利用纤维素酶和半纤维素酶构建食品安全级载体及筛选培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了利用纤维素酶和半纤维素酶构建食品安全级载体及筛选培养基，属于基因工程领域。一种食品安全级载体，以半纤维素酶、β?葡糖苷酶为筛选标记，含有半纤维素酶编码基因、β?葡糖苷酶编码基因，能表达半纤维素酶和β?葡糖苷酶。该载体的筛选培养基没有微生物可直接利用的碳源，包含阿拉伯木聚糖和栀子蓝。将半纤维素酶编码基因、β?葡糖苷酶编码基因克隆到载体上得到食品安全级载体。本发明利用半纤维素酶以及β?葡糖苷酶作为筛选标记酶，同时利用特殊的筛选培养基，能够快速准确的筛选出转化子；由于筛选标记不为抗生素，因而为食品安全级的载体。
【专利说明】利用纤维素酶和半纤维素酶构建食品安全级载体及筛选培养基
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于基因工程领域，涉及利用纤维素酶和半纤维素酶构建食品安全级载体及筛选培养基。
【背景技术】
[0003]载体是构建基因工程菌株必备的工具之一，是对微生物进行改造的基础。随着基因工程技术的不断进步，越来越多的载体被构建出来，有表达载体，有克隆载体，有杂交载体。以往发明的载体往往都以抗生素作为筛选标记。利用抗生素筛选标记具有筛选效率高的特点，因此大多数的质粒都选用抗生素作为筛选标记。利用抗生素作为筛选标记可以构建细菌、酵母菌、植物等克隆或表达的载体，现已经利用抗生素作为筛选标记构建了大量的基因工程菌株。
[0004]现在大多数的载体都是利用抗生素的抗性作为载体的筛选标记，抗生素对人类食品安全的危害是很多的，因此利用抗生素作为筛选标记的载体其应用就有很多局限性。
[0005]作为筛选标记必须具有以下特点:能够轻易区分转化子和非转化子;能够让目的基因片段或目的单元整合在基因组中，或稳定在宿主菌中存在。在构建基因工程菌中，对于整合型质粒有更多的偏爱，整合型质粒不会轻易环出，相对而言具有更好的稳定性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于在于提供一种食品安全级载体及其构建方法与筛选培养基。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种食品安全级载体，以半纤维素酶、葡糖苷酶为筛选标记，含有半纤维素酶编码基因、β_葡糖苷酶编码基因，能表达半纤维素酶和葡糖苷酶。优选的，所述的半纤维素酶编码基因、葡糖苷酶编码基因来源于黑曲霉。
[0008]所述的半纤维素酶编码基因的序列优选如SEQID N0.1所示。
[0009]所述的β-葡糖苷酶编码基因的序列优选如SEQID N0.2所示。
[0010]所述的食品安全级载体的构建方法，包括如下步骤:将半纤维素酶编码基因、β-葡糖苷酶编码基因克隆到载体上，使载体能够表达半纤维素酶和β-葡糖苷酶。
[0011]优选的，所述的食品安全级载体的构建方法包括如下步骤:将SEQID N0.3所示序列、SEQ ID N0.4所示序列通过限制性内切酶及DNA连接酶构建到ρΗΤΟ I载体上;其中限制性内切酶为Kpn1、BamHI和Xba1、AatI ,Kpn1、BamHI对应酶切SEQ ID N0.3所示序列，Xba1、AatI对应酶切SEQ ID N0.4所示序列。
[0012]所述的食品安全级载体的筛选培养基，包含阿拉伯木聚糖和栀子蓝。该培养基没有微生物可直接利用的碳源，只有载体上的半纤维素酶表达后，才能把阿拉伯木聚糖转化成微生物可以利用的阿拉伯糖，使微生物生长增殖；同时β-葡糖苷酶把栀子蓝转化成栀子红，从而使菌落周围呈现淡淡红色。基于此，半纤维素酶编码基因和β-葡糖苷酶编码基因组合可用于构建食品安全级载体。
[0013]优选的，所述的筛选培养基的配方为:阿拉伯木聚糖10g/L，栀子蓝1.5g/L，FeCl30.2g/L,NH4NO3 0.1g/L,NaCl 2g/L，YGM003A酵母细胞全合成培养基YGM003A-1 1.5g/L，琼脂20g/L。
[0014]本发明利用半纤维素酶以及β-葡糖苷酶作为筛选标记酶，同时利用特殊的筛选培养基，能够快速准确的筛选出转化子。由于筛选标记不为抗生素，因而为食品安全级的载体。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0016]实施例1 1、材料
限制性内切酶购自Takara ；质粒提取试剂盒(Β518188)、DNA连接酶购自上海生物工程股份有限公司；含有质粒PHTOl的大肠杆菌DH5a保藏于实验室；枯草芽孢杆菌subtilis)ClCC 20034;人工合成的分别如SEQ ID N0.3、4所示的合成序列1、合成序列2。
[0017]2、质粒pHTOl的提取
含有表达质粒PHTOl的大肠杆菌DH5a，在含氯霉素5mg/L的LB培养基中培养12h，培养温度为30°C，用质粒提取试剂盒(B518188)提取质粒。提取步骤如下:
(I)取0.5mL菌液，1000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。
[0018](2)在菌体沉淀中加入700yL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。
[0019](3)将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置lmin，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0020](4)向吸附柱中加入500yL Prewash Solut1n，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0021 ] (5)向吸附柱中加入500yL Wash Solut1n，8000rpm离心lmin。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0022](6)重复向吸附柱中加入500yL Wash Solut1n,8000rpm离心lmin。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0023](7)将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。
[0024](8)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50yL Elut1nBuffer，室温静置2min，8000 rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于_20°C保存。
[0025]3、质粒pHTOl和SEQ ID N0.3所示合成序列I的酶切
往25UL提取的质粒pHTOl中加入KpnI和BamHI酶各0.2μ?，加入酶切缓冲液及双蒸水24.641^，在30<€保温60!11；[11，加入541^ Loading Buffer，60°C保温…!^!!，得到质粒口^^^^酶切液。
[0026]合成序列I用双蒸水稀释10倍，取25tiL，加入KpnI和BamHI酶各0.2μ?，加入酶切缓冲液及双蒸水24.6yL，在30°C保温60min，加入5yL Loading Buffer，60°C保温1min，得到合成序列I酶切液。
[0027]4、酶切液电泳 (I)电泳试剂配制
I)5 XTBE(tris-硼酸及EDTA)缓冲液的配制(100mL):Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至100mLJcC冰箱保存，用时稀释5倍。
[0028]2)加样缓冲液的配制:0.25%溴酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液，4°C冰箱保存。
[0029]3)溴化乙锭的配制:称取0.1g溴化乙锭，溶于1mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，40C冰箱保存。染色时，吸取12.5yL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5yg/mL，混合均匀。
[0030]4)100XTE缓冲液的配制:lmol/L Tris_HCl(pH8.0)，100mmol/L EDTA。称取Tris121.1g,EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0(大约加入盐酸20mL)，然后定容至1000mL。
[0031 ] 5)100 X 电泳缓冲液的配制:4mol/L Tris-HCl(ρΗ8.0)，2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTAο称取Tri s 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调PH至8.0(大约加入冰乙酸50mL)，然后定容至500mL。用时稀释100倍。
[0032](2)电泳方法
I)安装电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
[0033]2)1%琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。
[0034]3)灌胶:将冷却到60°C的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
[0035]4)待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
[0036]5)加样:将DNA样品与加样缓冲液按体积比4:1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20yL，记录样品的点样次序和加样量。
[0037]6)电泳:安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳l-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿l-2cm时，停止电泳。
[0038]7)染色和观察:取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带。
[0039]5、酶切片段的回收和纯化
使用Takara的胶回收试剂盒回收纯化酶切的DNA片段。在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
[0040]称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM,Buffer GM的加量3凝胶体积。均匀混合后室温25°C溶解胶块lOmin。当凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)1yL，均匀混合至溶液恢复黄色。将试剂盒中的Spin Column安置于Collect1nTube上。0.2mL胶溶解液转移至Spin CoIumn中，12000rpm离心I分钟，弃滤液。将700yL的Buffer 加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。再次将700yL的BufferWB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将Spin Column安置于Collect1n Tube上，室温12000印111离心1111；[11。将3。;[11 CoIumn安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30yL灭菌蒸馈水或Elut1n Buffer，室温静置I分钟。室温 12000rpm 离心 Imin 洗脱 DNA。
[0041 ] 6、酶切的pHTOl质粒与合成序列I的连接与转化
连接体系为:酶切回收的合成序列I 7tiL，酶切回收的pHTOl质粒ltiL，T4 DNA Iigase IyL，Buffer IyL。4°C连接24小时。
[0042]取一管-80°C保存的大肠杆菌DH5a(不含质粒)感受态细胞50yL，置冰上融化，加入5yL上述连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min;将离心管置于42°C热击60-90秒，然后迅速置冰浴3分钟。向离心管中加入500yL液体LB培养基(不含氯霉素)，混匀后置于37°C摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。吸取10yL培养液加到含氯霉素5mg//L的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37°C培养12-16小时。挑选单菌落，保藏得到转化子。
[0043]转化子在含氯霉素5mg/L的LB培养基中，30°C培养12h。用质粒提取试剂盒(B518188)提取质粒。所提取质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pHTOl-1o
[0044]7、将SEQ ID从).4所示合成序列2构建到重组质粒?!11'01-1上
按照上述步骤将重组质粒pHTOl-Ι、合成序列2进行酶切、连接、转化、鉴定，其中重组质粒pHTOl-Ι、合成序列2的酶切所用内切酶为XbaI和AatII，最后得到重组质粒pHT01-l_2。
[0045]8、质粒pHTOl-1-2转化芽孢杆菌 (I)枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备
培养基A( 10mL):蛋白胨Ig，酵母粉0.5g，NaCl Ig，山梨醇9g，pH值为7.0。
[0046]溶液B(10mL):山梨醇9g，甘露醇9.25g，葡萄糖10g。
[0047]溶液C(1mL): 9mL溶液B+lmL甘油。
[0048]I)枯草芽孢杆菌CICC 20034接菌种于2mL培养基A中，37°C、200rpm过夜培养，约1h0
[0049]2)将2mL过夜培养的菌液添加到98mL培养基A中，37°C、200rpm培养3?4h。
[0050]3)将菌液冰水浴10?15111；[11，后4°0、5000印111离心10111；[11收集菌体。
[0051 ] 4)用20mL预冷的溶液B，如此漂洗3次。
[0052]5)将洗涤后的菌体重悬于600yL溶液C中，混匀后按60yL每管分装于预冷的EP管中，得到枯草芽孢杆菌感受态细胞。
[0053](2)电转化
将质粒pHTOl-1-2加入枯草芽孢杆菌感受态细胞中并冰上预冷1min后加入到预冷的电转化杯中。在电压为1.5kV(P.LENGTH= 10ys，PULSES=04，INTERVAL=555ms)条件下电击后，迅速加入500yL培养基A，再转至EP管中，37 °C、200rpm培养3h。取0.4mL加入到离心管中，5000r/m离心1min，弃上清液，再加入ImL蒸馏水重悬，5000r/m离心1min，弃上清液，加入ImL蒸馈水，重悬得到最终重悬液。
[0054]9、筛选培养基设计和筛选
筛选培养基:阿拉伯木聚糖 10g/L，栀子蓝 1.5g/L，FeCl3 0.2g/L，NH4NO3 1.0g/L，NaCl2g/L，YGM003A酵母细胞全合成培养基YGM003A-1 1.5g/L，琼脂20g/L，115 °C灭菌20min，倒平板。最终重悬液涂布于筛选平板，28 0C培养48h，菌落周围有淡淡红色的为转化子。
[0055]因为在筛选培养基中，没有枯草芽孢杆菌可直接利用的碳源，只有质粒上的半纤维素酶表达后，才能把阿拉伯木聚糖转化成芽孢杆菌可以利用的阿拉伯糖，使枯草芽孢杆菌生长增殖。同时葡糖苷酶把栀子蓝转化成栀子红，从而使菌落周围呈现淡淡红色。
[0056]对照实验:将含有质粒pHTOl或不含质粒的枯草芽孢杆菌稀释涂布筛选培养基平板进行培养，没有菌落生长。
[0057]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种食品安全级载体，其特征在于:含有半纤维素酶编码基因、β-葡糖苷酶编码基因。2.根据权利要求1所述的食品安全级载体，其特征在于:所述的半纤维素酶编码基因的序列如SEQ ID N0.1所示。3.根据权利要求1所述的食品安全级载体，其特征在于:所述的β_葡糖苷酶编码基因的序列如SEQ ID N0.2所示。4.权利要求1所述的食品安全级载体的构建方法，其特征在于:包括如下步骤:将半纤维素酶编码基因、葡糖苷酶编码基因克隆到载体上。5.根据权利要求4所述的食品安全级载体的构建方法，包括如下步骤:将SEQID N0.3所示序列、SEQ ID N0.4所示序列通过限制性内切酶及DNA连接酶构建到ρΗΤΟ I载体上;其中限制性内切酶为Kpn1、BamHI和Xba1、AatI。6.权利要求1所述的食品安全级载体的筛选培养基，其特征在于:包含阿拉伯木聚糖和栀子蓝。7.根据权利要求6所述的食品安全级载体的筛选培养基，其特征在于:配方为:阿拉伯木聚糖 10g/L，栀子蓝 1.5g/L，FeCl3 0.2g/L,NH4NO3 0.1g/L，NaCl 2g/L，YGM003A酵母细胞全合成培养基YGM003A-1 1.5g/L，琼脂20g/L。8.半纤维素酶编码基因和β-葡糖苷酶编码基因组合在构建食品安全级载体中的应用。
【文档编号】C12N15/66GK106011161SQ201610596798
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】薛栋升, 梁龙元
【申请人】湖北工业大学