专利名称：仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法
技术领域：
本发明涉及一种仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法，用于研究各种细胞在三维培养状态下，对可控的流体切应力的反应，属于生物力学领域。
背景技术：
由无机和有机成分组成的细胞外基质构成了复杂的、高度有机化的骨组织，适宜的机械力加载对骨起着重要影响，它可以促进骨形成并减少骨吸收，反之缺乏适宜的刺激会影响骨基质蛋白和矿化物质的产生、减少骨形成、增加骨吸收。因此，许多体外实验开始研究骨细胞对不同机械刺激(包括流体切应力、流体静压力和牵张力等)的反应性变化。 组织学的研究表明松质骨骨髓腔内的陷窝、骨小管和骨小梁形成的多孔网状结构中充满了组织液，约占骨量的23%，正常活动对骨施加的机械负荷将引起这些空隙体积的变化，形成液压促进组织液流动，进而激活腔隙_小管中骨源细胞的成骨相分化。Knothe (Bone, 1998， 22(2) 107-17)通过分子标记证实了骨矿化基质中流体流动的存在。Klei-Nulend(FASEB JOURNAL, 1995,9(5) :441_445)等采用流体流动刺激骨细胞，认为在整骨中，骨细胞受到腔隙_小管中流体流动的作用而被激活。假说和实验证据提示，骨应力适应的主要运动者是通过小管间隙的流体，并沿骨细胞轴突产生的应变导致的流动。当骨被加载时，细胞周围的未矿化基质产生挤压，从而在骨细胞的细胞膜面上产生流动剪切力。此外Johnson(Am J. Physiol. 271 :E205_E208，1996)等许多实验表明流体切应力比流体静压力和牵张力等更能有效地影响骨细胞应力刺激的反应。目前常用的流体切应力细胞培养系统多作用于二维培养的细胞，然而骨是一种非均质性组织，它是在三维环境中对机械力刺激做出反应并改变其形态。三维流体切应力细胞培养系统就是将细胞接种在能够允许流体流经并允许细胞在其上进行三维生长和增殖的支架材料上。三维培养是利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。细胞三维培养一方面能够为体外培养细胞提供与其来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面，可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。而根据不同培养方式可将细胞三维培养分为静止三维培养和动力性三维培养。由于重力作用，静止培养时细胞多聚集到载体的底部和载体之外，载体内部粘附生长的细胞数量很少；而动力性三维培养有许多静止细胞培养所不具备的优点①三维载体中，能够产生有效的、均勻的细胞种植，允许移植最大数量的细胞；②能够促进载体中粘附生长细胞的增殖，分泌更多细胞外基质，促进组织再生；③能够促进氧气和营养物质向载体内部输送，保持载体内部细胞的活性和功能的发挥；④细胞能够沿着三维载体的孔隙生长，产生具有一定几何形状的组织；⑤能够排出更多的C02，维持生理性PH值，为细胞代谢和功能发挥提供更游离的微环境；⑥培养液流动能够对细胞产生机械应力刺激，调节细胞功能的发挥。动力性三维细胞培养不仅为细胞生长提供了适宜的生物性微环境和力学刺激，而且能更好地促进细胞功能的发挥。
但现在所使用的为数较少的自制的三维流体切应力细胞培养系统存在着组装复杂、产生非灌注流径旁路、可观察性差等缺点。例如徐尚龙等(生物化学与生物物理进展， 2006,33(9) 895-901)设计的培养系统是直接将支架材料浸没在培养瓶中，培养基流过培养瓶时产生了大量的非灌注路径，无法保证流体垂直流经整个支架内部，支架表面和内部的细胞无法受到均勻的力学刺激。李祥等(生物工程学报，2005，21 (4) 579-583)设计的培养系统中，支架材料镶嵌在硅橡胶密封圈内，组装不易且容易造成污染。吴丹等(临床口腔医学杂志，2007，23 (4) 197-199)设计的培养系统只采用了一个灌注小室，若欲增加样本量需多次重复实验，增加了操作的次数，大多数设计灌注小室不透明，不能观察到小室内液体流动和细胞培养的情况，给实验带来不便。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法，其特点是对成品玻璃注射器进行适当改造，将注射器的针筒作为灌注小室，并将注射器的活塞中部径向截断，置于灌注小室内支撑固定支架，利用了注射器的活塞与针筒之间具有的紧密接触，将培养基流经细胞支架发生旁路漏液的可能性降到最低；实验开始前，调整流速为一固定值，蠕动泵运行Ih后，用量筒分别精确测量每个泵头水流出量的体积(最大值为67. 1ml，最小值为66. 4ml，误差率为1. 05% )，独立性的泵头能够减少误差及灌注小室相互间的影响。本发明的目的由以下技术措施实现仿生三维流体切应力细胞培养装置由蠕动泵、灌注小室、1转8的转接口、空气滤膜、废液瓶、直通阀、培养基、储液瓶和处理硅胶管组成，灌注小室的一端与蠕动泵连接，灌注小室的另一端通过1转8的转接口与废液瓶连接；废液瓶通过直通阀与储液瓶连接；储液瓶通过1转8的转接口与蠕动泵连接。灌注小室由玻璃注射器制成，可以观察到灌注小室内培养基、细胞支架及流体内的气泡的情况，细胞支架置于经机械径向切割两段的注射器活塞之间，能够基本保证流体完全通过细胞支架，使非灌流旁路减少到最少，活塞与注射器内壁间的紧密接触满足GB/ T1962. 1-2001，达到泄漏率不超过0. 005Pa · m3/s。灌注小室上端由钛板及0型硅胶圈密封，上端钛板通过钛支架与下端钛板连接，灌注小室上、下两端分别设有流体流入口和流出蠕动泵头有8个通道分别和8个灌注小室连接，蠕动泵另一端通过1转8的转接口和钼处理硅胶管与储液瓶连接，能使用不同直径的支架和注射器制成的不同灌注小室， 减少了对实验设计的限制。废液瓶和储液瓶内的钼处理硅胶管顶端封有空气滤膜，有利于孵箱中的氧气和二氧化碳进入培养系统内。仿生三维流体切应力细胞培养装置的切应力加载方法包括以下步骤(1)实验开始之前分别测定蠕动泵每个通道的流速，流 速控制到10-60ml/min ；(2)在无菌条件下，将接种了细胞的支架固定于灌注小室中，储液瓶和废液瓶中加入培养基，连接整个加力装置；(3)打开蠕动泵，排出整个管道内空气，根据实验要求设定培养基流速10-60ml/min ； (4)将灌注小室、废液瓶、直通阀、储液瓶置于37°C，5% CO2培养箱内；(5)隔天更换培养基，根据实验需要设定加力时间为1-8天。(6)加力完成后，将接种有细胞的支架取出，进行扫描电镜观察细胞生长情况，免疫组化，RT-PCR分别检测待测蛋白及基因的表达。本发明具有如下优点1.本发明提供一种组装快捷的细胞培养系统，其不仅能将流体比较均勻地作用于细胞，而且流体全部通过接种了细胞的支架内部，将非灌流路径减到最小，2..在体外模拟出细胞生长的三维环境和力学环境，将细胞接种和长期培养整合于一个系统中；3.精确控制作用于培养细胞上的流量和切应力；4.用于观察新型支架材料是否有利于细胞生长繁殖；5.增加组织培养的数量，确保同一实验组内和组间可比性。6.灌注小室采用的成品玻璃注射器对细胞无毒无害，便于观察和消毒，灌注小室支架采用不锈钢金属，避免了生锈或金属污染对细胞造成损害等问题的发生。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明图1为本发明的纵剖面图1.蠕动泵，2.灌注小室，3. 1转8转接口，4.空气滤膜，5.废液瓶，6.直通阀，7.培养基，8.储液瓶，9.钼处理硅胶管。图2为灌注小室的纵剖面图10.6% (鲁尔)标准圆锥接头(培养基流入口)，11.0型垫圈，12.螺帽，13.钛板， 14.注射器针筒，15.钛支架，16.细胞支架，17.注射器活塞。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容，对本发明作出一些非本质的改进和调整。实施例1仿生三维流体切应力细胞培养装置由蠕动泵1、灌注小室2、1转8的转接口 3、空气滤膜4、废液瓶5、直通阀6、培养基7、储液瓶8和处理硅胶管9组成，灌注小室2的一端与蠕动泵1连接，灌注小室2的另一端通过1转8的转接口 3与废液瓶5连接；废液瓶通过直通阀6与储液瓶8连接；储液瓶8通过1转8的转接口 3与蠕动泵1连接。灌注小室2由玻璃注射器制成，可以观察到灌注小室2内培养基7、细胞支架16及流体内的气泡的情况，细胞支架16置于经机械径向切割两段的注射器活塞17之间，能够基本保证流体完全通过细胞支架，使非灌流旁路减少到最少，活塞与注射器内壁间的紧密接触满足GB/T 1962. 1-2001，同于IS0594-1 1986 <《注射器、注射针和其他医疗器械的6% (鲁尔)圆锥接头——第一部分通用要求》，达到泄漏率不超过0.005Pa*m3/S。灌注小室2上端由钛板13及O型硅胶圈11密封，上端钛板13通过钛支架15与下端钛板13连接，灌注小室上、下两端分别设有流体流入口 10和流出口。蠕动泵1头有8个通道分别和8个灌注小室2连接，蠕动泵1另一端通过1转8 的转接口 3和钼处理硅胶管9与储液瓶8连接，能使用不同直径的支架和注射器制成的不同灌注小室，减少了对实验设计的限制。
废液瓶5和储液瓶8内的钼处理硅胶管9顶端封有空气滤膜4，有利于孵箱中的氧气和二氧化碳进入培养系统内。仿生三维流体切应力细胞培养装置的切应力加载方法包括以下步骤(1)实验开始之前分别测定蠕动泵1每个通道的流速，流速控制到60ml/min ；(2)在无菌条件下，将接种了细胞的支架16固定于灌注小室2中，储液瓶8和废液瓶5中加入培养基7，连接整个加力装置；(3)打开蠕动泵1，排出整个管道内空气，根据实验要求设定培养基7流速60ml/ min ；(4)将灌注小室2、废液瓶5、直通阀6、储液瓶8置于37°C，5% CO2培养箱内；(5)根据实验需要设定加力时间为1天。(6)加力完成后，将接种有细胞的支架16取出，进行扫描电镜观察细胞生长情况， 免疫组化，RT-PCR分别检测待测蛋白及基因的表达。实施例2按照实施例1仿生三维流体切应力细胞培养装置的切应力加载方法包括以下步骤(1)实验开始之前分别测定蠕动泵1每个通道的流速，流速控制到30ml/min ；(2)在无菌条件下，将接种了细胞的支架16固定于灌注小室2中，储液瓶8和废液瓶5中加入培养基7，连接整个加力装置；(3)打开蠕动泵1，排出整个管道内空气，根据实验要求设定培养基7流速30ml/ min ；(4)将灌注小室2、废液瓶5、直通阀6、储液瓶8置于37°C，5% CO2培养箱内；(5)隔天更换培养基7，根据实验需要设定加力时间为4天。(6)加力完成后，将接种有细胞的支架16取出，进行扫描电镜观察细胞生长情况， 免疫组化，RT-PCR分别检测待测蛋白及基因的表达。实施例3按照实施例1仿生三维流体切应力细胞培养装置的切应力加载方法包括以下步骤(1)实验开始之前分别测定蠕动泵1每个通道的流速，流速控制到lOml/min ；(2)在无菌条件下，将接种了细胞的支架16固定于灌注小室2中，储液瓶8和废液瓶5中加入培养基7，连接整个加力装置；(3)打开蠕动泵1，排出整个管道内空气，根据实验要求设定培养基7流速IOml/ min ；(4)将灌注小室2、废液瓶5、直通阀6、储液瓶8置于37°C，5% CO2培养箱内；(5)隔天更换培养基7，根据实验需要设定加力时间为8天。
( 6)加力完成后，将接种有细胞的支架16取出，进行扫描电镜观察细胞生长情况， 免疫组化，RT-PCR分别检测待测蛋白及基因的表达。
权利要求
1.仿生三维流体切应力细胞培养装置，其特征在于该装置由蠕动泵(1)、灌注小室 (2)、1转8的转接口 (3)、空气滤膜(4)、废液瓶(5)、直通阀(6)、培养基(7)、储液瓶(8)和处理硅胶管(9)组成，灌注小室(2)的一端与蠕动泵(1)连接，灌注小室(2)的另一端通过 1转8的转接口(3)与废液瓶(5)连接；废液瓶通过直通阀(6)与储液瓶(8)连接；储液瓶 (8)通过1转8的转接口(3)与蠕动泵⑴连接。
2.如权利要求1所述仿生三维流体切应力细胞培养装置，其特征在于灌注小室(2)由玻璃注射器制成，可以观察到灌注小室(2)内培养基(7)、细胞支架(16)及流体内的气泡的情况，细胞支架(16)置于经机械径向切割两段的注射器活塞(17)之间，能够基本保证流体完全通过细胞支架(16)，使非灌流旁路减少到最少，活塞与注射器内壁间的紧密接触满足 GB/T 1962. 1-2001，达到泄漏率不超过0.005Pa*m3/s，灌注小室(2)上端由钛板(13)及O 型硅胶圈(11)密封，上端钛板通(13)过钛支架(15)与下端钛板(13)连接，灌注小室上、 下两端分别设有流体流入口(10)和流出口。
3.如权利要求1所述仿生三维流体切应力细胞培养装置，其特征在于蠕动泵(1)头有 8个通道分别和8个灌注小室⑵连接，蠕动泵⑴另一端通过1转8的转接口(3)和钼处理硅胶管(9)与储液瓶(8)连接，能使用不同直径的支架和注射器制成的不同灌注小室，减少了对实验设计的限制。
4.如权利要求1所述仿生三维流体切应力细胞培养装置，其特征在于废液瓶(5)和储液瓶(8)内的钼处理硅胶管(9)顶端封有空气滤膜(4)，有利于孵箱中的氧气和二氧化碳进入培养系统内。
5.如权利要求1-4之一所述仿生三维流体切应力细胞培养装置的切应力加载方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)实验开始之前分别测定蠕动泵⑴每个通道的流速，流速控制到10-60ml/min；(2)在无菌条件下，将接种了细胞的支架(16)固定于灌注小室(2)中，储液瓶(8)和废液瓶(5)中加入培养基(7)，连接整个加力装置；(3)打开蠕动泵(1)，排出整个管道内空气，根据实验要求设定培养基(7)流速 10-60ml/min ；(4)将灌注小室(2)、废液瓶(5)、直通阀(6)、储液瓶(8)置于37°C，5%CO2培养箱内；(5)隔天更换培养基(7)，根据实验需要设定加力时间为1-8天。(6)加力完成后，将接种有细胞的支架(16)取出，进行扫描电镜观察细胞生长情况，免疫组化，RT-PCR分别检测待测蛋白及基因的表达。
全文摘要
本发明公开了仿生三维流体切应力细胞培养装置及其切应力加载方法，其特点是该装置由蠕动泵(1)、灌注小室(2)1转8的转接口(3)、空气滤膜(4)、废液瓶(5)、直通阀(6)、培养基(7)、储液瓶(8)，处理硅胶管(9)组成，灌注小室的一端与蠕动泵(1)连接，灌注小室的另一端通过1转8的转接口(3)与废液瓶(5)连接；废液瓶通过直通阀(6)与储液瓶(8)连接；储液瓶(8)通过1转8的转接口(3)与蠕动泵(1)连接。
文档编号C12M3/00GK102174397SQ20111005370
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月7日 优先权日2011年3月7日
发明者伍颖颖, 刘晓光, 宫苹, 李凤, 班宇, 耿宁 申请人:四川大学