专利名称：一种筛选抗褐飞虱水稻的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法与其专用引物。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，世界上有超过一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为主食。褐飞虱(Nilaparvata lugens属同翅目飞虱科昆虫，是一种单食性水稻害虫，已成为危害水稻生产的第一大害虫，每年危害面积达2亿亩以上，对水稻生产和粮食安全构成极大的威胁。20世纪60年代以来，由于耕作技术的改变、高产水稻品种的大面积推广，稻褐飞虱危害逐年加重，最终成为东南亚国家水稻生产的首要害虫，每年因此造成的损失近2. 5亿美元。在我国，稻褐飞虱原本仅在南方稻区偶有发生，但20世纪60年代之后，危害地域逐渐向北扩展，危害程度也逐渐加重。近年在我国浙江、江苏、江西、湖北、湖南、安徽等长江中下游地区，稻褐飞虱连年爆发。2005年仅华东4省市的粮食损失就接近25亿kg。因此，科学家们正努力寻找有效地防治方法以减少稻褐飞虱造成的损失。褐飞虱为害水稻程度较轻时，导致水稻植株矮小、生长活力降低、分蘖减少和产量下降； 而褐飞虱为害水稻严重时，将导致植株整体死亡。由于目前种植的水稻大部分都是感褐飞虱品种，农民只能使用农药来防治褐飞虱。但是农药的使用增加了农业生产的成本，并造成环境的污染。因此，最经济的、对环境最友好的防治褐飞虱的方法是种植抗褐飞虱的水稻品种。自20世纪60年代末开始鉴定褐飞虱水稻材料以来，各国在栽培品种和野生品种中陆续发现了大量抗性材料，也鉴定出大量抗褐飞虱材料，为抗褐飞虱基因的定位与克隆奠定了坚实的基础。到目前为止，经国际注册确认和报道的水稻抗褐飞虱基因有27 个(http://www. ricedata. cn/gene/gene_bph. htm)，其中 16 个为显性基因，11 个为隐性基因，已被定位的达21个。B5是由武汉大学何光存教授研究组通过药用野生稻 officinalis Wall ex Watt)与普通栽培稻珍汕97B经过多代杂交选育得到的材料。B5经抗褐飞虱表型鉴定，表明其对常见的几种褐飞虱的生物型1、2、3都表现出极高的抗性。经过近十年的研究，该研究组终于在B5的第3号染色体上成功克隆了 Bphl4基因，同时在B5 的第4号染色体上精细定位了召祐75基因。招基因是国际上第一个也是目前唯一的用图位克隆方法得到的水稻抗虫基因(Du B, Zhang WL, Liu W et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proc Natl Acad Sci USA, 2009，106(52) : 22163-22168)。水稻抗褐飞虱基因 /？祐招的成功克隆，将促进水稻抗稻飞虱育种研究快速发展，从而为少打农药、减少粮食损失，发展环境友好型和资源节约型农业做出重要贡献。在转育抗虫基因的回交育种中，一般要采用集团鉴定法，常规鉴定方法无法采用单株鉴定，只能在后代鉴定。利用分子标记技术，加快了抗虫基因选育的进程，节省成本，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的提供一种辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法及其专用引物。本发明所提供的辅助筛选抗褐飞虱水稻的引物B14，包含序列表中的4条核苷酸序列其中B14F1和B14R1单独使用时对应场7力74的阳性显性标记，即对场A74阳性水稻检测有566bp的条带，场乂招阴性水稻无条带；B14F2和B14R2单独使用时对应场7力74的阴性显性标记，即对/ 油招阴性水稻检测有34^p的条带，阳性水稻无条带，四条引物合并在一起的组成检测招的共显性标记，辦Bphl4阳性水稻检测有566bp的条带，φΑ招阴性水稻检测有34^ρ的条带，对杂合水稻检测有566bp和345bp两条带。本发明所提供的辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法，是以待检测水稻的基因组DNA为模板，是由序列表中B14F1、B14R1、B14F2以及B14R2的核苷酸序列的4条引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为566bp的条带，则该待测水稻为候选抗褐飞虱水稻。可通过浓度为1-1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。所述PCR扩增体系可为水稻基因组DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1 U，10XPCR 缓冲液2.0 μ 1,10 mmol each dNTPs 0. 2 μ 1，四条引物各0. 2 μ M，最后用ddH20补充反应体系至20 μ 1。所述PCR 反应条件可为先 95 °C 5min;随后 95°C 30sec，58°C 30sec，72°C 40sec，共；35 个循环；然后 72°C 5min。由于水稻中图位克隆的基因还很少，所以绝大部分分子标记辅助选择都是用的连锁标记，在实际应用中会有一定的交换和误差。本发明根据世界第一个水稻抗虫基因的核苷酸序列设计的基因内功能性共显性标记。共显性标记与显性标记相比，可以排除实验中假阴性的影响，同时可以检测基因是否纯和，具有更好的准确性和精确性。本发明标记的隐性条带和阳性条带差异较大，可以用1%左右的琼脂糖电泳检测，比一般的PADE电泳检测的方法更简单方便，同时节省成本。另外，由于B5是普遍应用的抗褐飞虱杂交品种的亲本，因此，该分子标记具有检测是否抗褐飞虱的普遍意义，可以检测其他以B5作为亲本的育种材料的检测工具。本发明的特异引物是由本发明的辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法可用于选育抗褐飞虱水稻，降低成本，缩短育种周期，具有准确性高，操作简单，成本低廉，周期短的特点，适于推广应用，为选育抗褐飞虱的水稻种质提供了一种快捷的选择方法。
图1为本发明的分子标记B14对9311//B5/9311重组自交系检测的结果。图中， Pl代表9311 ；P2代表B5 ；其他材料为重组自交系；R为抗褐飞虱；S为感褐飞虱。
具体实施例方式下面结合附图及具体实施对本发明作进一步说明。首先在田间种植上述9311//B5/9311重组自交系群体。在苗期采用本发明提供分子标记进行抗褐飞虱检测。DNA提取采用常规的CTAB提取法。PCR扩增体系为水稻基因组DNA模板20ng，Taq DNA聚合酶1 U，IOXPCR缓冲液2.0 μ 1,10 mmol each dNTPs 0. 2ul，四条引物各0. 2 μ M，最后用ddH20补充反应体系至 20μ1。PCR 反应条件可为先 95°C 5min;随后 95°C 30sec，58°C 30sec, 72°C 40sec, 共35个循环；然后72°C 5min。PCR产物检测将PCR产物，上样于1. 5%琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物带型。共有270个株系提取DNA，进行上述检测过程，结果显示其中36个具有B5的抗性等位基因)。如图1所示，最左边的条带是分子量对照250bp DNA Ladder Marker
(Takara)，Pl就是阳性亲本B5的带型，条带大小是566bp ；P2就是阴性亲本9311的带型， 条带大小是；1-15是待检测的15个水稻株系，表现和Pl大小一致条带的是阳性水稻，和P2大小一致条带的的是场乂招阴性水稻，同时具有大小两个条带的是场7力74杂合水稻。R和S代表该水稻株系抗褐飞虱表型鉴定的结果，R代表抗褐飞虱，S代表感褐飞
Ml ο对上诉270个株系进行抗褐飞虱鉴定后，发现在上述36个株系中有沈个株系表现为5级(中抗)以上。标记和表型吻合度为72. 2%，基因型和表型不能全部吻合是因为抗褐飞虱是一个多基因控制的复杂性状，遗传背景中抗褐飞虱微效基因的存在和互作导致某些株系抗性下降。从褐飞虱鉴定后的水稻活苗率来看，36々BphM阳性株系的活苗率是 64. 36%，阴性活苗率是38. 2m,Bphl4使抗褐飞虱的活苗率增加了 26. 11%，大大提高了水稻的褐飞虱抗性。同时相关分析表明，表型与基因型的相关系数为0. 345，达到了极显著正相关(ρ<0· 001)。在抗褐飞虱分子育种中，利用本发明中的Β14标记，同时结合召祐75基因的分子标记来进行分子标记辅助筛选，抗褐飞虱育种的效率会更高。表1序列表
权利要求
1.一种辅助筛选抗褐飞虱水稻的引物，包含序列表中的4条核苷酸序列B14F1、B14R1、 B14F2 禾P B14R2。
2.一种辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法，以待检测水稻的基因组DNA为模板，用序列表中B14F1、B14R1、B14F2以及B14R2的核苷酸序列的4条引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物中有大小为566bp的条带，则该待测水稻为候选抗褐飞虱水稻。
3.根据权利要求2所述之方法，其特征在于所述PCR扩增体系为水稻基因组DNA模板 ZOngJaq DNA 聚合酶 1 U, 2.0 μ 1 10XPCR 缓冲液，10 mmol each dNTPs 0·2μ1，四条引物各0.2 μ Μ，最后用ddH20补充反应体系至20 μ 1。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件为先95°C5min ； 随后 95°C 30sec,58°C 30sec, 72°C 40sec，共；35 个循环；然后 72°C 5min。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述检测扩增产物带型的方法是进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
一种辅助筛选抗褐飞虱水稻的方法与其专用引物。辅助筛选抗褐飞虱水稻的引物，是由序列表中序列B14F1、B14R1、B14F2和B14R2的核苷酸序列组成的四条引物。该方法是以待检测水稻的基因组DNA为模板，用序列表中序列B14F1、B14R1、B14F2和B14R2的核苷酸序列组成的四条引物进行PCR扩增，如该待测水稻的扩增产物为大小566bp的条带，则该待测水稻为候选抗褐飞虱水稻。该方法可用于选育抗褐飞虱水稻，缩短抗褐飞虱水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适应于推广应用，为选育抗褐飞虱水稻品种提供了一种快捷的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102296108SQ201110170178
公开日2011年12月28日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者何光存, 刘凯, 周雷, 李三和, 杜波, 杨国才, 游艾青, 胡刚, 郎需勇, 陈志军 申请人:武汉大学, 湖北省农业科学院粮食作物研究所