且具有水解颗粒形式的淀粉的能力。优选的 GSHE是那些来源于丝状真菌的GSHE，其中对丝状真菌细胞而言，GSHE是内源或外源的。一种优选的GSHE是来源于灰腐质霉高温变种的天然GSHE。另一种优选的GSHE来源于泡盛曲霉河内变种。特别优选的GSHE是重组的GSHE，其是在宿主菌株中表达的GSHE，所述宿主菌株已经被进行了遗传工程改造，以便包含编码GSHE的异源多核苷酸。在一些优选的实施方案中，GSHE作为胞外酶而被表达。术语“淀粉的水解”指在加入水分子的情况下糖苷键的裂解。术语“聚合度(degrss of polymerization，DP) ”是指，在给定的糖中脱水吡喃型葡萄糖单位的数量。DPl的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+( > DP3)表示聚合度大于3的聚合物。术语“接触”指将各酶放置到与各自的底物足够接近的位置，以便使该酶能够将底物转化为终端产物。本技术领域的技术人员将认识到，酶与各自底物的混合溶液能实现接触。术语“酶促转化”通常指通过酶作用进行的底物修饰。正如此处所用，该术语也指通过酶的作用对颗粒淀粉底物进行修饰。在优选的实施方案中，颗粒淀粉底物的酶促转化将产生葡萄糖糖浆。
术语“浆状物(slurry) ”指含有不可溶淀粉颗粒的含水混合物。 术语“糖基化(glycosylation) ”指通过加入碳水化合物部分(moieties)对蛋白质进行的转录后修饰，其中碳水化合物是N-连接的或者0-连接的，由此产生糖蛋白。糖蛋白的N-连接碳水化合物部分通过糖苷键连接到天冬酰胺残基的β-氨基氮上。通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基，0-连接碳水化合物通过糖苷键连接到蛋白质上。术语“重组的”，当它的使用涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表明细胞是来源于如此而被修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达在该细胞的天然(非重组的)形式中不存在的基因；或者表达天然基因，但这些天然基因以别的方式被异常表达、不足地表达或者根本不表达。术语“重组GSHE，，、“重组表达的GSHE，，和“重组产生的GSHE，，指成熟GSHE蛋白质序列，其是在宿主细胞中由异源多核苷酸产生。符号“r”可以用于表示重组子。rGSHE的蛋白序列不包括信号序列。在一个实施方案中，在里氏木霉的菌株中所表达的灰腐质霉高温变种GSHE，用"rH-GSHE"表示。术语“天然GSHE”和“nGSHE”指GSHE，其来源于微生物宿主生物，不是来源于需要表达重组GSHE的真菌宿主。优选的天然GSHE来源于灰腐质霉菌株，或者泡盛曲霉菌株。术语“蛋白质”和“多肽”在此处可被交替使用。本文对于氨基酸残基，使用了传统的单字母或三字母代码。“信号序列”指与蛋白质的N末端部分结合的氨基酸的序列，其有助于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割掉。“基因”指在产生多肽中所涉及的DNA片段，包括该编码区域之前的区域和之后的区域，以及在各编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。术语“核酸”包括DNA、RNA、单链或双链及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸” 在此处可以被交替使用。由于遗传密码是简并的，所以不止一种密码子可以被用于编码特定氨基酸，本发明包括多核苷酸，其编码特定的氨基酸序列。“载体”是指被设计用于将核酸引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、序列盒及类似物。正如此处所用，“表达载体”指DNA构建物，其包括可操作地连接到适当的控制序列上的DNA序列，所述适当的控制序列能实现DNA在适当宿主中的表达。这样的控制序列可以包括启动子以实施转录、任选的操纵子序列以控制转录、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。“启动子”是在结合RNA聚合酶中以启动基因的转录中所涉及的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明中使用的优选启动子是里氏木霉cbhl，其是诱导型启动子。“在转录控制下(under transcriptional control) ”是本技术领域熟知的一个术语，该术语表明，多核苷酸序列——通常是DNA序列——的转录依赖于其被可操作地连接到对转录的启动有贡献或者促进转录的元件上。“在翻译控制下(undertranslational control) ”是本技术领域熟知的一个术语，该术语表明在mRNA已经形成后发生的调节过程。正如此处所用，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语不是大写字母，并且是斜体字，例如编码灰腐质霉GSHE的基因可以表示为glal。用于该蛋白质的术语通常不是斜体字，第一个字母是大写的，例如由glal基因编码的蛋白质可以表示为 Glal ο术语“可操作地连接”是指并列关系，其中元件以可允许它们在功能上相关的方式排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么启动子就是可操作地连接到该编码序列上。术语“选择性标记”指能在宿主中表达的基因，其可以使得含有被引入的核酸或载体的那些宿主的选择容易一些。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)或赋予代谢优势例如营养优势给宿主细胞的基因。术语“来源(derived)，，包括术语“源自(originated from)，，、“得自或可获自，，以及“分离自”。“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于表达载体或DNA构建物的适当宿主，其包含编码根据本发明的GSHE的多核苷酸。特别地，宿主菌株是丝状真菌细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，“宿主细胞”指从丝状真菌菌株的细胞所产生的细胞和原生质体，尤其是木霉菌属某种或曲霉菌属某种。术语“丝状真菌”指所有丝状形式的所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)(参见 Alexopoulos，C. J. (1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY, New York Wiley) 这些真菌是以营养菌丝为特征，其具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌与酵母在形态上、生理上以及遗传上不同。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行，碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是如下种类的细胞，但不限于它们木霉菌属，例如里氏木霉(以前被分类为T. longibrachiatum，现在被称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属某禾中(Penicillium sp.)；腐质霉属某种(Humicola sp.)，包括异常腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；金孢菌某种(Chrysosporium sp.)，包括拉克淖金孢菌(C. Iucknowense)；粘帚霉某种(Gliocladium sp.)；曲霉属某种，包括米曲霉、构巢曲霉(A. nidulans)、黑曲霉和泡盛曲霉(A. awamori)；镰孢菌属某种(Fusarium sp·)、脉孢菌属某种(Neurospora sp.)、 肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)。也参考Innis等人， (1995)Sci. 228 :21_26。正如此处所用，术语“木霉菌”或“木霉菌属某种”指之前已被归入木霉属的任何真菌菌株或目前被归入木霉属的任何真菌菌株。。术语“培养”指，在液体或固体培养基中、在合适的条件下，培养微生物细胞群。在一个实施方案中，培养指颗粒淀粉底物到葡萄糖糖浆或其它期望的终端产物的发酵型生物转化(通常是在容器或反应器中)。谈及多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”或“外源的”，是指在宿主细胞中不天然发生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。这意味着，该术语包括由天然发生的基因、突变的基因和/或合成基因编码的蛋白质。关于多核苷酸或蛋白质，术语“同源的”或“内源的”，指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。术语“回收的”、“分离的”和“分开的”，正如此处所用，指分子、蛋白质、细胞、核酸、 氨基酸或碳水化合物，其与同其天然相关的至少一个成分是分离的。
正如此处所用，术语“被转化的”、“被稳定地转化的，，或“转基因的”，在涉及细胞时，是指该细胞具有非天然的(异源的)核酸序列，其被整合到它的基因组中或者作为在多个世代中被维持的附加型质粒而存在。正如此处所用，术语“表达”指这样的过程，通过该过程，基于基因的核酸序列，产生出多肽。该过程既包括转录也包括翻译。术语“被引入”，在将核酸序列插入到细胞中的上下文中，意指“转染”或“转化”或 “转导”，包括指将核酸序列导入到真核或原核细胞中，其中核酸序列可以被掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化为自主复制子，或者被短暂地表达(例如，转染的mRNA)。正如此处所用，术语“比活性”指酶的单位，定义为在特定条件下，每单位时间内通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活性表示为单位(U)/mg蛋白质。正如此处所用，“酶活性”指酶对其底物的作用。正如此处所用，术语“酶单位”指在最适测定条件下，每分钟将Img底物转化为底物产物的酶数量。例如，在一个实施方案中，术语颗粒淀粉水解酶单位(GSHE U)被定义为 在测定条件下，例如50°C和pH4. 5，每分钟由颗粒淀粉产生Img葡萄糖所需要的GSHE的量。 例如，在一个实施方案中，术语α淀粉酶酶单位(AU)被定义为在ρΗ 5.2和401的标准测定条件下，在1分钟时间内水解1微摩尔淀粉底物的α淀粉酶的量。术语“终端产物”或“期望的终端产物”指衍生自任何碳来源的分子产物，该产物是从颗粒淀粉底物酶促转化而来的。优选地，终端产物是葡萄糖或葡萄糖糖浆。然后葡萄糖可以被用作其它期望的终端产物的前体。术语“残余淀粉”，正如此处所用，指当包括葡萄糖糖浆或其它终端产物的组合物被分离时，本发明的颗粒淀粉水解工艺的副产物或剩余的组分。残余淀粉包括剩余的不可溶的淀粉，其在分离后留在组合物中。“残余淀粉的循环步骤”指残余淀粉循环回到容器或反应器中，其中包括GSHE和 α淀粉酶。术语“产量(yield) ”指使用本发明的方法产生的终端产物或期望的终端产物的量。在一些优选的实施方案中，产量大于使用本技术领域已知方法所产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终端产物的体积，在其它实施方案中，该术语指终端产物的浓度。正如此处所用，“产乙醇微生物”指有能力将糖或寡糖转化为乙醇的微生物。由于其表达一种或多种酶的能力，产乙醇微生物是乙醇生成型的，所述酶单独地或合起来将糖转化为乙醇。在本发明的上下文中，术语“基本上纯的多肽(substantially pure polyp印tide)”指这样的多肽制剂，按重量计其含有最多10%的与之天然联系的其它多肽物质(更低百分比的其它多肽物质是优选的，例如最多8wt %，最多6wt %，最多5wt %，最多4wt%，最多3wt%，最多2wt%，最多Iwt %，以及最多l/2wt% )。因此，优选地，基本上纯的多肽是至少92%纯度，即，该多肽构成在制剂中存在的总多肽材料的至少92wt%，更高百分比是优选的，如至少94%纯度，至少95%纯度，至少96%纯度，至少96%纯度，至少 97%纯度，至少98%纯度，至少99%纯度，和至多99. 5%纯度。此处公开的多肽优选地是基本上纯的形式。尤其是，优选地，此处公开的多肽是“实质上纯的形式(essentially pure form) ”，即多肽制剂基本上不含与其天然相关的其它多肽材料。这是可以实现的，例如通过用熟知的重组方法制备多肽来实现。 “ATCC”指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，位于 Manassas, VA 20108(ATCC, www/atcc. org)。"NRRL，，指 Agricultural Research Service Culture Collection, National Center, Agricultural Utilization Research(以前被禾尔为 USDA Northern Regional Research Laboratory), Peoria,ILL。“一个(A) ”、“一个(an) ”和“该(the) ”包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。正如此处所用，术语“包括(comprising) ”及其同源词在本文中被使用时，它们具有包含的意思；也就是，相当于术语“包含(including)”及其对应的同源词。B.优选的实施方案淀粉底物-在本发明的方法中，将被加工的颗粒淀粉底物可以从包括茎干、谷粒、根和块茎的任何植物部分获得。尤其优选的植物来源包括玉米；小麦；黑麦；高梁；大米；黍；大麦；木薯；豆类，如蚕豆和豌豆；马铃薯；甜薯；香蕉；和木薯粉。淀粉可以是高度精制的粗淀粉或者来自淀粉精制过程的原料。尤其预期到的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。本技术领域的普通技术人员知道，用于制备在本发明所包括的方法中使用的颗粒淀粉底物的有效方法。这些有效方法中的一些方法包括使用锤磨机(hammer mills)和辊磨机(roller mills)的全谷类谷物(whole cereal grains)干磨，以及湿磨。各种淀粉可通过商业途径获得。例如，玉米淀粉可以从Cerestar、Sigma和 Katayama Chemistry Industry Co. (Japan)获得；小麦淀粉可以从Sigma获得；甜薯淀粉可以从 Wako Pure Chemistry Industry Co. (Japan)获得；马铃薯淀粉可以从 Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japan)—。尽管目的不在于以任何方式限制本发明，但下面的表1提供了在一些常见的谷类谷物中存在的淀粉含量的一般性指南。本技术领域的普通技术人员熟知，谷物中的淀粉含量可能依赖于如基因型这样的因素和环境。表1各种谷物的淀粉含量
权利要求
1.具有颗粒淀粉水解活性的酶组合物，所述酶组合物包括α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶(GSHE)，其中α淀粉酶和GSHE的比率在15 1到1 15之间。
2.权利要求1的酶组合物，其中α淀粉酶与GSHE的比率在10 1到1 10之间。
3.用于从颗粒淀粉浆生产葡萄糖糖浆的单步骤方法，所述方法包括在等于或低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度，用α淀粉酶和具有颗粒淀粉水解活性的葡糖淀粉酶(GSHE)同时接触获自颗粒淀粉底物的颗粒淀粉浆，和允许α淀粉酶和GSHE作用一段足以水解颗粒淀粉的时间，以得到含有葡萄糖糖浆的组合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中颗粒淀粉底物来自玉米、小麦、大麦或稻。
5.根据权利要求4所述的方法，其中颗粒淀粉底物是从全谷粒获得的玉米淀粉。
6.根据权利要求3所述的方法，其中颗粒淀粉底物是干磨或湿磨的。
7.根据权利要求3所述的方法，其中颗粒淀粉浆的干固体含量为15-55%。
8.根据权利要求7所述的方法，其中颗粒淀粉浆的干固体含量为15-45%。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述温度低于65°C，并且大于50°C.
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述温度低于65°C，并且大于55°C.
11.根据权利要求3所述的方法，其中足以水解颗粒淀粉的时间是2至100小时。
12.根据权利要求3所述的方法，其中接触步骤在5.0到6. 0之间的pH进行。
13.根据权利要求3所述的方法，其中α淀粉酶源自芽孢杆菌。
14.根据权利要求3所述的方法，其中α淀粉酶的量在0.05-5.Okg/公吨淀粉的范围内。
15.根据权利要求14所述的方法，其中α淀粉酶的量在0.05-2.Okg/公吨淀粉的的范围内。
16.根据权利要求3所述的方法，其中GSHE是由编码与SEQID NO :3或SEQ ID NO 6 的序列具有至少90%序列同一性的GSHE的多核苷酸的异源表达获得的。
17.根据权利要求3所述的方法，其中GSHE的量在0.01-10. 0 GSHE单位/g淀粉干固体的范围内。
18.根据权利要求17所述的方法，其中GHSE的量在0.1-5.0 GSHE单位/g淀粉干固体的范围内。
19.根据权利要求18所述的方法，其中GHSE的量在0.25-2. 5 GSHE单位/g淀粉干固体的范围内。
20.根据权利要求3所述的方法，其中颗粒淀粉的至少90%在24小时内被水解。
21.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括回收葡萄糖糖浆。
22.根据权利要求21所述的方法，其中葡萄糖糖浆通过过滤分离被回收。
23.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括将葡萄糖糖浆转化为期望的终产物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中期望的终产物是果糖糖浆。
25.根据权利要求23所述的方法，其中期望的终产物是乙醇。
26.根据权利要求23所述的方法，其中期望的终产物是结晶葡萄糖。
27.根据权利要求22所述的方法，其中残余淀粉作为葡萄糖糖浆分离的副产物被获得。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法进一步包括通过用GSHE和α淀粉酶在低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度接触残余淀粉来再利用残余淀粉。
29.残余淀粉，其根据权利要求27所述的方法获得。
30.用于产生高果糖的淀粉基糖浆的方法，所述方法包括将根据权利要求3的方法所获得的葡萄糖糖浆酶促转化为果糖糖浆。
31.根据权利要求30的方法，其中转化步骤包括使用葡萄糖异构酶。
32.用于生产残余淀粉组合物的方法，所述方法包括根据权利要求3接触颗粒淀粉底物以产生包括葡萄糖糖浆的组合物，以及从组合物分离出葡萄糖糖浆，从而获得包括残余淀粉的混合物。
33.根据权利要求32获得的残余淀粉在淀粉糖化工艺中的应用。
34.用于生产乙醇的方法，所述方法包括用产乙醇微生物对根据权利要求3而产生的葡萄糖糖浆进行发酵。
35.根据权利要求34的方法，其中发酵与接触步骤分开地并顺序地进行。
36.根据权利要求34的方法，其中发酵与接触步骤同时进行。
37.根据权利要求34的方法，所述方法进一步包括从发酵中回收乙醇。
全文摘要
本发明涉及颗粒淀粉水解酶(GSHE)在木霉菌中的表达和从颗粒淀粉底物产生葡萄糖的方法。具体地，本发明涉及丝状真菌宿主细胞，尤其是用于产生具有葡糖淀粉酶活性的异源颗粒淀粉水解酶的木霉菌宿主细胞。进一步，本发明涉及用于产生葡萄糖糖浆的方法，所述方法包括使用α淀粉酶和GSHE，在等于或低于颗粒淀粉的胶凝化温度的温度，同时接触从颗粒淀粉底物获得的颗粒淀粉浆，以得到葡萄糖糖浆的组合物。
文档编号C12P19/20GK102174490SQ20111005375
公开日2011年9月7日 申请日期2004年11月18日 优先权日2003年11月21日
发明者B·A·斯托姆, B·S·鲍尔, G·K·肖塔尼, J·K·谢蒂, Jr·O·兰特罗, M·J·佩珀森, N·邓恩－科勒曼, S·E·兰茨, T·L·鲍德文 申请人:丹尼斯科美国公司