专利名称：：一种与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用的制作方法一种与肿瘤易感性相关的苷酸多态性位点及其应用
技术领域：
：本发明涉及一个与肿瘤易感性相关的苷酸多态性位点及其应用，属于生命科^^:领域。背景駄肿瘤的^fe涉及环境、遗传、生活饮食习惯等多种因氣具体到正常细胞转化为癌细胞的过程，又与癌基因的歡活、抑癌基因的失活、细胞凋亡、细鹏期、信号转导、DNA修复^基因的突^w关。随着各种^生物学s^的成熟，研究人员己发现了大量与肿瘤s^m^相关的基因。基因在决定个体表型方面皿决定性作用，i!31赋予个体对疾病的易感性或皿力，以及影响机,环境因素的相互作用，基因对疾病的a^着间接皿接作用。最近大量的研究表明细胞端粒酶激活是多数恶魁中瘤发生的先决条件。端粒酶在恶'翻中瘤组织汲相落细胞中检出率很高，由于端丰魏短和端粒酶无活性，体细M常逐,老死亡。仅有极少数细胞偶然ffl3i撒活端粒酶而M,性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会，导miS行性肿瘤性发展[2]。在大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高7]C平表达[3]。表明纟辭立酶的激活敏与细胞的无限增歹節密切絲，M^除细臓^31程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是体细胞向肿瘤转化的，步骤。机体对各种慢性损伤的抗争能力是有明显个体差异的。誠差异的遗传物质基te—就矿泛雜于基因中的SNPs。SNPs的存在并不直髓鹏胞的癌，中瘤的发生，但可能会赋予个体对某种特殊的环境因素易感。例如p53基因是，的细胞周期、凋亡调节基因，皿，键位点的突顿以直J魏成细胞增殖的异常。而在p53基因非热点区，如72位密码子的点突变(C《)会造成编码氨基酸的改变(Pro—Arg)。这种多态性在自然人群中有一定的分布，并不直麟成细胞的癌变。因此在本发明中选择TERT基因作为所研究的基因。同时选择TERT基因上的SNP位点为所研究的方向。
发明内容本发明的目的^IM"^f立酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)基因上的单^^酸多态性位点rs2736098谢辦异性的研究，提出一个可作为在判定肿瘤易感人群的方法中应用的易感SNP位点，以利于指导肿瘤的预防和治疗。本发明所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，，苷,列如序列^0f示，皿428位为A。所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因上的靴苷酸多态性位点，MlNCBIim库，按常规方、織得，该基因餅列长度为41878bp的TERT基因；该基因的一糊苷酸多态性是rs2736098,rs2736098位于2号外显子；rs2736098碱基为G突变为A;rs2736098的SNP序列，为CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。获得rs2736098SNP序列的具体步骤如下MMhttp:〃丽.ncbi.nlm.gov/snp繊库，在TERT基因J^择報苷酸多态性rs2736098;依据相应的碱基序列合成引物5'—CGMGAAGCCACCTCTTTGGA—3'和5,—MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3';PCR反应体系25(4:2.5|410XTaqBuffer，2Ml2.5mMdNTP，1|410mMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用(1(20补足25|4;PCR鹏^f牛94。C8min;94。C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35个循环；72°C10min;扩增，为168bp，用2%的琼月旨糖凝胶电泳，溴化乙,色检测(见图l)。戶舰的与肿瘤易感性相关的TERT基因序歹啲应用，fflim取^^基因组DNA进行雜苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098鹏为A的个体为肿瘤的易感人群。本发明的储和积极鄉本发明的研究结果表明TERT基因劍中瘤相关的易感基因，rs2736098自为A的个体肿瘤易感性高，该對亥苷酸多态性位点可作为在判定肿瘤的易感人群的方法。图1是显示多态性位点rs2736098的序列扩增图，其中，M为DNA舒量标准，1为PCR，。具條Jfc^实施例1.51取^#基因组DNA进行TO苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098碱基为A的个体为肿瘤的易感人群。具体作腿-1.基因组DNA的提取Si^^J由夕卜周静脉抽她2-3ml，翻酚氯份鹏取其基因组DNA，-70。C保存。2.PCR扩增目的片断用以下引物5'—CGMGMGCCACCTCTTTGGA—3'禾口'一AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3'。PCR反应体系(25Pl):10XTaqBuffer，2rt2.5mMdNTP，lOmMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20补足。PCR鹏^f牛94。C8min;94。C40sec，57。C30sec，72。Clmin(35个循环)；72。C10min。扩增^为168bp，用2%的琼月|^繊电泳，溴化乙锭^fe检测(见图1)。3.基因分型采用点杂交的方法进行基因分型。具#^、法如下将合成的寡核^W1E自同浓度点^M;W±，敏紫夕卜3min使样品与辭固结合，鹏4。C备用。杂交袋(内含芯片一张)加300ul杂交液(注意^St到膜，将气、舰走)然后将杂交翻封口丰旭寸好，在45。C斜牛下杂交30min。取PCR产物5-10ul，在10(TC7K浴中变性5min，立即冰浴5min。将，交^M^交箱中取出，将杂魏剪^f斗口，轻^f到出予赚交液，辦300ul杂交液与变性探针一起加到杂交袋中，赶走气泡将杂^if好，放到杂交箱中，45'C杂^1夜。将杂，中的芯片取出，室温下用2XSSC/0.1%SDS洗两次，每次2min。然后用0.2XSSC/0.1%SDS，42。C下洗两次，每次3min。TNT溶液洗5min。将芯片平方JtA干净的塑料袋中，力口入10X封闭液20iU，TN180ul，混匀，37。C30min。塑料袋中的封闭液，然后加入新的10X封闭液20ul、TN180ul、P0D抗体0.3ul，轻轻混匀，37°C30min。将芯片从袋中取出，TNT漂洗3次，每次3min。将膜^A干净塑料袋中，取DAB显色液6P1，DAB繊液6u1、双蒸7jC288y1，混匀后，立即加A^中，待显fe^i通想^i^(一MM色10併中左右)，用1XPBS终lh&应。4.结果判定rs2736098MS为A的个体为肿瘤易感人群。r~s2736098M为G的个体为肿瘤非易感人群。^S例2、易ii基因的应用本研究以33例肿瘤患者为研究组，以33例非肿瘤患者为对照组。研^1且和对照组的^#均由夕卜周静l/細血2-3ml，采用酚氯仿鹏取基因组DNA，-7(TC保存。病例-对照组研究结果显示对照组(33人)和研究组(33人)中rs2736098位点基因型M、GG+AG分别为0、1.000和0.152、0.848(表2);TERT基因rs2736098碱基为A的个体肿瘤易感性高。_表2基因型分布与^^基因频率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根据本发明由TERT基因iS突，异性判定肿瘤的易感人群的方法，可对*^测中瘤临床症状的人群进，f^种方法的筛査rs2736098MS为A的个体为肿瘤易感人群。对肿瘤易感人S^曰常生活中鹏量^>诱发因氣可斷划中瘤的发病率。根据本发明，可根据患者的基因型决定€^^@的抛中瘤药物或者采用如基因敲^#因工程方,行有针对性的基因治疗。TERT基因的^S突变，可倉,蛋白质^ii^功能异常。序列表〈110〉南开大学〈120〉一种与肿瘤易感性相关的靴苷酸多态性位点及其应用〈130〉〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉850〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈220〉〈221〉1〈222〉(1)(850)〈400〉1cggacgggggtctgtgtcctcctcctcgggggccgccacagagccctggggcttctcccg60ggcacagacaccggctgctggggtgaccgcagctcgcagcgggcagtgcgtcttgaggag120caccccgtaggggcactgcgcgtggttcccaagcagctccagaaacaggggccgcatttg180ccagtagcgctggggcaggcggggcaacctgcggggagtccctggcatccagggcctgga240acccagaaagatggtctccacgagcctccgagcgccagtcaggctgggcctcagagagct300gagtaggaaggagggccgcagctgctccttgtcgcctgaggagtagaggaagtgcttggt360ctcggcgtacaccgggggacaaggcgtgtcccagggacgtggtggccgcgatgtggatgg420ggggcccgcgtggtgctggcggcccacggatgggtgggagtggcgcgtgcc卿gagcgc480accctccaaagaggtggcttcttcggcgggtctggcaggtgacaccacacagaaaccacg540gccactcggtccacgcgtcctgcccgggtgggcccaggacccctgcccaacgggcgtccg600ctccggctcaggggcagcgccacgcctgggcctcttgggcaacggcagacttcggctggc660actgcccccgcgcctcctcgcacccggggctggcaggcccagggggaccccggcctccct720gacgctatggttccaggcccgttcgcatcccagacgccttcggggtccactagcgtgtgg780cgggggccggggcctgagtggcagcgccgagctggtacagcggcggcccgcacacctggt840aggcgcagct850权利要求1、一种与肿瘤易感性相关的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因部分序列，其核苷酸序列如序列表所示，且第428位为A。2、根据权利要求1所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，辦征在于，所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因上的對雜酸多态性位点，通过NCBI数据库，按常规方法获得，该基因，列长度为41878bp的TERT基因；该基因的一单核苷酸多态性是rs2736098，rs2736098位于2号外显子；rs2736098,为G突变为A;rs2736098的SNP序列为CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。3、根据权利要求2所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列，其特征在于，获得rs2736098SNP序列的具体步骤如下通过http://www.ncbi.nlm.gov/snp数据库，在TERT基因上选择单核苷酸多态性rs2736098;依据相应的liS序列合成弓l物CGMGAAGCCACCTCTTTGGA和MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC;PCR反应体系25μl:25μl10XTaqBuffer，2μl2.5mMdNTP，1μl10mMPrimer,1μlTemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20补足25W;PCR反应件94°C8min;94°C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35个循环；72°C10min;扩增,为168bp，用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭鹏检测。4、一种权利要求1所述的与肿瘤易感性相关的TERT基因序列的应用，其特征在于，通过提取受试者基因组DNA进行单核苷酸多态性rs2736098的基因分型，其中rs2736098自为A的个体为肿瘤的易感人群。全文摘要本发明涉及一种与肿瘤易感性相关的单核苷酸多态性位点及其应用，属生命科学
技术领域：
。本发明的易感基因通过NCBI数据库，按常规方法获得，该易感基因是序列长度为41878bp的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因；所研究的单核苷酸多态性是rs2736098，rs2736098位于2号外显子；rs2736098碱基为G突变为A。该易感基因作为在判定肿瘤的易感人群的方法中的应用。当rs2736098碱基为A个体肿瘤易感性高、rs2736098碱基为G的个体为不易发肿瘤。本发明的TERT基因上的该SNP位点对研究肿瘤易感性及建立基因诊断方法，指导肿瘤预防、开发新型治疗肿瘤的药物具有重要作用。文档编号C12N15/54GK101200729SQ20071015011公开日2008年6月18日申请日期2007年11月9日优先权日2007年11月9日发明者虹倪,荣向,张朋军,丽梁,影胡,英邢申请人:南开大学