专利名称：来源于棉花的miRNA-GramiRn22及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于棉花的miRNA-Gramifoi22及其应用。
背景技术：
miRNA(microRNA,微小RNA)是一类长度约为20_24nt的内源单链非编码小分子 RNA，在生物体中广泛存在。近年来大量研究表明，miRNA能够调控生物体中许多基因的表达，在调节生长发育、细胞增殖、凋亡、抵御环境胁迫等诸多方面发挥重要作用。植物miRNA 主要通过切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻译，来调控植物个体生长发育并影响其生理过程，是一种新的基因调控模式，具有重要的研究意义。棉花是世界最重要的经济作物之一，同时棉花纤维也是研究单细胞伸长的良好模型。与拟南芥、水稻等模式生物相比，目前已经发现的棉花miRNA数量可谓寥寥无几，因此通过高通量测序技术，有望挖掘出更多的棉花miRNA，这对于全面了解棉花乃至整个植物 miRNA的形成过程、结构特点和功能机制具有现实意义。另外，棉花中miRNA可能在诸多生理过程(如纤维的起始与伸长等)发挥重要功能，但棉花中关于miRNA的生物学功能研究甚少，因此，通过关注特定发育时期、特定组织中的miRNA，有望阐明棉花miRNA参与的生理过程，以及在该过程中具体发挥的作用。我国是世界上主要的棉花生产和消费国，棉花对于我国具有举足轻重的地位。国内外除了利用常规育种手段之外，逐步运用基因工程技术对棉花品质(产量、抗虫等)进行遗传改良已经成为了一种趋势。由于miRNA对植物有广泛的调控作用，很可能成为植物遗传改良的重点研究基因之一，因此迫切需要通过大规模测序方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA基因，从而为后期定向改良和培育优质性状的棉花品种奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于棉花的miRNA-Gramifoi22及其应用。本发明保护的miRNA-Gramifoi22的序列如下(5，一 3，)UAUGAAACU⑶GAUUCCAC⑶CAU (序列表的序列 1)。本发明保护的miRNA-GramiRn22 前体(pre_GramiI n22)序列如下(5，一 3，)AAUGGACUUGUAUGAAACU⑶GAUUCCAC⑶CAUUUUUAUCCCUUUCCUUUAGGAGAAUGACAAAUCAG AUUUUUCCTACU-78nt-AGGAACAACGUGGAAUCACAAUUUCAUACAAUCCUUU。(序列表的序列 2)。本发明还保护序列表的序列1所示RNA和/或序列表的序列2所示RNA在抑制 mRNA前体剪接因子(TC255234)表达中的应用；所述mRNA前体剪接因子如序列表的序列3 所示.所述mRNA前体剪接因子基因具体可如序列表的序列4所示或序列表的序列4自5’ 末端第12至590位核苷酸所示。本发明还保护序列表的序列1所示RNA和/或序列表的序列2所示RNA在促进 mRNA前体剪接因子基因(TC255234)的mRNA降解中的应用；所述mRNA前体剪接因子如序列表的序列3所示.所述mRNA前体剪接因子基因具体可如序列表的序列4所示或序列表的序列4自5’末端第12至590位核苷酸所示。Solexa克服了常规miRNA克隆技术的缺点，具有灵敏度高的优点，能够检测出最少一个小RNA分子，并且准确性高，检出的小RNA分子碱基错误率极低。同时该技术还具有高通量、大规模的特点，两个文库的测序量高达500万条小RNA序列以上。基于这种最新的测序手段，将有望识别棉花中特定发育时期特定组织特异表达的新miRNA。本发明采用国际上先进的Solexa高通量测序技术结合生物信息学分析、 Northern杂交、5，RACE等多种生物学手段，首次从基因组水平鉴定到miRNA-Gramifoi22，并且证实Gramifoi22的靶基因为mRNA前体剪接因子基因，参与了棉花纤维起始及胚珠发育的调控。这都将为棉花的品质育种(如提高棉纤维产量)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终用于实际生产。本发明提供的miRNA广泛参与了棉花多种生命活动的调节，具有重要的生物学意义和潜在应用价值。
图1为小RNA测序数据中分离和鉴定新miRNA的流程图。图2为miRNA-Gramifoi22的前体二级结构图；黑线部分指示成熟miRNA所在的位置。图3为Northern杂交检测开花前3天至开花后3天野生型及突变体棉花胚珠中 miRNA-GramiRn22 的表达。图4为miRNA-Gramifoi22的靶基因5，RACE验证；序列上方的箭头表示发生切割的位点，数值表示该切点处发生切割的克隆数与克隆总数比值。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中所用棉花品种包括陆地棉徐州142 (Gossypium hirsutum cv. Xuzhou 142，以下，简称为野生型)及其无纤维突变体(以下简称为突变体)，棉花种子来源于国家棉花中期库，其中野生型库号为110599，突变体库号为140142。实施例1、棉花样品采集棉花于四月下旬种植于田间，常规作业，开花前一天花苞套袋，防止花粉传播造成异花传粉，开花当天除袋，并挂牌标记。分别收取开花前3天(-3)、开花前1天(-1)、开花当天(0)、开花后1天(1)、开花后3天(3)的棉铃，剖取胚珠，迅速冻存于液氮，保存于_80°C实施例2、miRNA-GramiRn22 的发现1、RNA 提取将实施例1获得的棉花胚珠样品在液氮中研磨，研磨过程中加入PVP (按1/5质量比)以防止酚类氧化，用PureLink Plant RNA Reagent(Invitrogen)提取总RNA，操作步骤如下(以0. Ig材料为例，相应试剂量可根据材料量按比例调整)
①磨好的胚珠粉末加入到Iml提取缓冲液中，加20 μ 1 β -巯基乙醇，混勻后置于室温10-15分钟。4度12000转/分离心5分钟，将上清转至新的离心管，加入100 μ 15Μ NaCl，混勻后加入300 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000转/分离心10分钟，将上清转至新的离心管；②将转出的溶液依次用氯仿、酚、酚氯仿(1 1)、氯仿抽提，经四次抽提后的上清液转入新的离心管，加入100 μ 1多糖去除剂(北京华越洋生物科技有限公司)，混勻后加入200 μ 1氯仿，充分混勻，4度12000转/分离心10分钟，将上清转至新的离心管；③加入等体积的异丙醇，混勻后置-20度1小时以上，4度12000转/分离心10分钟，弃上清，离心得到的沉淀用75%的乙醇洗涤，晾干后溶于适量的DEPC水中。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度计(Amersham Biosciences)测定提取的 RNA在260nm(0D26Q)和280nm(OD28tl)波长的吸光度值以确定RNA的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在1 μ g/ μ 1以上，0D26(1/0D28(1的比值在1. 8-2. 0之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。2、小RNA文库的构建将质量检验合格的棉花胚珠总RNA用于构建小RNA文库。5个不同时期的胚珠样品提取的RNA各取10 μ g等量混合，总共50 μ g用于构建小RNA文库。小RNA文库的构建按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法进行，构建好的文库采用Solexa 高通量测序(北京华大基因研究中心)，获得高质量的18-30nt的小RNA序列。 3、小RNA文库中新的miRNA的鉴定 参考之前国外文献对高通量测序数据分析的成功方法(Jones-Iihoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787-799.)，建立一套计算机分析方法用来发现和鉴定测序数据中的棉花miRNA(分析流程如图1所示)。①将获得的两个小RNA文库中的原始序列通过计算机方法去掉3’接头，并过滤掉序列长度在18nt以下的序列，获得所谓的“干净”序列库；②将“干净”的序列与国际权威的miRNA数据库 miRBase (http //microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)中公布的 miRNA 成熟序列进行 BLAST,从而发现哪些序列来自于已知的miRNA，已知miRNA超过2个错配的序列再进入下一步分析；④将排除了为保守miRNA的序列再与已知的细胞器基因数据库，以及其它非编码RNA数据库，包括拟南芥线粒体DNA(www. arabidopsis. org)，油菜线粒体DNA(NCBI)， 陆地棉质体DNA(NCBI)，植物snRNA及snoRNA (NCBI)，陆地棉及拟南芥rRNA (NCBI)，以及 tRNA(http://gtrnadb. ucsc. edu)进行匹配，从而发现哪些序列来自于细胞器RNA以及其它非编码RNA，过滤掉这些序列，剩下的序列中可能含有新的miRNA，称为潜在miRNA序列库；⑤将潜在miRNA序列库中的序列与已有的棉花数据库进行BLAST，数据库包括棉花 EST (http://compbio. dfci. harvard, edu)、棉花 GSS (NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉 (Gossypium raimondii)的基因组序列。将找到的棉花数据库中对应的序列进行下一步分 / 。
4吏 ffl miRNA mW^^WMWii^ mireap_0. 2 (http //sourceforge. net/projects/ mireap)，对获取的棉花数据库中有小RNA对应的序列进行二级结构分析，若能形成类似 miRNA前体(pre-miRNA)的良好茎环结构则该序列可以认为是候选的新miRNA ；⑦对候选的新的miRNA继续进行筛选，考察候选的新miRNA序列所在的茎环结构前体的小RNA分布特征，若主要分布在候选的新miRNA区域以及对应的miRNA*区域，则认为该候选的新miRNA 序列高度可信，是真实的 miRNA 序列(Meyers B C，Axtell M J, Bartel B, Bartel D P, Baulcombe D, Bowman J L,Cao X,Carington J C,Chen Χ,Green P J,et al. Criteria for annotation of plant microRNAs. Plant Cell, 2008，20 :3186-3190.)。鉴定到1 个新的 miRNA，命名为 miRNA_GramiRn22。miRNA-GramiRn22 的序列如下(5，— 3，)UAUGAAACU⑶GAUUCCAC⑶CAU。野生型小RNA文库的测序次数(Qwt)为43，突变体小RNA文库(Qw)的测序次数为 58。miRNA前体(pre_miRNA)序列的二级茎环结构是miRNA基因最显著的特点之一，也是所有miRNA鉴定方法都不可逾越的重要规则。GramiRn22 前体(pre-gramiRn22)序列如下(5，一 3，)AAUGGACUUGUAUGAAACU⑶GAUUCCAC⑶CAUUUUUAUCCCUUUCCUUUAGGAGAAUGACAAAUCAG AUUUUUCCTACU-78nt-AGGAACAACGUGGAAUCACAAUUUCAUACAAUCCUUU(序列表的序列 2)。pre-gramiRn22能形成良好的茎环结构，成熟的miRNA从miRNA前体的茎部产生， 完全符合miRNA前体的结构特征(见图2)。实施例 3、miRNA Northern 杂交为了进一步检测miRNA-Gramifoi22在开花前3天至开花后3天在棉花胚珠中的表达模式，采用miRNA Northern杂交检测其表达情况。1、制备探针检测miRNA-Gramifoi22 的探针(5，一 3，)的序列ATGACGTGGAATCACAGTTTCATA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)对上述序列末端磷酸基团进行同位素(Y -32P ATP)标记，得到探针，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)纯化探针， 去除未标记的同位素，纯化后的探针用于Northern杂交。2、miRNA Northern 杂交Northern杂交中，每个泳道上样量为30 μ g总RNA，U6RNA作为内参，与miRNA在同一张膜上检测。U6基因的探针序列为TGTATCGTTCCAATTTTATCGGATGT。(1)分别提取实施例1获得的各胚珠样品的总RNA。( miRNA Northern 杂交①取30yg量的总RNA，加入等体积的2XRNA上样缓冲液(95%甲酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚蓝和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C变性5min,得到RNA样品。②RNA样品用15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后用电转移装置 (BIO-RAD)转移到 Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences)上。③转移有RNA样品的尼龙膜经6XSSC溶液短暂漂洗，紫外交联 (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龙膜上。④将转移了 RNA的尼龙膜放入杂交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo杂交液 (Ambion)在杂交炉中42°C预杂交池，然后加入探针，混勻，42°C杂交过夜。⑤杂交结束后，小心倒出杂交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗涤三次， 每次IOmin。⑥洗膜结束后，将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光2周。⑦曝光结束后，冲洗X光片，进行光密度扫描，以对照组的杂交信号为1，计算各个处理组杂交信号的相对强度。Northern杂交结果见图3。野生型(WT)中，miRNA-Gramifoi22在开花前3天至开花后3天，表达量基本呈现上升趋势。而在突变体(MU)中，miRNA-GramiRn22的表达量呈下降趋势，暗示了 Gramifoi22在棉花纤维起始过程中可能起重要的作用。实施例4、miRNA的靶基因预测与验证由于植物miRNA与靶基因mRNA近乎完全互补，因此可以通过生物信息学方法预测 miRNA-GramiRn22 的靶基因。采用在线软件 psRNATarget (http//plantgrn. noble, org/ psRNATarget/)在棉花EST数据库CGIlO中寻找到能与miRNA序列近乎完全互补的cDNA或基因，即为miRNA的靶标；参数设置为=PsRNATarget程序参数为默认设置，靶标的功能通过 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性检索，以同源性最高的已知功能基因进行注释。预测结果见表1。表lmiRNA-GramiRn22的靶基因及功能
权利要求
1.序列表的序列1所示的RNA。
2.序列表的序列2所示的RNA。
3.序列1所示RNA和/或序列2所示RNA在抑制mRNA前体剪接因子基因表达中的应用；所述mRNA前体剪接因子如序列表的序列3所示。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述mRNA前体剪接因子基因如序列表的序列4所示或序列表的序列4自5’末端第12至590位核苷酸所示。
5.序列1所示RNA和/或序列2所示RNA在促进mRNA前体剪接因子基因的mRNA降解中的应用；所述mRNA前体剪接因子如序列表的序列3所示。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述mRNA前体剪接因子基因如序列表的序列4所示或序列表的序列4自5’末端第12至590位核苷酸所示。
7.序列表的序列1所示的RNA和/或序列表的序列2所示的RNA在棉花纤维品质改良中的应用。
全文摘要
本发明公开了来源于棉花的miRNA-GramiRn22及其应用。本发明保护的miRNA-GramiRn22是序列表的序列1所示RNA，其前体(pre-gramiRn22)是序列表的序列2所示的RNA。本发明还保护序列1和/或序列2所示RNA在抑制mRNA前体剪接因子基因表达和/或促进mRNA前体剪接因子基因的mRNA降解中的应用。所述mRNA前体剪接因子如序列表的序列3所示，mRNA前体剪接因子基因如序列表的序列4所示。应用miRNA-GramiRn22有望获得在耐受逆境胁迫以及生长发育方面有重要表型的植株，具有重要的生物学意义和潜在应用价值，将为棉花的品质育种(如培育抗逆性棉花)提供宝贵的基因资源，带来一定的研究价值和社会效益，并最终用于实际生产。
文档编号C12N15/113GK102250899SQ20111017027
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月22日 优先权日2011年6月22日
发明者刘进元, 王正明, 薛伟 申请人:清华大学