专利名称：：猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
：猪瘟是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的猪的急性、高度致死性、接触性传染病。根据OIE制定的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2008版本规定，该病被列为法定上报的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是威胁我国养猪业的重要传染病之一。在20世纪早期和中期，大量研究人员通过不同方法研制出了猪瘟疫苗中国株(猪瘟兔化弱毒株或猪瘟病毒Chinese株或猪瘟病毒C株)、法国Thiverval株、日本CPE-株三大品系。其中以中国兽医药品监察所研制的C株最好，具有免疫原性强、安全性好、稳定性高的特点，为猪瘟疫苗“金标准”(GoldMandard)，被欧美等许多国家广泛使用，并最终消灭了大多数国家的猪瘟，目前有些国家仍在使用。随着猪瘟在西欧的消灭，这些国家不再进行猪瘟免疫，然而，1997/1998年荷兰猪瘟的爆发以及近年来欧洲野猪猪瘟的散发，导致巨大的经济损失，使得相关国家重新考虑使用疫苗免疫，其中最理想的是能区分免疫和自然(DIVA,DiscriminationofInfectedfromVaccinatedAnimals)白勺贞。目11)1使用疫苗预防猪瘟的国家或地区，想通过净化手段来达到控制消灭猪瘟的目的，但是没有相应的方法能够区分免疫和自然感染，使得猪瘟预防的效果一直不理想，现亟待开发一种DIVA疫苗。猪瘟DIVA疫苗现在已成为研究热点，早在1993年Hulst等(HulstMM,WestraDF,WensvoortG,MoormannRJ.Glycoprotein,EIofhogcholeravirusexpressedininsectcellsprotectsswinefromhogcholera.JVirol1993；67(9):5435-42)石if究了猪瘟病毒E2亚单位疫苗BAYOVAC,2000年AhrensU等(AhrensU,KadenV,DrexlerC,VisserN.Efficacyoftheclassicalswinefever(CSF)markervaccinePorcilisPestiinpregnantsows.VetMicrobiol2000；77(1-2):83-97)研究了猪癌E2亚单位疫苗PorcilisPesti，但这两种疫苗免疫效果不如弱毒疫苗株，因此没有广泛使用。随着生物技术的发展，研究人员开发了不同病毒为载体(如腺病毒，伪狂犬病毒，牛病毒性腹泻/粘膜病病毒)的活载体疫苗(HammondJM,JansenES,MorrissyCJ,etal.Oralandsub-cutaneousvaccinationofcommercialpigswitharecombinantporcineadenovirusexpressingtheclassicalswinefevervirusgp55gene.ArchVirol2001；146(9):1787-93；ReimannI,DepnerK,TrappS,etal.AnavirulentchimericPestiviruswithalteredcelltropismprotectspigsagainstlethalinfectionwithclassicalswinefevervirus.Virology2004；322(1):143-57；RzihaH,HenkelΜ,CottoneR,etal.Generationofrecombinantparapoxviruses:non_essentialgenessuitableforinsertionandexpressionofforeigngenes.JBiotechnol.2000；83(1-2)137-45；PatriciaKoenig,ElkeLange,IlonaReimann,etal.CP7E2alf:AsafeandefficientmarkervaccinestrainfororalimmunisationofwildboaragainstClassicalswinefevervirus(CSFV).Vaccine2007:25(17):3391-3399)，免疫效果可能受到载体的干扰，相比猪瘟兔化弱毒疫苗而言其免疫效果也不理想，生产应用受到限制。另外，研究人员还致力于开发猪瘟病毒基因缺失疫苗(vanGennipHG,BoumaA,vanRijnPA,etal.Experimentalnon-transmissibIemarkervaccinesforclassicalswinefever(CSF)bytrans-complementationofErnsorE2ofCSFV.Vaccine2002；20(11-12)1544-56；FreyCF,Bauhofer0,RuggliN,etal.ClassicalswinefevervirusrepliconparticleslackingtheErnsgene-.apotentialmarkervaccineforintradermalapplication.VetRes2006；37(5):655-70；MaurerR,StettlerP,RuggliN,etal.Oronasalvaccinationwithclassicalswinefevervirus(CSFV)repliconparticleswitheitherpartialorcompletedeletionoftheE2geneinducespartialprotectionagainstlethalchallengewithhighlyvirulentCSFV.Vaccine2005；23(25):3318-28；deSmitAJ,BoumaA,vanGennipHG,etal.Chimeric(marker)C-strainvirusesinduceclinicalprotectionagainstvirulentclassicalswinefevervirus(CSFV)andreducetransmissionofCSFVbetweenvaccinatedpigs.Vaccine2001；19(11-12)1467-76;KortekaasJ,VloetRP,WeerdmeesterK,etal.RationaldesignofaclassicalswinefeverC-strainvaccinevirusthatenablesthedifferentiationbetweeninfectedandvaccinatedanimals.JVirolMethods.2010；163(2):175-85)，如替换、突变或删除Ems、El或E2基因中某些序列，以达到缺失某一种表位或功能区的目的，通过检测相应抗体可区分免疫和自然感染动物，但缺失保护性抗原中的相应部位后，往往导致免疫原性降低，影响免疫效果。2009年L.G.Holinka等(HolinkaLG,Fernandez-Sainz1,0'DonnellV,PraratMV,GladueDP,LuΖ,RisattiGR,BorcaMVDevelopmentofaliveattenuatedantigenicmarkerclassicalswinefevervaccine.Virology.2009:384(1):106-13)以猪癌病毒Brescia株为基础，构建了缺失中和表位WH303，加入Flag标签的双标记疫苗，试验结果表明该毒株对Brescia株攻毒具有较好的保护性，但Brescia株为强毒，具有生物安全隐患，此外该标记疫苗对其它毒株的免疫效果还没确证。本发明以猪瘟兔化弱毒株(C株)全长感染性克隆(邹兴启，赵启祖，范运峰，等.猪瘟病毒C株全长CDNA感染性克隆的构建及病毒拯救.中国农业科学，2011:44(2)409-416)为基础，在El基因中插入一段外源DNA序列，经拯救获得猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒，该毒株不仅同时保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且外源DNA序列的表达产物可诱导动物机体产生特异性抗体，能通过检测外源基因特异性抗体来区分免疫与自然感染，因此可以作为DIVA疫苗用于猪瘟的预防。
发明内容本发明的目的主要是通过构建了猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株感染性克隆，成功拯救并繁殖了病毒，通过动物试验确定病毒可作为能区分免疫和自然感染(DIVA)的疫苗候选毒株，进而制备出DIVA的猪瘟疫苗。(1)该疫苗主要含有猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株，该病毒株含有序列15所述的核苷酸和序列16所述的氨基酸序列的多肽；该病毒毒株已于2011年06月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.4975；(2)该疫苗免疫猪体后，引起高效免疫应答，产生体液免疫可产生序列16所述的氨基酸序列的多肽的特异抗体，通过检测特异性抗体可区分免疫和自然感染。本发明是通过以下技术方案来实现的1.猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建(1)标记蛋白基因的引入是以猪瘟病毒兔化弱毒株全长感染性克隆为载体pAC-CS，插入一段外源DNA序列(序列No.1构建成猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株。(2)猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒的拯救；(3)病毒的繁殖2.以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接入生长良好的SK6、ST和H(15细胞中的任一种传代细胞，按常规细胞活疫苗的制造方法制成猪瘟兔化弱毒标记疫苗；或接种日本大耳白家兔，按照猪瘟脾淋苗的制造方法生产猪瘟兔化弱毒标记疫苗。具体实施方案一、猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建是通过以下技术方案实现的1.猪瘟病毒C株全长感染性克隆的构建(I)RNA提取，反转录，PCR扩增取猪瘟病毒C株作为疫苗生产毒种，由国内生产厂家生产的猪瘟活疫苗商品(保存于中国兽医药品监察所)，加入适量磷酸盐缓冲液稀释至2头份/mL，提取总RNA，反转录，根据发表于Genebank(登录号AY805221)的猪瘟序列设计6对引物(见表1)，将猪瘟C株基因组分6段扩增，分别命名为S1、S2、S3、S4、S5、S6，全部克隆至pMD18-T载体(Takara公司)，选取阳性克隆，提取质粒，分别命名为pSl，pS2，pS3、pS4、pS5、pS6；(2)猪瘟病毒C株5，半长cDNA和3，半长cDNA构建取pSl，pS2质粒同时用NotI/BspDI(NEB公司)双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物(天根生物技术有限公司)，将Sl片段连接至pS2载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为为PS1-S2。将pSl-S2，pS3质粒同时用Notl/Nsil双酶切，琼脂糖回收酶切产物，将S1-S2片段连接至pS3载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为PS1-S2-S3，即为猪瘟病毒C株5’半长cDNA。取pS4，pS5质粒同时用BamHI/Xbal双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，将S4片段连接至pS5载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为PS4-S5。将pS4-S5，pS6质粒同时用BamHI/Hindlll双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物，将S4-S5片段连接至pS6载体中，转化，筛选获得阳性克隆命名为PS4-S5-S6，即为猪瘟病毒C株3，半长cDNA。(3)猪瘟病毒C株全长感染性克隆cDNA的连接将猪瘟病毒5，半长cDNA阳性质粒PS1-S2-S3与本实验室构建的pAC载体同时用Notl/BamHI双酶切，琼脂糖电泳回收S1-S2-S3片段和pAC载体，连接转化，筛选获得阳性克隆pAC-5’CS。将pAC_5’CS和PS4-S5-S6质粒用BamHI/NgoMIV酶切，琼脂糖回收pAC_5，CS载体和S4-S5-S6片段，连接5转化，筛选获得阳性克隆命名为PAC-CS即为猪瘟病毒C株全长感染性克隆(如图1所示)。表1引物表权利要求1.一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗，其特征在于(1)该疫苗主要含有猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株，该病毒株含有序列15所述的核苷酸和序列16所述的氨基酸序列的多肽；该病毒毒株已于2011年06月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.4975；(2)该疫苗免疫猪体后，引起高效免疫应答，产生体液免疫可产生序列16所述的氨基酸序列的多肽的特异抗体，通过检测特异性抗体可区分免疫和自然感染。2.一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建，其特征在于该病毒株的构建主要包括如下步骤(1)标记蛋白基因的引入是以猪瘟病毒兔化弱毒株全长感染性克隆为载体PAC-CS，插入一段外源DNA序列(序列No.1构建成猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株。(2)猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒的拯救；(3)病毒的繁殖3.—种猪瘟兔化弱毒标记疫苗的制备方法，其特征在于以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接入生长良好的SK6、ST和H(15细胞中的任一种传代细胞，按细胞活疫苗的制造方法制备。4.如权利要求3所述的一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗的制备方法，其特征在于以猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株作为疫苗生产毒种，接种日本大耳白家兔，按照猪瘟脾淋苗的制造方法生产猪瘟兔化弱毒标记疫苗。全文摘要本发明涉及一种猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法。包括如下步骤(1)猪瘟兔化弱毒株(C株或Chinese株)全长感染性克隆的构建方法；(2)标记蛋白基因的引入方法；(3)猪瘟兔化弱毒标记疫苗病毒的拯救；(4)病毒的繁殖；(5)病毒液检验；(6)疫苗制造；(7)疫苗成品检验，包括安全检验和效力检验。本发明构建的猪瘟兔化弱毒株标记疫苗，不仅保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高，能用于工业化大生产，免疫猪体后可产生标记蛋白特异性抗体，以此来区分免疫和自然感染，对防控净化猪瘟及紧急免疫都具有重大意义。文档编号C12N7/01GK102221618SQ20111017044公开日2011年10月19日申请日期2011年6月23日优先权日2011年6月23日发明者刘业兵,宁宜宝,徐璐,朱元源,王琴,范学政,赵启祖,邹兴启,韩焘申请人:中国兽医药品监察所