用于治疗癌症的t-型钙通道抑制剂的制作方法
【专利说明】用于治疗癌症的T-型巧通道抑制剂
[0001] 巧关申请的香叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月10日提交的美国临时申请号61/751，038的权益，其整个 公开内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容设及治疗上有用的化合物、治疗方法和鉴定治疗上有用的化合物的方 法。
【背景技术】
[0004] 在细胞周期的不同点的Ca2+流入对于进展而言是关键性的，尽管化2+借W起作用 的精确角色和途径仍然是主要难W捉摸的。最近，已经可能整合形成一条运样的途径I'2,即 Ca2+流入在实现穿过G1/S转变或限制点（细胞周期进展中的一个生长因子驱动的单向步 骤）中的作用。G1/S转变的作用是整合来自许多基础细胞输入的信息，包括生长因子信号 传递和营养物可用性。该限制点是对于癌症表型而言是中屯、性的，因为在G1至S转变中许 多关键蛋白中的遗传变化或表现遗传变化可能允许细胞独立于促有丝分裂刺激而增生3。 大量努力已经聚焦于祀向细胞周期激酶来抑制细胞周期中的G1/S和其它转变点的调节异 常3。但是，Ca2+流入是G1/S限制点之后的、生长因子驱动的转变的途径的一个中屯、元件， 没有研究能够鉴定对该事件的获得性独立一一可能因为与从限制释放成为一体的Ca2+依 赖性的过程的数目。
[0005] 巧是许多细胞过程的关键性调节剂，且因此，它的流入受到严格控制。W非常一般 的方式，该调节可W是电调节或生化调节。电控制是运些要描述的调节机制中的第一种， 并且在化dgkin和化xl巧的先驱工作中进行了描述化uxl巧和化dgkin，J.化ysiol. 1 : 424-544(1952)。在该调节形式中，Ca2+通道被打开W接纳化2+，并随后响应于膜电位的变化 而关闭。该"口控"的细节可W被生化事件（诸如蛋白激酶A的活化4或巧调蛋白5)改变， 但是主要的调节事件是膜电位的改变，最特别是动作电位的改变。
[0006] 细胞内巧调节是调节细胞周期转变和细胞调亡的多个信号传递途径的重要元件。 癌细胞能够进展穿过细胞周期和绕过正常的巧介导的检验点，从而指示癌细胞已经发展出 替代机制来调节细胞内巧。癌细胞表达T-型巧通道的新证据提示，运些通道在检验点非依 赖性的细胞周期进展和细胞增生中起作用（TaylorJT等人，WorldJ.Gastroenterol. 14: 4984-4991,2008)〇
[0007] 浓度高于细胞外部的带正电荷的离子（诸如钢、钟和巧离子）在细胞内空间中的 存在会建立膜电位。细胞中的膜电位通常是在-40mV至-80mV的范围内。在电可兴奋的细 胞诸如神经元中，主要存在2个膜电位水平：静息（非激活的）电位和较高的阔电位。在神 经元中，静息电位是约-70毫伏（mV)，且阔电位是约-55mV。神经元的突触刺激会造成膜电 位除极化（升高）或超极化（下降）。动作电位是细胞的电学膜电位的短暂"波峰"。当足 够的除极化积累W使膜电位达到阔值时，触发动作电位。
[0008] 尽管所有细胞都具有膜电位，大多数细胞不具有分子机制或细胞几何形状来产生 动作电位。尽管如此，所有细胞使用细胞溶质Ca2+的增加来调节过程诸如分泌或细胞分裂。 认为运些细胞通过内部ca2ie存库（在所谓的电容性的化2+输入中6)的消耗而启动化2+ 流入。但是，该机制可能在细胞分裂过程中不起作用，且如果运样的话，它与癌症生物学或 治疗无关 7。已经引入关于电容途径的组分的参与的复杂模型来暗示它们参与调节对于细 胞分裂而言至关重要的必需Ca2+流入7,但是该途径在细胞分裂中的作用仍然不明。已经提 出许多离子通道作为Ca2+在其中穿过W实现G1/S转变的分子途径8,尽管尚未达成W下一 致意见：单个途径在细胞谱系（不仅仅是细胞系）中是占优势的。
[0009] 已经积累了描述Ca2+通道在电可兴奋的细胞中的调节的证据。也有证据描绘了 Ca2+输入在电不可兴奋细胞中的调节，但是运不可能解释细胞分裂所需的化2+的输入和穿 过G1/S边界。然后，在癌细胞和干细胞中表达T-型Ca2+通道，但是其是电压口控的。因为 大多数类型的癌细胞和干细胞不具有被认为调节运样的电压口控通道所必需的动作电位， 关于运些通道的功能或调节知之甚少。
【发明内容】
阳010] 本公开内容提供了化合物，当细胞膜电位是约-90mV时，所述化合物抑制细胞中 的T-型Ca2+通道活性。优选的化合物在约-90mV的膜电位W10yM或更小的1C5。抑制T-型Ca2+通道活性。优选的化合物对于在约-90mV的膜电位抑制T-型化2+通道活性而言 也是选择性的，且表现出在约-90mV的T-型Ca2+通道活性抑制相对于在约-30至-60mV的 T-型Ca2+通道活性抑制为10 : 1或更小的选择性。运样的化合物可用于阻止细胞增生， 且可W阻止癌细胞和其它寶生性细胞的增生，同时几乎不表现出或不表现出神经元活性的 抑制。
[0011] 本公开内容进一步提供了通过施用有效量的如上所述的化合物来抑制癌细胞的 增生的方法，当细胞膜电位是约-90mv时，所述化合物抑制细胞中的T-型Ca2+通道活性。 所述癌细胞可W是任何癌细胞，诸如上皮癌细胞或癌干细胞。在某些实施方案中，施用的化 合物是米贝拉地尔或TH-1177。
[0012] 本公开内容也提供了通过给需要癌症治疗的受试者施用有效量的如上所述的化 合物来治疗癌症的方法，当细胞膜电位是约-90mV时，所述化合物抑制细胞中的T-型Ca2+ 通道活性。所述癌症可W是任何癌症，诸如上皮癌。在某些实施方案中，施用的化合物是米 贝拉地尔或TH-1177。在另一个实施方案中，所述受试者是人。
[0013] 本文中还公开了用于治疗癌症的药物组合物，其至少含有本文中公开的化合物。
[0014] 本公开内容进一步提供了鉴定化合物的方法，当细胞膜电位是约-90mv时，所述 化合物抑制细胞中的T-型Ca2+通道活性。运些方法包括，确定当将细胞膜电位保持在 约-90mV时化合物的抑制细胞中的T-型Ca2+通道活性的能力。通过本领域已知的技术，诸 如膜片箱技术，可W将膜电位保持在约-90mV。例如，通过确定化合物的阻止生长因子刺激 的巧向细胞中的输入的能力，可W确定当细胞膜电位是约-90mV时化合物的抑制细胞中的 T-型Ca2+通道活性的能力。通过测量细胞内巧水平的增加，诸如通过使用巧敏感的巧光染 料，可W确定巧向细胞中的输入。
[0015] 本公开内容也提供了一种用于鉴定化合物的方法，所述化合物用于抑制细胞周期 进展穿过Gl/S检查点、抑制细胞增生性疾病中的细胞增生、和/或增强福射和/或化学治 疗剂在治疗细胞增生性疾病中的效力。所述方法包括，当将细胞的第一细胞膜电位保持在 约-70mV至约-1lOmV范围内的电位时，确定所述化合物抑制细胞中的T-型Ca2+通道活性； 和，基于所述确定，鉴定应用于抑制细胞周期进展穿过G1/S检查点、在细胞增生性疾病中 抑制细胞增生、和/或增强福射和/或化学治疗剂在治疗细胞增生性疾病中的效力的化合 物。
[0016] 在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从所述描述 和附图W及从权利要求书会明白本发明的其它特征、目的和优点。
【附图说明】
[0017] 图1是将生长因子受体活化的Ca2+与导致穿过G1/S限制点的生化级联连接的途 径之一的示意图。 阳〇1引图2是生长因子调节的T-型Ca2+通道的活化的步骤的简图表示。[化21i是细胞 内的Ca2+浓度，且II)是膜电位。
【具体实施方式】
[0019] 在本公开内容中，应当理解，为了清楚起见在单独实施方案的背景下描述的本发 明的某些特征还可W在单个实施方案中组合地提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的 背景下描述的本发明的多个特征还可W单独地或W任意合适的子组合提供。
[0020] 本公开内容提供了癌症和肿瘤或增生性疾病的治疗，其包括抑制T-型Ca2+通道。 发明人已经确定，抑制T-型Ca2+通道活性，特别是通过当细胞膜电位是约-90mV时抑制细 胞中的T-型Ca2+通道活性，可W阻止肿瘤疾病的进展和治疗癌症。
[0021] 本发明设及下述发现：通过抑制在特定膜电位时的应答性来抑制电压口控的 T-型Ca2+通道，可用于治疗肿瘤或癌细胞增生。不同于典型的化疗剂，在约-90mV的膜电 位选择性地抑制T-型Ca2+通道活性的括抗剂可W阻止癌细胞的增生，并且对免疫系统功能 具有有限的影响或没有影响。因此，运样的括抗剂的施用在本文中被表示为癌症的治疗。
[0022] 阻断T型巧通道的化合物可W表现出神经元样活性（其可W用于治疗疼痛、癒痛 等）、抗增生性活性（其可W用于治疗癌症等）或偶尔表现出两种活性。存在几种可能性来 解释阻断T型巧通道的化合物的行为的差异，诸如神经元和增生细胞中的T-型通道之间的 通道（例如，翻译后修饰）的电位差异。其他人已经提示，抗增生化合物在T-型巧通道处 的活性是非主要的且与抗增生机制无关；抗增生机制完全是不同的祀标。
[0023] 发明人已经发现，当将细胞电位保持在-90mV时，有效的抗增生化合物会W小于 约lOmM的ICs。值阻断T-型通道。当电位是-40mV时W高效能阻断穿过T型巧通道的巧 输入的化合物在神经元疾病中是有效的。表现出对于抗增生活性的选择性的化合物优选 地是，具有< 10的在-90mV状态的ICg。值相对应在-40mV状态的1CW值的化合物（即，在 约-90mV的ICs。值是在-40mV的1C5。值的10倍或更小）。
[0024] 米贝拉地尔优先阻断-90mV状态，且是抗增生性的。在本文中将具有不同骨架的 其它抗增生化合物ni-1170和氯赃莫齐（chlopimozide)鉴定为表现出类似的选择性。表 现出有效神经元活性且没有抗增生活性的其它化合物（例如，TTA-A2和MK-8998)表现出 降低的在-90mV相对于在-40mV的选择性。因此，本公开内容包括鉴定当细胞膜电位是 约-90mV时抑制细胞中的T-型Ca2+通道活性的化合物的方法，W及通过使用该实验方案或 它的明显外延鉴定出抗增生活性的任何化合物。
[00对 "T-型巧通道"或"T-型Ca2+通道"是低电压活化的离子通道，其具有W下物质的 类型的Ca2+选择性的a1亚基，或具有与W下物质类似的活性和/或氨基酸序列同一性： 由CACNA1G基因编码的化v3. 1，由CACNA1H基因编码的化v3. 2，或由CACNA11基因编码 的化v3. 3。在一个实施方案中，所述T-型Ca2+通道具有由CACNA1H基因编码的a1亚基 Cav3. 20
[0026] 本文中使用的"抑制"表示活性的减小或阻止。
[0027]"括抗剂"或"抑制剂"会抑制活性或功能。例如，化合物可W如下充当括抗剂或抑 制剂：抑制、减小或消除蛋白表达，或阻止蛋白活性，或阻止蛋白与其它蛋白的相互作用，导 致蛋白介导的功能或信号传递的抑制。括抗剂/抑制剂化合物的例子包括抑制T-型化2+ 通道活性的肤、多肤、蛋白、抗体、反义寡核巧酸、RNAi/siRNA、小分子、化学治疗剂、及其片 段、衍生物和类似物。在一个实施例中，当细胞膜电位是约-90mV时，所述化合物W小于约 lOiiM的半数最大抑制浓度（ICJ抑制T-型Ca2+通道活性。在另一个实施例中，与当细胞 膜电位是约-30至-60mV时化合物抑制T-型Ca2+通道活性的选择性相比，当细胞膜电位是 约-90mV时化合物抑制T-型Ca2+通道活性的选择性是1 : 10或更小。
[0028] 当细胞膜电位是约-90mV时，本发明的示例性化合物W小于约10yM的半数最大 抑制浓度（ICJ抑制T-型Ca2+通道活性。1C5。是化合物的抑制生物活性的有效性的量度。 确定化合物的ICe。的方法是本领域已知的，且包括功能性括抗剂测定（例如使用剂量响应 曲线）或竞争结合测定（其测量例如化合物的从祀分子置换已知结合配偶体的能力）。
[0029] 通过本发明可W抑制的T-型化2+通道的活性包括、但不限于：细胞的巧摄取；细 胞内巧水平的调节和/或介导；细胞内窗电流的调节和/或介导；巧信号传递途径的、巧介 导的信号传递和/或调节；实现穿过G1/S转变或限制点的通道；实现细胞周期进展；启动 和/或维持细胞生长和增生，特别是过度的或不希望的增生；启动和/或维持瘤形成和/或 肿瘤生长；和启动和/或维持血管生成和/或转移。
[0030] 发明人已经发现，当细胞膜电位是约-90mv时抑制细胞中的T-型化2+通道活性， 可W优先抑制不希望的细胞增生，诸如癌细胞增生。
[0031] 本文中使用的术语"约"和"大约"指示，值包括固有变异（其例如基于用于确定 所述值的方法）或天然存在的变异（诸如在单个细胞中发现的静息或膜电位的变异，或在 不同细胞之间发现的静息或膜电位的变异）。在一个非限制性的实施方案中，将该术语定 义为在10%W内，在5%w内，在1%W内，或在0. 5%w内。类似地，"约-90mV"的膜电 位可W包括在-80mV至-lOOmV的测量范围内、或在-85mV至-95mV的范围内、或在-89mV 至-91mV的范围内的膜电位。在另一个实施例中，"约-30至-60mV"的膜电位可W包括 在-20mV至-70mV的范围内、或在-25mV至-65mV的范围内的膜电化且也包括膜电位范围 诸如约-30mV至-40mV、约-30mV至-50mV、约-30mV至-70mV