一种高专一性的测定小rna的方法

专利名称：一种高专一性的测定小rna的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学、基因工程和检测领域，更具体地涉及一种高专一性的测定小RNA的方法，该方法可应用于检测非编码RNA，从而对某些疾病的情况或状态进行描述。
背景技术：
MicroRNAs (小RNA)是一类新发现的非编码RNA,它通过序列专一丨丨生地结合到和它互补反义的mRNA的3’非编码区(3’ s UTR)来调控某个或某些目标mRNA转录及稳定性。大多数小RNA，如 let-7RNA，miR-1, miR-34, miR-60 及 miR-87 在无脊椎动物及脊椎动物中均是高度保守的。这说明它们能识别多个位点及(或)多个保守功能的基因的靶序列。通过对秀丽线虫基因组的分析,发现了另一种小RNA的亚型-小时序RNA(stRNA，如lin-4和let-7)。stRNA在调控发育过程中起到非常重要的作用，例如神经元再生、Dauer幼虫的形成、外阴形成以及下皮细胞的终极分化。小RNA通常由60 70个核苷酸的RNA前体折叠、剪切而成。一些小RNA —经表达即可被检测到，而一些则仅在表达峰值时才可被检测到。可能由于小RNA前体在其结合蛋白的保护下，使其不易被降解，因此通常只有一个发卡结构的链被剪切下，并积累起来。推测这些结合蛋白可以调节小RNA的转录抑制作用。小RNA的前体在Dicer RNAse III及Argonaute家族的酶的参与反应后才能形成成熟的小RNA。小RNA在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极其重要的作用。迄今为止，在人的细胞里，已发现了 1200多种小RNA(http://www. mirbase.org/)，这些小RNA参与调控了至少60%人类基因。小RNA是肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。血清或血浆中的与肿瘤相关小RNA已作为肿瘤诊断的生物学标记。小RNA的检测及定量是某些靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。因此，能够确定各种小RNA在特定细胞中的数量是相当重要的。在一些情况下，小RNA的定量测定显得尤为重要。如，比较不同组织中的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变化。由于序列相似的小RNA家族在同一细胞中均会存在，因此能否有个灵敏度高，又具备专一性好的检测方法显得尤为重要。再者，如果能有应用于高通量筛选样品的的方法如均质法、多重法那就再好不过了。现今，已有多种的小RNA定量分析方法面世，其中包括小RNA芯片矩阵，基于SYBR-Green I 的小 RNA定量反转录PCR法(Raymond, C. K. , Roberts,B. S. ,Garrett -Engele,P., Lim, L. P. , and Johnson, J. M. (2005)Simple, quantitative primer-extensionPCRassay for direct monitoring ofmicroRNAsand short-interfering RNAs. RNA 11,),基于莖状环形的 Taqman 法(Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT,BarbisinM, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR，Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. 2005.Real-time quantification of microRNAs by stem—loop RT-PCR. NucleicAcids Res33(20) :el79)，微珠法及高通量测序等。然而，以上所及的所有方法都各有缺陷。例如，基于杂交的测定法(微矩阵或微珠)灵敏度及专一性均不理想；基于SYBR-Green I的方法背景高，专一性差；使用茎状环形的Taqman法专一性虽不太差，但价格昂贵，费工费时，且有偏差，难于应用于高通量筛选。EvaGreen是一种双链DNA绑定染料。它对PCR反应抑制低、溶解曲线佳、光稳定性和热稳定性高，且不诱变，无细胞毒性。EvaGreen被应用于荧光定量PCR和溶解曲线的测定(Mao F, Leung WY, Xin X. 2007. Characterization ofEvaGreen and the implication ofits physicochemical properties for qPCRapplicatiohs. BMC Biotechnol. 9 ；7 :76.)。虽然BioRad, Qiagen, Agilent等公司均有基于EvaGreen的PCR反应液销售，且许多实验室也有使用自配的基于EvaGreen的反应液的报道，但没有报道或暗示过EvaGreen 可提高反应专一性。综上所述，目前本领域尚缺乏高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小RNA的方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小RNA的方法。在本发明的第一方面，提供了一种检测小RNA的方法，所述的方法包括步骤(a)对于待检测的小RNA样品，在小RNA的3’端添加polyA尾；(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引物与添加了 PolyA尾的小RNA进行退火；(c)反转录所述的添加了 polyA尾的小RNA,形成cDNA ;(d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。在另一优选例中，所述的检测包括通过对荧光强度的检测来达到定量检测小RNA。在另一优选例中，所述的待检测的小RNA样品是从待检测样本中抽提出的RNA。在另一优选例中，所述的抽提出的RNA是从含有或不含小RNA的样品中抽提出的总 RNA。在另一优选例中，在步骤(d)中，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩增产物的有无或数量。在另一优选例中，所述的正向引物具有以下特征(i)正向引物的3’端序列为与待检测的小RNA的5’端序列相同或基本相同，并且3’端序列与cDNA的Tm值为45-65 °C ；(ii)正向引物的5’端序列使得整个正向引物与cDNA的Tm值为45_75°C ;和
(iii)正向引物的长度为8-50bp。在另一优选例中，所述的反向引物具有以下特征(i)反向引物的3’端具有与待检测的小RNA的3’端序列互补的、长度为0-15个
碱基的第一互补区；(ii)反向引物的中间序列为长度为8-30个碱基的polyT ；(iii)反向引物的5’端序列使得整个反向引物与cDNA的Tm值为45_75°C ;和(iv)反向引物的长度为12_50bp。在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组动物样品、食物、饲料、和药物。
在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组体液、乳制品、蔬菜、肉类、肉制品、或水。在另一优选例中，在步骤(a)，所述的添加PolyA尾是通过在Ploy(A)聚合酶的催化下，在小RNA的3’端聚合加上AMP,从而形成polyA尾。在另一优选例中，polyA尾具有8-200个A，较佳地10-100个A，最佳地12-50个
A0在另一优选例中，所述的小RNA是长度15 200个核甘酸(更佳地，长度为18-100bp)的RNA分子。较佳地，所述的小RNA是非编码RNA。在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换poly (C)尾，或 poly (G)尾，或 poly (U)尾；并且在步骤(b)中，加入与所述的小RNA的polyN尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引物与添加了 polyN尾的小RNA进行退火；和在步骤(C)中，反转录所述的添加了 polyN尾的小RNA,形成cDNA。在本发明的第二方面，提供了一种提高聚合酶链反应中弓I物与模板的结合专一性的方法，包括步骤在聚合酶链反应的反应体系中，添加EvaGreen荧光染料。在另一优选例中，在所述的反应体系中，EvaGreen荧光染料在475纳米的光密度值在0.01到2之间。在本发明的第三方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用作提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。在本发明的第四方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用于制备提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。在本发明的第五方面，提供了一种获取待检测样本中非编码RNA信息的方法，包括步骤(a)从所述的待检测样本抽提含有所述非编码RNA的RNA样品；(b)对于步骤(a)抽提出的RNA，在非编码RNA的3’端添加polyA尾；(c)加入与所述的非编码RNA的polyA尾部互补的引物，从而使得所述引物与带polyA的非编码RNA进行退火；(d)反转录所述的含polyA尾的非编码RNA,形成cDNA ；(e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而获得所述非编码RNA的信息，其中所述信息包括所述非编码RNA是否存在于所述样品中以及存在的数量。在另一优选例中，所述的检测采用检测EvaGreen实时荧光变化的实时荧光定量PCR 法。在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换poly (C)尾，或 poly (G)尾，或 poly (U)尾。在另一优选例中，利用所获得的非编码RNA的信息，可用于对检测对象(其中包括但并不限于哺乳动物如人)的某种疾病的情况或状态进行描述。该方法尤其适用于以下情况a.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量增加；
b.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量减小。上述两种情况包含了多数非编码RNA在某种疾病中的表达情况。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。


图I显示了 EvaGreen实时突光定量法检测小RNA的流程。从上至下各步骤依次是加poly(A)尾；RT引物与RNA退火；反转录反应；和使用正向引物和反向引物进行PCR扩增。图2显示了本发明一个实例中正向引物的结构。图3显示了本发明一个实例中反向引物的结构。图4显示了 let_7a模板浓度梯度扩增曲线。图5显不了小RNA模板的量与Cq值呈线性关系。图6显示了 SYBR Green荧光定量PCR法与EvaGreen荧光定量PCR法的交叉反应专一性与灵敏度比较结果。图7显示了含有不同的荧光染料EvaGreen (通道一)及SYBR Green (通道二)对于专一性结合(实线)以及非专一性结合(虚线)的引物与模板结合的影响的融解曲线。图中,Trace I (曲线I)是EvaGreen和引物与专一丨丨生模板结合的突光值对温度求导的负数；Trace 3(曲线3)是SYBR Green I和引物与专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace 2(曲线2)是EvaGreen和引物与非专一'丨生模板结合的突光值对温度求导的负数；Trace 4(曲线4)是SYBR Green I和引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现，EvaGreen作为一种DNA结合染料居然能够显著提高PCR反应中引物与模板结合的专一性。具体地，与不添加另一常用的DNA结合染料SYBR Green I相比，虽然两者灵敏度上无明显区别，但是EvaGreen可以显著提高反应的专一性，因此EvaGreen特别适用于区分和检测结构差异极小的小分子RNA。在此基础上，本发明开发了新的高专一性测定小RNA的方法。本发明提供了一种具有优势的小RNA检测、分类及定量的实验方法。本发明的检测小RNA的方法适用于检测microRNAs (小RNAs)或其他小分子核苷酸，如s iRNA。在此发明中，提供了一种基于EvaGreen的定量PCR法(尤其是实时定量PCR法)，它适用于定量检测小RNA。基于EvaGreen的定量PCR法可以进一步扩展应用于mRNA及基因表达的定量检测。术语如本文所用，术语“EvaGreen”, “Eva Green”或“EvaGreen染料”可互换使用，指是Biotium公司生产的一种商品名为EvaGreen的DNA结合染料,它是一种同时适用于实时PCR和高分辨率熔解曲线(HRM)分析的染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度以下进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析。由于EvaGreen染料在光谱特性上类似于FAM以及SYBRGreen I，因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。此外，和SYBR GreenI以及SYBR GreenER不同的是，EvaGreen染料非常稳定且无致突变性和细胞毒性。EvaGreen 染料的结构信息在例如美国专利US7, 776，567中有详细描述。如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。t匕如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。如本文所用，术语“Poly (A)聚合酶”，是指一类酶，这类酶可以利用ATP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP。Poly(A)聚合酶可以从原核或真核生物中提取。由于这类酶的专一性不强，这类酶可以分别利用CTP，或GTP，或UTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个CMP或GMP，或UMP0如果非编码RNA是添加了的poly (C)尾，或是poly(G)尾，或是poly(U)尾，在此发明中，与尾部互补的引物也相应变化。Poly (U)聚合酶是和Poly (A)聚合酶不同，但类似的酶。它可以利用UTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个UMP。它也可以非特异性地分别利用ATP，或CTP，或GTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP或CMP，或GMP。因此，在本发明中，Poly (A)聚合酶和Poly(U)聚合酶有同样的功效。如本文所用，术语“polyA尾”，是本发明第一步中在RNA的3’端添加的寡聚到多聚A (AMP，腺苷酸)。这个“polyA尾”可用“polyC尾”，“polyG尾”，“polyU尾”替代。相应地，在下一步引入的和尾部互补，或基本互补的引物的序列也要变化。“polyA尾”也可以通过RNA链接酶(RNA Ligase)加上。 现参见图1，本发明的一种优选的技术方案包括以下步骤(I)从含有或不含小RNA的样品中抽提总RNA。在Poly⑷聚合酶的催化下在小RNA的3’端聚合加上AMP，使小RNA形成一个polyA尾。
(2)加入与polyA互补的引物，退火。(3)在反转录酶的催化下，反转录小RNA使之成为cDNA。(4)使用正、反向引物及含有EvaGreen的荧光染料的PCR反应混合母液对cDNA进行扩增(5)在扩增过程中，实时检测EvaGreen染料的荧光值的变化。本发明中，优选的引物结构如图2和图3所示。正向引物一般可以分为2部分，3’端部分的引物与模板小RNA的5’端完全互补，退火温度一般在45 65摄氏度之间，而引物的另一部分-5’端的附加序列(尾)将整条引物的退火温度提高到50 75摄氏度之间(图2)。反向引物则由3部分组成第一部分，引物的3’端0 15个碱基与小RNA的3’端完全互补；中间部分，约10 30个碱基为10 30个dT，与小RNA加上的Poly (A)的尾互补；第三部分为一个0 40碱基的附加序列(尾)(图3)。应理解，当第三部分为0碱基时，反向引物可以只有2部分构成。PCR反应的进行需要含有EvaGreen的反应母液。反应程序可以是常规的2个温度条件的(如95摄氏度变性；60摄氏度退火及延伸)或3个反应温度的条件(如95摄氏度变性；50摄氏度退火及72摄氏度延伸)。反应须在含有镁离子、dNTP、及EvaGreen——双链DNA绑定染料的缓冲体系中进行。可用本发明方法检测的小RNA，其长度没有特别限制，通常为15_200bp，较佳地为18-100bp，更佳地为 19-40bp。可用本发明方法检测的含小RNA的生物学样品没有特别限制。应理解，生物学样品是十分广泛的一个概念，可以是一个或多个细胞，也可以是样本或培养物(包括微生物培养物)，甚至包括合成来源的样本。通常，生物样本可以是动物样品，包括人类样品如体液、固体样品如骨骼或组织。样品也可以是液态或固态食物或饲料及药物，如乳制品、蔬菜、肉类及肉制品、水等。样品可以来源于任何家养或野生动物，如有蹄类、熊类、鱼类、兔类、啮齿类等。 应用小RNA的检测及定量是其靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。比如，比较不同组织中的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变化。血清或血浆中小RNA也可作为肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。本发明的主要优点在于(a)专一性非常强。(b)灵敏度高。(C)同时适合高通量筛选和精细筛选。(d)重复性高。(e)价格便宜。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I在实时荧光定量PCR法中EvaGreen具有更高的专一性本发明人试验了4X106，4X105，4X104，4X103，4X102，40，4，以及 O(NTC) (NTC 为
无底物对照)个分子的模板量(hsa-1 et7a, SEQ ID NO :1或表I)，使用正向引物(SEQ ID
NO 9或表I)及反向引物(SEQ ID NO 10或表I)连同含有EvaGreen的PCR反应母液进行
实时荧光定量PCR反应。表I小RNA以及引物序列
权利要求
1.一种检测小RNA的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤 (a)对于待检测的小RNA样品，在小RNA的3’端添加polyA尾； (b)加入与所述的小RNA的PoI yA尾部互补或基本互补的引物，从而使所述弓I物与添加了 polyA尾的小RNA进行退火； (c)反转录所述的添加了polyA尾的小RNA,形成cDNA ； (d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩增产物的有无或数量。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的正向引物具有以下特征 (i)正向引物的3’端序列为与待检测的小RNA的5’端序列相同或基本相同，并且3’端序列与cDNA的Tm值为45-65 °C ； (ii)正向引物的5’端序列使得整个正向引物与cDNA的Tm值为45_75°C;和 (iii)正向引物的长度为8-50bp。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的反向引物具有以下特征 (i)反向引物的3’端具有与待检测的小RNA的3’端序列互补的、长度为0-15个碱基的第一互补区； ( )反向引物的中间序列为长度为8-30个碱基的polyT ； (iii)反向引物的5’端序列使得整个反向引物与cDNA的Tm值为45_75°C;和 (iv)反向引物的长度为12-50bp。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的待检测样本选自下组动物样品、食物、饲料、和药物。
6.一种提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的方法，其特征在于，包括步骤在聚合酶链反应的反应体系中，添加EvaGreen荧光染料。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的反应体系中，EvaGreen荧光染料在475纳米的光密度值在O. 01到2之间。
8.—种EvaGreen荧光染料的用途，其特征在于，用作提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
9.一种EvaGreen荧光染料的用途，其特征在于，用于制备提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
10.一种获取待检测样本中非编码RNA信息的方法，其特征在于，包括步骤 (a)从所述的待检测样本抽提含有所述非编码RNA的RNA样品； (b)对于步骤(a)抽提出的RNA，在非编码RNA的3’端添加polyA尾； (c)加入与所述的非编码RNA的polyA尾部互补的引物,从而使得所述引物与带polyA的非编码RNA进行退火； (d)反转录所述的含polyA尾的非编码RNA，形成cDNA； (e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物；并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数量，从而获得所述非编码RNA的信息，其 中所述信息包括所述非编码RNA是否存在于所述样品中以及存在的数量。
全文摘要
本发明提供了一种高专一性测定小RNA的方法。具体地，本发明方法包括步骤(a)在小RNA的3’端添加polyA尾；(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，进行退火；(c)对小RNA进行反转录，形成cDNA；(d)在含有EvaGreen荧光染料的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物，以及通过检测扩增产物来确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。和现有的定量检测小RNA的方法相比，本发明方法可显著提高检测小RNA(包括非编码RNA)的专一性。
文档编号C12Q1/68GK102676637SQ20111005410
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者丁航海, 吴鸿菲, 谭若颖, 龚祖埙 申请人:生元科技有限公司