富铁水稻快速筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种富铁水稻快速筛选方法，待测水稻为以标准品水稻为基础进行突变或改良所得的水稻，将待测水稻籽粒和标准品水稻籽粒分别进行如下步骤1）~步骤4）；1）籽粒糊化；2）在步骤1）的所得物中加入盐酸进行中和；3）在步骤2）的所得物中加入氯化羟胺水溶液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乳化剂OP水溶液等振荡摇匀后静止；4）在步骤3）的所得物中加入BPT染色液，振荡摇匀后静止；取位于上层的清液；?5）将步骤4）所得的待测水稻籽粒的反应物和标准品水稻籽粒的反应物进行颜色的比较；如果待测水稻籽粒的反应物的颜色比标准品水稻籽粒的反应物颜色深，则说明待测水稻籽粒的含铁量高于标准品水稻。
【专利说明】富铁水稻快速筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻籽粒含铁量的快速筛选方法，主要涉及领域为:农学、育种、水稻。【背景技术】
[0002]水稻是世界第二大粮食作物，也是我国的主要粮食作物，其营养成分直接关系到人们的身体健康。铁元素是人体生长发育所必需的微量元素，在人体分布很广，缺铁会降低婴儿的心智发育，降低免疫力，增加母婴的死亡率，还会增加人体疲劳感，使工作效率低下。WHO (2004)报道缺铁是世界普遍存在的营养问题。世界上约有40-50亿人(占世界人口的6610% )均存在铁缺乏，其中20亿的贫血症患者是由于铁缺乏所引起的，发展中国家的情况尤为严重。因此，研究稻米的矿质营养、充分发掘富含铁元素的水稻种质及培育新品种有利于解决这一营养危机。稻米中微量元素含量的研究难度之一是如何快速和准确地测定其微量元素含量水平。因此，微量营养成分的测定方法应实现规范化、标准化，并与国际测定方法保持一致，对品种区域试验和检测技术、审(认)定标准、指标以及品种推广利用途径等进行深入、系统研究极为必要。目前稻米中矿物质含量的测定方法一般都需要高昂的仪器并且需要繁琐的样品前处理程序，其中的样品灰化过程一般需要24-36h的时间，而且常规的灰化炉一次只能放36-48个样品，灰化样品少、灰化时间长，接下来用元素测定仪或ICP-MS等方法测定成本高且耗时长，不能快速、高效地测定出稻米的矿物质含量，因而不能及时有效地为育种工作服务。在育种实践过程中并不需要极其精确地得到水稻籽粒的铁含量水平，而只要相对准确地对富铁水稻材料加以快速筛选就可以达到育种要求。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题为富铁水稻的育种工作提供一种快速、经济和准确的富铁水稻快速筛选方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种富铁水稻快速筛选方法，待测水稻为以标准品水稻为基础进行突变或改良所得的水稻，将待测水稻籽粒和标准品水稻籽粒分别进行如下步骤I)-步骤4):
[0005]I)、籽粒糊化:
[0006]在4粒水稻籽粒中加入质量浓度为4%的NaOH溶液0.8-1.2 mL,在恒温培养箱中于34.5-35.5°C糊化5.5-6.5h，取出后于振荡器上震荡1.5-2.5min，振荡频率为30(T350r/min ；
[0007]2)、在步骤I)的所得物中加入0.4-0.6 mL浓度为2M的盐酸进行中和；
[0008]3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为10%的氯化羟胺水溶液0.2-0.3mL、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5) 0.7-0.8 mL、质量浓度为20%的乳化剂OP水溶液0.9-1.1mL ；然后用浓度为5M的NaOH溶液调节pH为4.0-5.0，振荡摇匀后静止8-12min ；
[0009]备注说明:乳化剂OP具体可选用乳化剂0P-10 ；
[0010]4)、在步骤3)的所得物中加入0.2-0.3mL的4，7_ 二苯基1，10-邻菲罗啉(BPT)染色液，振荡摇匀后静止8?12min ;取位于上层的清液(备注说明:静止后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较)；从而分别获得待测水稻籽粒的反应物和标准品水稻籽粒的反应物；
[0011 ] 所述BPT染色液为BPT的质量浓度为0.1%的乙醇溶液；
[0012]5)、将步骤4)所得的待测水稻籽粒的反应物和标准品水稻籽粒的反应物进行颜色的比较；
[0013]如果待测水稻籽粒的反应物的颜色比标准品水稻籽粒的反应物颜色深，则说明待测水稻籽粒的含铁量高于标准品水稻，即，待测水稻为富铁水稻。
[0014]备注说明:浓度M即mol/L的意思。
[0015]作为本发明的水稻籽粒含铁量的快速筛选方法的改进:
[0016]所述步骤I)中=NaOH溶液的用量为lmL，在恒温培养箱中于35°C糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min ；
[0017]所述步骤2)中盐酸的用量为0.5 mL ;
[0018]所述步骤3)中氯化羟胺水溶液的用量为0.25mL,乙酸-乙酸钠缓冲液的用量为0.75 mL,乳化剂OP水溶液的用量为ImL ；
[0019]所述步骤4)中BPT染色液的用量为0.25mL。
[0020]在本发明中，
[0021]水稻籽粒选择大小基本一致的成熟籽粒(经常规的脱壳处理)；
[0022]质量浓度为10%的氯化羟胺水溶液，临用前配制。
[0023]BPT染色液，需4 °C避光保存。
[0024]振荡频率一般均指30(T350r/min。
[0025]本发明的富铁水稻快速筛选方法，4个步骤总计时间仅约为6.5小时。
[0026]备注说明:
[0027]1、以原始水稻为基础进行突变或改良所得的水稻的籽粒与原始水稻籽粒的大小基本一致，即，重量的差别微乎其微。
[0028]2、待测水稻籽粒的反应物与标准品水稻籽粒的反应物的颜色深度的对比,通过简单的目测即能获得；当然，为了便于用文字进行记录，也可与“标准色卡”进行比对，从而获得一个相应的颜色值。
[0029]本发明主要用于富铁水稻的定性筛选，且在试验过程中发现未发生突变的水稻样品染色后色度相差不大，我们主要挑选染色色度“明显”深于标准品的样品(因为突变体筛选的试验样品量太大，主要通过视觉感官挑选，通过此方法挑选出的突变体概率不大于0.5%) ο
[0030]本发明提出的BPT染色法水稻籽粒不用磨粉，只需籽粒就可以定性地筛选出铁含量较高的水稻品系，一天内可以完成大量样品的筛选过程。与传统的测定方法相比较，本发明给育种工作者提供一个更加简单、快速、较准确以及低成本的富铁水稻种质资源的筛选方法。
[0031]本发明例如可用于浙农7号水稻品种高铁突变体(2009M6)、93-11的种皮颜色突变体2009-223 (黑米)的检测。【专利附图】
【附图说明】
[0032]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0033]图1为浙农7号高铁突变体与对照浙农7号品种的染色比较图。
[0034]图2缓冲液用量对吸光度的影响(ρΗ=4.5)。
[0035]图3盐酸羟胺溶液对吸光度的影响图。
【具体实施方式】
[0036]备注说明:
[0037]以下实施例中用到的浙农7号水稻品种高铁突变体(2009Μ6)在 KeMinWang,Jian Guo ffu, Guan Li, Da Peng Zhang, Zhong Wei Yang, Chun Hai Sh1.Distributionof phytic acid and mineral elements in three indica rice (Oryza sativa L.)cultivars.Journal of Cereal Science , 2011, 54: 116-121 中有明确告知。
[0038]以下实施例中用到的2009-223 (黑米)在 Jiang SL, Wu JG, Thang NB, et alGenotypic variation of mineral elements contents in rice (Oryza sativa L.).EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY, 2008, 228 (I): 115-122 中有明确告知。
[0039]实施例1、富铁水稻快速筛选方法，以浙农7号水稻品种高铁突变体(2009M6，保存于浙江大学农学系水稻育种室)为待测水稻，以常规的浙农7号品种作为标准品；将待测水稻和标准品水稻经脱壳处理后，分别获得待测水稻成熟籽粒(简称待测水稻籽粒)和标准品水稻成熟籽粒(简称标准品水稻籽粒)；取大小基本一致的待测水稻籽粒和标准品水稻籽粒分别进行如下操作:
[0040]I )、将4粒水稻籽粒装入IOmL玻璃试管中，然后加入质量浓度为4%的NaOH溶液lmL，在恒温培养箱中于35°C糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min，振荡频率为30(T350r/min ；
[0041]2)、在步骤I)的所得物中加入0.5mL浓度为2M的盐酸进行中和；
[0042]3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为10%的氯化羟胺水溶液0.25mL、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)0.75 mL、质量浓度为20%的乳化剂0P-10水溶液ImL ;然后用浓度为5M的NaOH溶液调节pH为4.5，振荡摇匀后静止IOmin ；
[0043]4)、在步骤3)的所得物中加入0.25mL的4，7_ 二苯基1，10-邻菲罗啉(BPT)染色液，振荡摇匀后静止IOmin ;取位于上层的清液；从而分别获得待测水稻籽粒的反应物和作为标准品水稻籽粒的反应物；
[0044]备注说明:静止后会出现分层，未溶解的部分沉淀下来，本发明对上层的清液进行颜色比较；
[0045]BPT染色液为BPT的质量浓度为0.1%的乙醇溶液；
[0046]5)、将步骤4)所得的待测水稻籽粒的反应物和作为标准品水稻籽粒的反应物进行颜色的比较；
[0047]待测水稻籽粒的反应物的颜色明显比标准品水稻籽粒的反应物颜色深，如图1所
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[0048]将筛选出来的高铁突变体和对照水稻样品，经ICP-MS方法进行定量测定，浙农7号水稻品种高铁突变体一-2009M6的含铁量明显高于对照浙农7号的含铁量，两者的含铁量分别为 25.8±0.2 mg/kg 和 22.7±0.3 mg/kg。
[0049]对比例1-1、将实施例1中的糊化时间由6小时改成10小时，其余同实施例1。
[0050]最终结果为:
[0051]待测水稻籽粒的反应物的颜色与比标准品水稻籽粒的反应物颜色非常接近，从而无法进行有效区别。
[0052]对比例1-2、将实施例1中的糊化时间由6小时改成2小时，其余同实施例1。
[0053]最终结果为:
[0054]待测水稻籽粒的反应物的颜色与比标准品水稻籽粒的反应物颜色非常接近，从而无法进行有效区别。
[0055]对比例2-1、将实施例1的步骤3)中的氯化羟胺水溶液的用量由0.25ml改成0.4ml ;其余同实施例1。
[0056]最终结果为:通过肉眼观察颜色非常接近，从而无法进行有效区别。
[0057]对比例2-2、将实施例1的步骤3)中的氯化羟胺水溶液的用量由0.25ml改成0.1ml ;其余同实施例1。
[0058]最终结果为:通过肉眼观察颜色非常接近，从而无法进行有效区别。
[0059]实施例2、以93 — 11高铁含量突变体的筛选
[0060]利用BPT染色法在1428份93_11水稻M2中初步筛选出31份高铁突变体材料，占总材料的2.2%，在其随后3个世代的进一步筛选，突变材料占总材料的比率呈上升趋势，比率分别为29.3%,46.7%和75.4% ;在1132份经过诱变的浙农7号材料中初筛出21份高铁突变体材料，占总材料的1.9%，对其后4个世代进一步筛选，突变体占总材料的比率逐渐升高；在1556份杂交材料的F3中筛选出107份高铁突变体，占总材料的6.9%，相对于上述两个诱变材料突变率较高，原因可能是杂交育种材料的两个对照材料嘉育293和舟优903籽粒中的铁含量较低。与上述两个突变体材料一样，对育种材料FfF7等世代进行筛选，突变体占总材料的比率也逐渐升高。对25个杂交组合育种材料籽粒中铁含量的定性筛选结果发现，在中佳早 05-1/ 浙农 38、EH05-6/Z00-29、EH05-6/ 浙农 40、浙辐 05-06/Z00-29、浙辐05-06/ 浙农 40、台早 677/Z00-29、台早 677/ 浙农 40、浙农 40/Z00-29、浙农 37/JS01-24、EH05-6/碧玉早糯等10个杂交组合材料，可以筛选出比其他组合更多的高铁水稻材料。
[0061]实施例3、以2009-223 (黑米)品种(为93_11的种皮颜色突变体)为待测水稻，以常规的93-11作为标准品，如同实施例1进行检测。
[0062]结果如下:待测水稻籽粒的反应物的颜色明显比标准品水稻籽粒的反应物颜色深。
[0063]验证试验:
[0064]具体实验过程如下:
[0065](I)实验仪器与试剂
[0066]铁标准溶液(阿拉丁试剂公司)；4%的氢氧化钠溶液；4，7- 二苯基1，10-邻菲罗啉(BPT)染色液:0.1%的乙醇溶液；乳化剂OP(OP-1O)溶液:20%水溶液；乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5):称取无水乙酸钠50g溶于适量水中，加冰乙酸47.5 mL，稀释至1L，得到pH为4.5缓冲液；氯化羟胺溶液:10%水溶液(临用前配制)；紫外分光光度计(日本岛津)；0.45μπι滤膜；过滤器；10 mL注射器。以上所用玻璃仪器在使用前用IM的HCl溶液中浸泡过夜。[0067](2)样品前处理
[0068]收获的水稻材料用砻谷机(型号JLGJ4.5，浙江台州粮仪厂)进行脱壳处理后得到糙米，糙米进一步用精米机(型号JNMJ3，浙江台州粮仪厂)进行碾磨得到精米，最后用手提式万能粉碎机(型号DFT-50，温岭市林大机械有限公司)碾磨样品，得到糙米粉和精米粉。把米粉样品放入烘箱在103±2°C条件下放置2h，过60目筛后装入封闭的塑封袋中，在干燥器中平衡水分。
[0069](3)定量测定
[0070]准确称取0.5g米粉，放入25 mL圆底塑料离心管中。用移液枪取10 mL的2 M的盐酸溶液加入到离心管中，使米粉充分混入到盐酸溶液中，盖紧盖子。然后放入旋转恒温振荡器中在50°C下200r/min的条件下震荡40分钟，然后将离心管离心，离心速率为4000r/min。
[0071]用一次性注射器取上清液过0.45 μ m滤膜，准确吸取4 mL滤液加入到干净的比色管中；然后加入4 mL 2M的氢氧化钠溶液充分混合；再加入2 mL氯化羟胺溶液，稍置片刻后沿瓶壁缓慢加入I mL乳化剂OP溶液和6 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，最后加2mL BPT染色液充分混匀，静置10分钟进行充分染色，反应体系最后定容至20 mL,同时做一空白对照(比色时调零用)。用可见分光光度计在波长537nm处测定吸光度。
[0072](4)含量计算
[0073]根据以下公式计算米粉样品中的铁含量:
[0074]
【权利要求】
1.富铁水稻快速筛选方法，其特征是:待测水稻为以标准品水稻为基础进行突变或改良所得的水稻，将待测水稻籽粒和标准品水稻籽粒分别进行如下步骤I)?步骤4); 1)、籽粒糊化: 在4粒水稻籽粒中加入质量浓度为4%的NaOH溶液0.8-1.2 mL,在恒温培养箱中于34.5?35.5°C糊化5.5?6.5h，取出后于振荡器上震荡1.5?2.5min，振荡频率为300?350"min ； 2)、在步骤I)的所得物中加入0.4-0.6 mL浓度为2M的盐酸进行中和； 3)、在步骤2)的所得物中加入质量浓度为10%的氯化羟胺水溶液0.2-0.3mL、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5) 0.7?0.8 mL、质量浓度为20%的乳化剂OP水溶液0.9?1.1mL ;然后用浓度为5M的NaOH溶液调节pH为4.0-5.0，振荡摇匀后静止8?12min ； 4)、在步骤3)的所得物中加入0.2-0.3mL的BPT染色液，振荡摇匀后静止8?12min ;取位于上层的清液；从而分别获得待测水稻籽粒的反应物和标准品水稻籽粒的反应物； 所述BPT染色液为BPT的质量浓度为0.1%的乙醇溶液；BPT为4，7- 二苯基1，10-邻菲罗啉； 5)、将步骤4)所得的待测水稻籽粒的反应物和标准品水稻籽粒的反应物进行颜色的比较； 如果待测水稻籽粒的反应物的颜色比标准品水稻籽粒的反应物颜色深，则说明待测水稻籽粒的含铁量高于标准品水稻。
2.根据权利要求1所述的水稻籽粒含铁量的快速筛选方法，其特征是: 所述步骤I)中=NaOH溶液的用量为lmL，在恒温培养箱中于35°C糊化6h，取出后于振荡器上震荡2min ； 所述步骤2)中盐酸的用量为0.5 mL ; 所述步骤3)中氯化羟胺水溶液的用量为0.25mL,乙酸-乙酸钠缓冲液的用量为0.75mL,乳化剂OP水溶液的用量为ImL ； 所述步骤4)中BPT染色液的用量为0.25mL。
【文档编号】G01N21/78GK103439327SQ201310386023
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】石春海, 王克敏, 吴建国 申请人:浙江大学