用于监测葡萄糖平衡和氧化应激的新检验方法

用于监测葡萄糖平衡和氧化应激的新检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及诊断和预后检验，具体而言本发明设及基于血小板中解偶联蛋白的 mRNA水平来测定受试对象的代谢状态的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病在全世界正在增多，并且世界卫生组织（World化alth化ganization)认 为糖尿病为流行病水平。在国家之间，W及在同一国家的种族之间，糖尿病的临床表现和进 程通常变化非常大。目前，糖尿病影响了全世界1.51亿人，到2025年估计为3亿人。1型 (膜岛素依赖型糖尿病，IDDM)主要是由于自体免疫介导的膜腺P细胞的破坏，导致膜岛素 的绝对缺陷。其为儿童的第二位最普通的慢性疾病。相反，2型糖尿病灯2DM或T2D;非膜 岛素依赖型糖尿病，NIDDM)表征为膜岛素抵抗和膜岛素分泌不足。该疾病过程还伴有不同 的代谢应答，包含脂肪蓄积的利用增加，导致血液中游离脂肪酸增加，W及形成游离的自由 基和氧化应激增加。
[0003] 不幸的是，目前没有糖尿病的治愈方法。治疗设及控制高血糖症W减轻症状和防 止并发症，同时将高血糖症的发作降至最低。因此，第一治疗目标是在诊断早期达到对血糖 控制的状态。因此，为了调节患者的治疗过程和监测疾病过程进展中患者的状态，需要用于 评价血糖控制状态的检验。
[0004] 目前，通过糖化血红蛋白（血红蛋白Ale或HgbAlc)来评价血糖的控制，所述的糖 化血糖蛋白反映了在之前的2至3个月期间的葡萄糖控制；或者通过在禁食或餐后2小时 中，每日检验葡萄糖的水平来评价血糖的控制，并且血糖的控制通常定义为餐后2小时的 血液葡萄糖低于180mg/化、化Ai。水平<7%。血糖的控制还可W表征为在白天血液葡萄糖 为 80 至 120mg/化(4. 4 至6. 7mmol/L)，在睡觉时为 100 至 140mg/化巧.6 至 7.8mmol/L)。
[0005] 化Ale值反映了患者的长时间（3个月）的血糖控制状态，并且有时与每日葡萄糖 读取值所表示的含义不同。假性升高可W随着肾功能不全（尿素干扰检验）、RBC更新低 下（当缺铁性、缺叶酸性或缺维生素B12性贫血）、高剂量的阿司匹林和高的血液酒精浓度 而发生。假性正常值在RBC更新升高时发生，而RBC更新升高在溶血性贫血和血红蛋白病 (例如化S、化C)或者在缺陷性贫血的治疗过程中发生。
[0006] 解偶联蛋白扣(P)为属于线粒体阴离子载体亚家族的同源蛋白。UCP将氧化代谢 与ATP合成解偶联，并通过热释放能量，因此，在生热作用中起重要作用。到目前为止，已经 识别5种蛋白并且它们停留在不同的组织中。
[0007] 在褐色脂肪组织中发现UCP1，并且报告其通过在低溫情况下增加热生产而在晒齿 动物和大型哺乳动物（包含人类）新生儿的能量动态平衡中起重要作用。此外，发现UCP1 还由过量饮食而诱导。
[0008]UCP2和UCP3是位于人类染色体11上与肥胖和糖尿病基因相连的基因座处的、相 邻基因的产物，并且它们均在成人中表达。UCP2mRNA是广泛表达的，并且其在白色脂肪组 织、脾脏、肺、肠和膜腺P细胞中为高水平，而UCP2蛋白在较少的组织中检测。UCP3mRNA 在骨骼肌中强烈表达，而在屯、脏、白色和褐色脂肪组织中较少表达。UCP4存在于脑中，UCP5 的mRNA存在于脑和肝脏中。UCP1和UCP3与UCP1的同源性（分别为55%和57% )得到 W下假设：它们的每一种都具有特异性的质子/阴离子载体功能。目前的假说提出了UPC2 和UCP3的多个生理功能，例如：1)减少活性氧物质的产生并针对氧化应激提供保护，其中 所述的保护在减少电子传递链释放的ROS中起重要的作用；2)设及脂肪酸的处理和/或运 送；3)在膜腺P细胞中的信号传递作用，其中其减少了葡萄糖诱导的膜岛素的分泌；W及 4)特别对于UCP3而言，生热作用。
[0009] -系列研究显示UCP基因的多态性与脂肪代谢、肥胖和糖尿病有关。在大量 的遗传学研究中，UCP2基因座与T2DM或肥胖的易感性之间的关系已经表明。例如发 现-866G/A多态性有助于膜岛素分泌的生物学改变，由此有助于T2DM的易感性（Marmontel etal. ,2011；Emreetal. , 2010；Maillouxetal. ,2011；Jiaetal. , 2009；Azzuet al. ,2010) 〇
[0010]US2002127600设及人类UCP2、它们的组合物及其使用方法。公开了用于诊断体重 素乱的方法，该方法包含检测患者样品中具有特定序列的UCP2多肤或mRNA的水平。
[0011]US2003036646设及新的人类解偶联多肤和分离的核酸、它们的组合物及其使用方 法，其中所述的核酸包含编码所述的多肤的基因的编码区。此外，还公开了诊断受试对象中 的病理状态或对病理状态的易感性的方法，其包含：测定所公开的多核巧酸中的突变的存 在或缺乏情况；W及基于所述的突变的存在或缺乏情况或者所述的多肤的表达的存在或量 来诊断病理状态或对病理状态的易感性。
[0012] US2011263447设及诊断或风险评估危险性个体中的T2D的体外方法，该方法包含 测定至少2种T2D标志物基因（选自50多种标志物，尤其包含UCP2)在由所述的个体取得 的生物学样品中的表达水平；W及利用所述的T2D基因的表达水平图谱来诊断所述的个体 对T2D的易感性。
[0013] 本领域均没有公开或表明使用单一的标志物来评价糖尿病患者的短期血糖控制 状态W及他们的氧化应激状态。代谢疾病的诊断检验（其基于测定分离血小板中分析物的 存在情况）均未批准用于临床用途。就评价受到糖尿病折磨的患者的代谢状态或者其他状 况的检验而言，仍是未满足的医疗需要，其中在所述的其他状况中结果或预后与平衡的血 液葡萄糖、活性氧物质（R0巧和/或游离脂肪酸（FFA)水平有关。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明设及诊断和预后检验，具体而言本发明设及测定受试对象的代谢状态的方 法。更具体而言，本发明提供了检验和方法，其包含测定特别是受试对象的血小板中街偶联 蛋白2扣CP2)的mRNA的水平。本发明用于测定或调节与失衡的代谢状态有关的状态的治 疗，其中所述的失衡的代谢状态可通过异常的血液葡萄糖、活性氧物质（R0巧和/或游离脂 肪酸（FFA)水平来表明。在特定的实施方案中，本发明的检验和方法用于预后和监测被诊 断为糖尿病、特别是II型糖尿病的受试对象。
[0016] 本发明部分基于W下惊人的发现：UCP2mRNA的水平特别在非平衡的糖尿病患者 的血小板中升高，并在治疗后降低至与健康受试对象相当的水平。相反，UCP2的蛋白水平 在平衡的或非平衡的糖尿病患者或由健康的受试对象中分离的血小板中没有不同。
[0017] 本发明进一步部分地基于W下W外的发现：在治疗的整个过程中，血小板 UCP2mRNA与糖尿病受试对象的代谢状态有关；UCP2mRNA的减少可W由治疗开始的2周时检 巧。到，而糖化血红蛋白（血红蛋白Ale或HgbAlc)的减少仅可W由治疗开始的几个月时检 测到。因此，在此证明血小板UCP2mRNA为敏感的标志物，其在监测和早期调节治疗方式W 及单个患者的定量给药方案的治疗中是有利的。
[0018] 在某些方面中，本发明设及用于测定受试对象（例如糖尿病受试对象）的血小板 控制的方法和检验。在其他方面中，本发明设及用于测定受试对象的代谢状态的方法和检 验，其中所述的受试对象为患有慢性或代谢素乱的受试对象，其中在所述的慢性或代谢素 乱中，结果或预后与平衡的血液葡萄糖、活性氧物质（R0巧和/或游离脂肪酸（FFA)水平有 关。在另一个方面中，本发明设及用于监测、预后或测定对受试对象的治疗的适用性的方法 和检验，其中所述的受试对象例如为糖尿病受试对象或受到上文所述的慢性或代谢素乱的 折磨的受试对象。
[0019] 本发明的方法和检验包含测定特别是所述的受试对象的血小板中的解偶联蛋白 2扣CP2)的mRNA水平（或用于测定所述的mRNA水平的手段）。
[0020] 因此，根据本发明的第一个方面，提供了用于测定受试对象的血糖控制状态的方 法，其包含测定特别是所述的受试对象的血小板中的UCP2mRNA的水平。根据一些实施方 案，所述的血小板是至少部分纯化的，或者由其他血液成分分离得到的。在另一个实施方案 中，所述的血小板由得自受试对象的血液样品中分离得到。
[0021] 根据本发明的实施方案，明显高于健康对照受试对象的UCP2mRNA水平的血小板 UCP2mRNA水平表明所述的受试对象的不利的血糖控制状态。不利的或失衡的血糖控制状 态为疾病的病理状态，其通常与餐后2小时的血液葡萄糖超过180mg/化和/或化Ale水平 >7%有关，如下文所述。在一些实施方案中，获得血糖控制（一种有利的血糖控制状态）的 糖尿病患者还可W表征为平衡的氧化状态和正常R0S和/或FFA水平的恢复，如下文所述。
[0022] 由于血小板的寿命为10天并且它们没有核，所队新分离的血小板的mRNA至多反 应测量当天（相当于样品分离）之前10-14天的状态；通常，血小板中的mRNA反应了测量 之前5-7天的代谢状态。因此，根据本发明，本发明的方法和检验用于测定之前5-14天内 所述的受试对象的血糖控制状态。在其他的实施方案中，所述的方法和检验用于测定分离 血小板之前5-7天内所述的受试对象的血糖控制状态。
[0023] 在另一个实施方案中，受试对象受到糖尿病的折磨。在具体的实施方案中，所述的 受试对象受到II型糖尿病的折磨。
[0024] 在另一个实施方案中，所述的方法进一步包含评估受试对象的代谢状态，其中明 显高于健康对照受试对象的UCP2mRNA水平的血小板UCP2mRNA水平表明所述的受试对象的 不利的代谢状态。
[0025] 在另一个方面中，本发明提供了用于测定受试对象的代谢状态的方法，其包含测 定特别是所述的受试对象的血小板中的UCP2mRNA的水平。根据一些实施方案，所述的血小 板由其他血液成分分离得到。在另一个实施方案中，所述的血小板由得自受试对象的血液 样品中分离得到。
[0026] 在另一个实施方案中，明显高于健康对照受试对象的UCP2mRNA水平的血小板 UCP2mRNA水平表明所述的受试对象的不利的代谢状态。
[0027] 在一些实施方案中，所述的受试对象受到慢性素乱的折磨，其中所述的慢性素乱 与异常或升高的血液葡萄糖、ROS或FFA水平有关。在其他的实施方案中，所述的素乱选自 糖尿病、营养失调、慢性炎性疾病和内分泌疾病。例如所述的素乱可W选自II型糖尿病、I 型糖尿病、神经性厌食、肥胖、X综合征、脈毒病、炎性肠病（I抓)、类风湿性关节炎（RA)、慢 性阻塞性肺病（C0PD)、淋己瘤性甲状腺肿和Graves病。在具体的实施方案中，所述的素乱 为II型糖尿病。
[0028] 在另一个实施方案中，所述的素乱为II型糖尿病，并且所述的方法进一步包含测 定受试对象的血糖控制状态，其中明显高于健康对照受试对象的UCP2mRNA水平的血小板 UCP2mRNA水平表明所述的受试对象的不利的代谢状态。
[0029] 例如本发明的方法和检验可W通过使用包含W下步骤的方法来实施：
[0030]a)由受试对象获得血小板（例如由所述的受试对象的血液样品）；
[0031]b)测定血小板中UCP2mRNA的水平；
[0032] C)将UCP2mRNA的水平与对照血小板UCP2mRNA(例如健康对照受试对象的血小板 中的水平，由一组个体得到的一组对照样品的水平，由对照个体得到的一组储存的数据，或 者之前由疾病平衡状态期间的同一受试对象得到的样品中的水平）的水平比较；
[0033] 其中与对照水平相比明显升高（对于本领域的任一技术人员而言具有统计学意 义或显著的）的UCP2mRNA的水平表明所述的受试对象具有不利的或失衡的血糖控制或代 谢状态。
[0034] 本发明的方法可W进一步包含评价或选择用于所述的受试对象的疗法的步骤。例 如与对照水平相比明显升高的血小板UCP2mRNA的水平（例如在5-7天后，或者在其他实施 方案中为治疗开始的5-14天）表明所述的治疗不适用于所述的受试对象。
[0035] 在另一个方面中，提供了用于评价给予有需要的受试对象的素乱的、治疗的方 法，其中所述的受试对象接受针对所述的素乱的治疗，并且其中与健康对照受试对象的 UCP2mRNA水平相比明显升高的血小板UCP2mRNA的水平表面所述的治疗不适用于所述的受 试对象。
[0036] 在一个实施方案中，所述的方法用于在所述的治疗开始的2-16周内评价所述的 治疗。在另一个实施方案中，所述的受试对象受到慢性素乱，该慢性素乱与升高的或异常 的血液葡萄糖、R0S或FFA水平有关，其中所述的慢性素乱选自糖尿病、营养失调、慢性炎性 疾病和内分泌疾病。在另一个实施方案中，所述的素乱选自II型糖尿病、I型糖尿病、神经 性厌食、肥胖、X综合征、脈毒病、炎性肠病（I抓)、类风湿性关节炎（RA)、慢性阻塞性肺病 (C0PD)、淋己瘤性甲状腺肿和Graves病。在具体的实施方案中，所述的素乱为II型糖尿病。
[0037]巧憶、现慢或定量UCP2mRNA或UCP2蛋白的水平可W通过本领域多种公知的方法 来实施。例如本发明的方法和检验可W包含但不限于使用RT-PCR、实时RT-PCR、寡核巧酸 微阵列或No;rthe;rn印迹。
[003引在另一个方面中，提供了试剂盒（或检验），其包含用于测定UCP2mRNA的水平的 手段W及W下的至少一种：i)用于由样品分离血小板的手段；W及ii)用于测定UCP2mRNA 在分离的血小板中的水平的操作指南。所述的试剂盒可W可任选地进一步包含用于将 UCP2mRNA的水平与健康对照受试对象的水平相比较的对照样品或数据。
[0039] 在一个实施方案中，所述的试剂盒包含用于测定由患者分离得到的血小板中的 UCP2mRNA水平的操作指南，其中所述的患者受到II型糖尿病、I型糖尿病、神经性厌食、月己 胖、X综合征、脈毒病、炎性肠病（I抓)、类风湿性关节炎（RA)、慢性阻塞性肺病（COPD)、淋 己瘤性甲状腺肿和Graves病的折磨。在另一个实施方案中，所述的操作指南表明明显高于 健康对照受试对象的UCP2mRNA水平的血小板UCP2mRNA水平表明了所述的受试对象的不 利的代谢状态。在另一个实施方案中，所述的操作指南表明明显高于健康对照受试对象的 UCP2mRNA水平的血小板UCP2mRNA水平表明了所述的受试对象的不利的血糖控制。
[0040] 在另一个实施方案中，测定UCP2mRNA的水平是通过选自W下的方法来实施的：逆 转录聚合酶链式反应（RT-PCR)、实时RT-PCR、寡核巧酸微阵列和Nodhern印迹。
[0041] 由W下描述和附图，本发明的其他目标、特征和优点将变得显而易见。
[0042] 附图简述
[0043] 图1描绘了健康受试对象、非平衡的糖尿病受试对象和平衡的糖尿病受试对象的 血小板中的UCP2mRNA水平。
[0044] 图2证明在获得血糖控制之前和之后，糖尿病受试对象的血小板中的UCP2mRNA水 平。