Hla-a0201限制性抗muc-1抗原特异性ctl的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术开发与应用研究领域，设及HLA-A0201限制性抗MUC-1抗原特 异性CTL制备方法。
【背景技术】
[0002] -、肿瘤治疗的困境与机会
[0003] 恶性肿瘤已成为人类第一号"杀手"，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的Ξ大常规方 法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、 化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要 原因。常规治疗方法已力不从屯、，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。
[0004] 二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展
[0005] 上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为 首的研究小组研制出淋己因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞 的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注（3 X l〇iwi)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2(化-2) (10万IU/kg，q她），因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋己细 胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿 瘤组织中分离获得，运极大限制其广泛的临床应用。在W上的工作基础上，1991年Stanford 大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素丫（IFN-丫）、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse anti-Human CD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的 杀伤细胞(CIK)。
[0006] 树突状细胞（DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞 (APC)，其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHC I类和MHCn类分子），免疫共 刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等）。经抗原刺激后的DC细胞向淋己结迁移，将其携带的抗 原信息传递给相应的T淋己细胞，启动、激发CD4+/CD8巧细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤 细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8(比-8)、干扰素 a(IFN-a)、白细胞介素- 12(化-12)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)等，增强机体非特异性免疫应答(天然免疫），故DC有"天 然免疫佐剂"的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机 体免疫防御系统中所处的中屯、地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希 望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford 医学院的2位教授成立了世界上第一家WDC为基础的肿瘤疫苗公司(〇611化6〇11，〔4)，该公司 的产品Provenge已于2010年4月29日获得抑A批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身 免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不 如体外效果理想。
[0007] 细胞毒性T淋己细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接 杀伤肿瘤祀细胞的能力，因此成为研究的热点。
[0008] S、MUC-1在肿瘤免疫治疗中的作用
[0009] MUC-1粘蛋白家族成员，又称为多形上皮粘蛋白（poly-mo;rphic epithelial mucin，PEM)、上皮膜抗原（邱ithelial membrane antigen，EMA)、CD227及CAl53等，其相对 分子量大于400000,是一种主要分布于腺上皮细胞的跨膜糖蛋白，分为细胞外区、跨膜区和 胞内区。
[0010] 在恶性肿瘤组织中，如乳腺癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤组织中， MUC-1的表达存在质与量的异常，主要体现在表达量增高为正常的10倍W上，且增加的程度 与肿瘤的恶性程度成正比，极性分布消失，整个腺上皮细胞表面均表达MUC-1，胞浆中也表 达，糖链的糖基化不全，导致肤链表位暴露，使MUC-1成为可被免疫系统识别的肿瘤抗原。
[0011] MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，它几乎表达于所有的上 皮细胞腺癌中，且MUC-1可W通过非人类主要组织相容性复合体(MHC)限制性及Μ肥限制性 两种方式诱导活化CTL，杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞，因而MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗 理想的祀分子。
[0012]因此，开发新型针对MUC-1祀点的特异性CTL是一种发展方向。
[OOU] 四、CTL作用机理
[0014] 1、机体T细胞免疫反应过程
[001引机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体(TCR)特异识别不同 的外部抗原分子(细菌、病毒和肿瘤抗原多肤），被活化为具有杀灭祀细胞的CTL，清除细菌、 病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复 发。
[0016] CTL免疫应答大致分四个阶段：
[0017] (1)抗原识别:APC通过表面受体识别并捕获抗原(细菌、病毒、肿瘤细胞）；
[0018] (2)抗原加工与递呈：抗原经APC消化、裂解成多肤分子，后者与APC胞内丰富的 MHC-I类或Π 类分子结合分别形成MHC-I-多肤或MHC-II-多肤复合物，并被转运至APC表面； [0019] (3)Τ细胞激活(双信号学说）:APC与T细胞相遇，T细胞通过自身TCR识别APC递呈的 MHC-I/II-多肤复合物，其中CD8巧细胞识别MHC-I-多肤复合物，CD4巧细胞识别Μ肥-II-多 肤复合物，Τ细胞接受了抗原的刺激信号（第一信号）加上免疫共刺激信号（第二信号)开始 活化，具有细胞毒性作用即CTl;
[0020] (4)祀细胞杀灭：活化CTL循环至抗原所在部位，通过CTL表面的TCR特异识别抗原 表达细胞后进行杀伤和清除。
[0021] 但，已发现肿瘤患者体内存在大量免疫抑制因子，影响CTL的有效活化和增殖，数 量甚少，不足W与迅速增殖的肿瘤抗衡。若能在体外制备大量抗原特异性CTL并回输给患 者，可直接、快速杀伤肿瘤细胞起到治疗作用，对常规治疗无法清除的残留肿瘤细胞进行杀 灭，将可W防止肿瘤的复发和转移。
[0022] 2、CTL表型与功能差异
[0023] 根据CTL表面分子的表达种类可分为两型：中央记忆型CTL(CTL-gm)和效应记忆型 CTL(CTL-em)〇
[0024] Klebanoff等研究发现：表型分析为CD3+CD45R0+CD6化+CCR7+的C化-CM具有更强的 抗肿瘤能力；Johnson等比较了 MART-1TCR基因修饰的CTL-?和CTL-EM，结果发现前者消退恶 性黑色素瘤细胞的能力是后者的10倍。Berger等研究结果还显示CTLgm输注后较表型为CDS +CD45RO+CD62kCCR7-的CTL-em在体内能存活更长的时间。
[0025] 3、CTL技术开发现状
[0026] 综合国内、国外CTL体外制备技术可归类为Ξ种方法与来源：
[0027] (1)肿瘤浸润淋己细胞(TIL)体外扩增法
[00%]从肿瘤患者肿瘤组织中分离TIL，加入白细胞介素-2(化-2)培养，克隆稀释法筛选 肿瘤抗原阳性的T细胞克隆，再加入鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2进行扩增培养获得。
[0029] Li等选择HLA-A201阳性的IV期恶性黑色素瘤患者，将其肿瘤组织制备成单细胞悬 液后，加入比-2培养，5周后筛选扩增细胞中CD8巧+MART-1+的阳性T细胞克隆，再加入鼠抗 人CD3单克隆抗体和福照后的PBMC饲养细胞扩增培养，次日加入IL-2,再培养12天可获得 CTLs，能对负载MART-1多肤的T2细胞株特异性识别和杀伤。
[0030] (2)TCR基因修饰法
[0031] TCR是T细胞识别抗原、介导免疫应答的关键分子，包括α、β、丫、δ四条链，由二硫键 连接成α/β和丫作两种异二聚体，其中α/β巧细胞占外周血Τ细胞的90-95%，是主要的免疫 效应细胞。TCR基因修饰即通过外源质粒转染自体Τ淋己细胞，导入能识别特异性抗原多肤 的TCR基因，挑选阳性克隆，在体外扩增培养获得CTL。较为常用的质粒有逆转录病毒质粒或 慢病毒质粒。
[0032] Morgan等采用抗CD3+CD28+磁珠激活CD8巧细胞，应用慢病毒质粒转染修饰MART-1 或gplOO特异性的TCR基因，采用鼠抗人CD3单克隆抗体和IL-2培养体系制备CTLs，在12天能 扩增培养至1〇9个细胞，用于15例HLA-A化的黑色素瘤患者的治疗，结果显示有2例患者出现 了明显的临床疗效，1例52岁男性患者的蔽窝转移病灶消失，肝转移病灶缩小了 89%，无病 生存期为21个月；1例30岁男性患者，肺部转移病灶消失，无病生存期为20个月。
[0033] Perro等采用白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-2UIL-21)细胞因子组合促进 TCR基因转染非增殖的T细胞，可W维持T细胞高表达CD6化和CD28。
[0034] (3)体外抗原致敏法
[0035] 用人工APC(Artificial APC)，或抗原(蛋白质，多肤，或全细胞)体外反复刺激T细 胞，获得抗原特异性CTL。
[0036] 浙江大学的发明专利（专利号:CN102168066A)体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞 毒性T淋己细胞的方法即采用该方法。将MHC-1-Ig和抗CD28mAb包被磁珠构建人工APC，抗原 表位肤负载APC后，体外致敏3-4周，再W磁珠吸附分离抗原特异性CTUTetramer染色鉴定。
[0037] 上述Ξ种方法的缺陷：
[003引 （l)TIL体外扩增法
[0039] ①需要获得患者的新鲜肿瘤组织作为CTL来源，仅限于可手术的患者，且肿瘤组织 来源有限；
[0040] ②TIL分离，CTL克隆的获取与鉴定方法复杂，肿瘤组织中各种细胞成分较多，较复 杂，分离细胞的时间长，一般都需要1个月W上；
[0041 ] ③TIL中混有CD4+CD25巧reg亚群，其会抑制CTL扩增效率；
[0042] ④由于体外分离扩增时间长，增加了污染的机会。
[0043] (2)TCR基因修饰法
[0044] ①外源性质粒(逆转录病毒或慢病毒等)的引入，给临床应用带来一定的风险；
[0045] ②内源性TCR干扰，导入的TCR基因可能并不能导入预期的位点，而与内源性的TCR 发生错排，其能识别抗原不是预期设计的，且是未知的，存在很大的风险。
[0046] (3)体外人工APC负载抗原致敏法
[0047] ①引入外源物质:人工APC，制备的CTL是否有人工APC残留仍是疑问；
[0048] ②人工APC体外致敏CTL的周期较长，需要3-4周，获得CTL还需要扩增培养后才能 满足临床治疗的需要，因此体外培养的周期长，污染的几率较大。
[0049] 目前还没有文献报导过制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的HLA- A0201限制性抗原特异性CTL