Nkt细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞生物学领域，具体设及一种NKT细胞的培养方法，尤其是NKT细胞 的Ξ维培养方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为 运种新生物多呈占位性块状突起，也称寶生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性 程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。
[0003] 传统的肿瘤治疗方法有手术治疗、放疗和化疗。但手术对于对分散的、不可见的癌 细胞无法消除，故存在着复发和转移的风险。放化疗可W消灭肿瘤细胞，缓解病情，但放化 疗没有识别的能力，往往在杀死肿瘤细胞的同时杀伤了正常的细胞，长期的放化疗会让患 者免疫力降低，出现毒副作用。为弥补运些治疗方法的缺陷，细胞免疫治疗出现了。
[0004] 细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细 胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，祀向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭 血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力， 兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可W恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀 瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与 转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。
[0005] NKT细胞是免疫细胞治疗中非常重要的一类细胞群。NKT(na化ral killer T)细胞 是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群，可分泌大量的IL-4 和IFN- 丫因子，是免疫调节和细胞杀伤性作用的重要细胞群。NKT细胞活化后具有NK细胞样 细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的祀细胞，主要效应分子是穿孔素、Fas配体和IFN-丫。目前 NKT细胞作为具有强力杀伤祀细胞的一类细胞群，在肿瘤免疫细胞治疗中具有非常重要的 作用。经体外培养得到的NKT细胞能很好的起到肿瘤免疫治疗和保健作用。
[0006] 在NKT细胞常规培养中，主要是利用培养瓶或培养袋按一定细胞密度直接进行培 养，具体培养方法是:普通培养瓶用包被液A(Retronectin蛋白）和包被液B(Anti-CD3蛋白） 包被;外周血分离单个核细胞(PBMC)，经磁珠分选获得NK/NKT细胞，接种至经包被后的培养 瓶中；培养14天收集NK/NKT细胞。
[0007] 然而传统培养瓶培养NKT细胞，部分细胞很容易贴壁。当细胞增殖培养时，大量的 成团细胞很容易沉于底部，易导致NKT细胞不能充分接触培养液，减缓细胞增殖，并且容易 使成团的细胞死亡。
【发明内容】
[000引有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NKT细胞的培养 方法。本发明所述培养方法利用径丙基甲基纤维素在NKT细胞培养初期建立起培养液的Ξ 维结构，W解决NKT细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部而无法很好的接触培养液的问题。
[0009] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] -种NKT细胞的培养方法，单个核细胞接种X-VIV015无血清培养基，加入径丙基甲 基纤维素溶液、比-2、比-15、比-21W及CD3单克隆抗体培养NKT细胞。
[0011] 径丙基甲基纤维素化PMC):是选用高度纯净的棉纤维素作为原料，在碱性条件下 经专口酸化而制得，溶于水及大多数适当比例的乙醇/水、丙醇/水、二氯乙烧等，在冷水中 溶胀成澄清或微浊的胶体溶液。本发明所述培养方法利用径丙基甲基纤维素的常溫成胶效 果，加入径丙基甲基纤维素溶液，在NKT细胞培养初期建立起培养液的Ξ维结构，使NKT细胞 在Ξ维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免NKT细胞在增殖过程中成 团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。
[001^ 其中，在一些实施方案中，所述NKT细胞的培养方法中所述径丙基甲基纤维素的终 浓度为0.8wt % -6wt %，粘度为20Mpa. s-80Mpa. S。
[0013] 在一些实施方案中，所述NKT细胞的培养方法中所述单个核细胞接种X-VIV015无 血清培养基的接种量为5 X 106个/mL-15 X 106个/血。
[0014] 本发明所述培养方法除了加入了径丙基甲基纤维素外还加入了一下细胞因子，包 括比-2、比-15、比-21W及CD3单克隆抗体。
[0015] 在一些实施方案中，本发明所述培养方法中所述IL-2的终浓度为200-1000U/mL、 比-15的终浓度为200-1000U/mL、比-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度 为lOO-lOOOU/mL。
[0016] 本发明所述培养方法培养时间优选为14天W上。
[0017] 进一步的，在一些实施方案中，本发明所述培养方法每隔2-3天补液一次。
[0018] 其中，每次补液添加 X-VIV015无血清培养基、径丙基甲基纤维素溶液、化-2、IL- 15、比-21W及CD3单克隆抗体。
[0019] 优选的，每次补液IL-2的终浓度为200-1000U/mL、化-15的终浓度为200-1000U/ mL、化-21的终浓度为200-1000U/mL、CD3单克隆抗体的终浓度为100-100011/1^;径丙基甲基 纤维素的终浓度为0.8wt %-6wt %，粘度为20Mpa. s-50Mpa. S。
[0020] 在一些优选实施方案中，本发明所述的培养方法从第Ξ次补液开始不添加 IL-21 和CD3单克隆抗体。即从第Ξ次补液开始只添加 X-VIV015无血清培养基、径丙基甲基纤维素 溶液、比-2和比-15。化-2的终浓度为200-1000U/mL、比-15的终浓度为200-100011/1^;径丙 基甲基纤维素的终浓度为0.8wt %-6wt %，粘度为20Mpa. s-50Mpa. S。
[0021] 本发明所述培养方法中所述径丙基甲基纤维素溶液可W由通过商业渠道购买的 径丙基甲基纤维素加水配制而成。
[0022] 在一些实施方案中，所述径丙基甲基纤维素溶液的制备方法为70-75Γ热水溶解 径丙基甲基纤维素冷却至室溫，配制质量浓度为8 % -20 %，粘度40Mpa. s-lOOMpa. S的径丙 基甲基纤维素溶液，并调节PH至6.8-7.5。
[0023] 本发明所述培养方法中所述单个核细胞可W由外周血或厮带血分离得到。
[0024] 在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或厮带血加入生理盐水 稀释，缓慢加入到含淋己细胞分离液的离屯、管中，使稀释的血液与淋己细胞分离液分层清 晰，500-800g 罔屯、2〇-30min。
[002引由上述技术方案可知，本发明提供了一种NKT细胞的培养方法，单个核细胞接种X- VIV015无血清培养基，加入径丙基甲基纤维素溶液、比-2、IL-15、IL-21W及CD3单克隆抗体 培养NKT细胞。本发明所述培养方法利用径丙基甲基纤维素的常溫成胶效果，加入径丙基甲 基纤维素溶液，在NKT细胞培养初期建立起培养液的Ξ维结构，使NKT细胞在Ξ维空间内增 殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免NKT细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部， 不能很好的继续增殖。实验结果显示采用本发明所述NKT细胞的培养方法培养NKT细胞，细 胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，可W获得更高纯度的NKT效应细胞，得到的NKT细胞杀 伤效果也明显高于常规的培养方法。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0027] 图1示试验例1各组增殖曲线；
[0028] 图2示试验例1中组2在培养14天时NKT显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
[0029] 图3示试验例1中组5在培养14天时NKT显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
[0030] 图4示试验例1中组2培养的NKT细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；
[0031] 图5示试验例1中组5培养的NKT细胞表面标记物CD3+CD56+表达情况图；
[0032] 图6示试验例1中组巧日组5培养14天后的细胞对K562细胞的杀伤能力检测图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0034] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中所述 径丙基甲基纤维素化PMC)购自山东苏诺克化工有限公司；
[0035] 实施例1:单个核细胞的分离
[0036] 采集外周血20mL，加入lOmL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋己细胞分离液15mL的 离屯、管中，使稀释的血液与淋己细胞分离液分层清晰，500g-800g离屯、力，升降速为0,离屯、 20-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2 X10M"-4X10M"。
[0037] 实施例2、径丙基甲基纤维素溶液的配制
[0038] 取一定量去离子水加热至70°C-75°C，按lOOmL去离子水加入10g-20g径丙基甲基 纤维素，配制质量浓度为8%-20%径丙基甲基纤维素溶液，在磁力揽拌器上溶解，揽拌机转 速3(K)r/min，溶解lOmin，静置消除气泡，冷却至室溫，得到的径丙基甲基纤维素溶液粘度控 制在室溫40Mpa. s-lOOMpa. S，0.1mol/mL的肥1或NaOH溶液调节PH至6.8-7.5，备用。
[0039 ]实施例3、本发明所述NKT细胞的培养方法
[0040] 1、获取单个核细胞(PBMC)2-4X107个，按5-15Xl〇VmL接种X-VIV015无血清培养 基，同时加入径丙基甲基纤维素溶液、比-2、IL-15、化-21W及CD3单克隆抗体培养NKT细胞； 其中，按lOOmL培养液加入HPMC溶液lOmL，维持HPMC质量百分比为1.5-2 %，溶液粘度 20Mpa. s;比-2终浓度为200U/mL，化-15终浓度为200U/mL，比-21终浓度为200U/mL，CD3单克 隆抗体终浓度为1〇〇υ/ιΛ;
[0041] 2、每隔2-3天补液一次，每次补液添加 X-VIV015无血清培养基、径丙基甲基纤维素 溶液、比-2、化-15、化-21W及CD3单克隆抗体;其中，按1 OOmL培养液加入HPMC溶液1 OmL，维 持HPMC质量百分比为1.5-2 %，溶液粘度20Mpa. S;化-2终浓度为200U/