镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻的制作方法

镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻的制作方法
【专利摘要】本发明提供与根的Cd吸收的促进或抑制有关的转运蛋白基因、其突变基因及转运蛋白、以及抑制Cd吸收的水稻及Cd吸收抑制水稻的筛选、育成方法。是包含由序列编号2所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、包含由序列编号3所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、包含由序列编号4所表示的DNA碱基序列且编码与镉吸收的抑制相关的转运蛋白的基因、及包含序列编号1所记载的氨基酸序列且与镉吸收的抑制相关的转运蛋白。
【专利说明】镉吸收控制基因、蛋白质、及镉吸收抑制水稻
【技术领域】
[0001]本发明涉及与根的镉(以下简称为Cd。)吸收的抑制相关的转运蛋白基因及转运蛋白、以及Cd吸收受到抑制的水稻突变体及低Cd吸收水稻品种。
【背景技术】
[0002]FA0/WH0的合同食品规格委员会为了减轻因食品中所含的Cd的摄取而导致的健康受害风险，而制定了规定食品中的Cd浓度的国际基准值。接受该基准值，日本在2011年2月修改了食品卫生法，稻米的规定值从Imgkg4 (糙米)大幅地变更为0.4mgkg_1 (糙米和精米)。因此，当务之急是开发出使水稻的Cd吸收减少的技术。
[0003]作为水稻的Cd吸收减少技术，到目前为止，实施了利用换土而进行的土壤复原、土壤改良材料的投入、蓄水管理等务农技术(参照例如专利文献I及2。)。但是，就已有的方法而言，在所需年数、成本、效果方面看，还存在很多问题。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1:日本特开2011 - 83194号公报
[0007]专利文献2:日本特开2011 - 6529号公报

【发明内容】

[0008]发明所要解决的课题
[0009]作为替代已有的方法的技术，虽然低Cd吸收水稻品种的开发、导入在经济上来说环境负荷少、并且具有可持续的优点，但是到目前为止尚无开发出低Cd吸收水稻品种的报告例。本发明的课题在于，提供与根的Cd吸收的控制相关的转运蛋白、转运蛋白基因及其突变基因、以及Cd吸收受到抑制的水稻及Cd吸收抑制水稻的筛选、育成方法。
[0010]用于解决课题的手段
[0011]本发明人对水稻种子照射重离子束，从所得的植物体中筛选低Cd吸收水稻突变体。进而，确定出所得的突变体的原因基因，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。
[0012]< I >本发明为一种基因，其包含下述(A)至(C)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白:
[0013](A)由序列编号2所表示的DNA碱基序列，
[0014](B)在序列编号2中记载的碱基序列中I个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的喊基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列，
[0015](C)与序列编号2中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
[0016]< 2 >进而，本发明为一种基因，其包含下述(D)至(F)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白:
[0017](D)由序列编号3所表示的DNA碱基序列，[0018](E)在序列编号3中记载的碱基序列中I个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的喊基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列，
[0019](F)与序列编号3中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
[0020]< 3 >进而，本发明为一种基因，其包含下述(G)至(I)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白:
[0021 ] (G)由序列编号4所表示的DNA碱基序列，
[0022](H)在序列编号4中记载的碱基序列中I个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的喊基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列，
[0023](I)与序列编号4中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
[0024]< 4 >进而，本发明为一种转运蛋白，其包含下述(J)至(L)中的任一个氨基酸序列且与镉吸收的控制相关:
[0025](J)序列编号I中记载的氨基酸序列，
[0026](K)在序列编号I中记载的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列，
[0027](L)与序列编号I中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
[0028]< 5 >进而，本发明为一种转运蛋白，其包含下述(M)至(O)中的任一个氨基酸序列且与镉吸收的控制相关:
[0029](M)序列编号5中记载的氨基酸序列，
[0030](N)在序列编号5中记载的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列，
[0031](O)与序列编号5中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
[0032]< 6 >进而，本发明为一种转运蛋白，其包含下述(P)至(R)中的任一个氨基酸序列且与控制镉吸收相关:
[0033](P)序列编号6中记载的氨基酸序列，
[0034](Q)在序列编号6中记载的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列，
[0035](R)与序列编号6中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
[0036]< 7 >进而，本发明是一种包含上述< I >至< 3 >中任一项所述的DNA的重组载体。
[0037]< 8 >进而，本发明是一种包含上述< 2 >或< 3 >所述的DNA的转化体、或是缺失了上述< I >所述的DNA的转化体。
[0038]< 9 >进而，本发明是一种通过使用上述< 7 >所述的重组载体而得的转化体。
[0039]< 10 >进而，本发明是一种能够识别上述< I >至< 3 >中任一项所述的DNA碱基序列的基因标记。[0040]< 11 >进而，本发明是一种将上述< 4 >所述的蛋白质的功能加以抑制的镉吸收抑制水稻。
[0041]< 12 >进而，本发明是一种上述< 2 >或< 3 >所述的基因编码的蛋白质进行表达的镉吸收抑制水稻。
[0042]< 13 >进而，本发明是上述< 11 >或< 12 >所述的镉吸收抑制水稻，其出穗、收获量、味道与水稻品种越光为相同程度。
[0043]< 14 >进而，本发明是上述< 11 >或< 12 >所述的镉吸收抑制水稻，其中，所述镉吸收抑制水稻的出穗比水稻品种越光早约2周左右。
[0044]< 15 >进而，本发明是一种上述< 11 >至< 14 >中任一项所述的镉吸收抑制水稻突变体的筛选方法，其包括下述(A)的步骤和(B)的步骤、或者包括(A)的步骤和(C)的步骤，
[0045](A)将照射重离子束后的第I代种子栽培在田地中并收集第2代种子的步骤，
[0046](B)将在所述(A)的步骤中得到的第2代种子栽培在含有Cd的水培液中，收集切除茎叶而分泌出的导管液，根据该导管液中所含的Cd浓度来筛选Cd吸收抑制水稻突变体，并且收集第3代种子的步骤。
[0047](C)将在所 述(A)的步骤中得到的第2代种子的幼苗个体栽培在Cd污染土壤中，根据第3代种子的Cd浓度来筛选镉吸收抑制水稻突变体的步骤。
[0048]< 16 >进而，本发明是一种镉吸收抑制水稻，其是通过上述< 11 >至< 14 >中任一项所述的镉吸收抑制水稻突变体与已有的水稻品种的杂交而得的。
[0049]发明效果
[0050]本发明提供实用性高的低Cd吸收水稻品种。进而，通过将本发明的低Cd吸收水稻品种作为母本，从而能够在不进行基因重组操作的情况下育成新型的低Cd吸收水稻品种，另外，通过使用本发明的DNA标记，从而能够高效地筛选出低Cd吸收水稻品种。
【专利附图】

【附图说明】
[0051]图1是表示在Cd污染田地中栽培时的糙米(brown rice)的镉浓度。
[0052]图2是表示越光(Koshihikari)与低Cd突变系统的生育状态的说明图。
[0053]图3是表示将#3-6-4与力寸5 ^ (Kasalath)杂交而得的F2个体(92个体)的茎叶Cd浓度的频度分布的图。
[0054]图4是表示通过基因作图来推定的低Cd基因的存在位置的图。
[0055]图5是表示在#7-3-6和#3_6_4的基因组DNA上的碱基的缺失和插入位置的图。
[0056]图6是表示越光(Koshihikari)与突变体的通过PCR而得到的DNA扩增片段长度的差异的电泳结果图。
[0057]图7是表示对导入了 TRECA基因和treca_l基因的各酵母突变株在SD琼脂培养基中分别进行处理时的酵母的增殖程度的结果图。
[0058]图8是表示TRECA蛋白与treca_l蛋白的局部存在性的荧光观察图。
[0059]图9是使用基因标记来表示越光(Koshihikari)与突变体(#3_6_4，#3-5-20)的DNA扩增片段长度的差异的电泳结果图。
[0060]图10是使用基因标记来表示越光(Koshihikari)与突变体(#7-3-6)的DNA扩增片段长度的差异的电泳图。
【具体实施方式】
[0061]本发明是通过对将在花的育种等中经常使用的重离子束照射于水稻而得的低Cd吸收水稻品种的基因进行分析而得的、与CM吸收的控制有关的转运(Transporterregulating cadmium absorption,调控镉吸收的转运蛋白、以下简称为TRECA。)蛋白、TRECA基因及该TRECA基因的突变基因(以下简称为treca。)，进而是包含该突变基因的低Cd吸收水稻品种及使用该低Cd吸收水稻品种而得的新的低Cd吸收水稻品种。需要说明的是，在本发明中“控制镉吸收”是指，与镉吸收的促进、抑制相关的情况。以下，对于本发明详细进行说明。
[0062]<关于 TRECA 基因>
[0063]本发明的TRECA基因是编码序列编号I所示的与镉吸收的控制相关的转运蛋白的、序列编号2所示的基因。序列编号2所示的碱基序列是通过对照射上述重离子束而得的Cd吸收抑制水稻的基因进行分析而确定出的碱基序列。本发明是来自TRECA基因的重金属转运蛋白基因的起始密码子至终止密码子为止的、所谓的开放阅读框(以下称作0RF。)。
[0064]上述TRECA 基因是在 RAP-DB(The Rice Annotation Project Database)、NCBI (The National Center for Biotechnology Information)等记载了遗传信息的数据库中，根据与功能已知的拟南芥的碱基序列的同源性等注视为具有重金属输送功能的基因的Nramp基因的一种。在RAP-DB中，记载为“similar to OsNrampl”,在NCBI中记载为“0sNramp5”，但对于其功能来说，尤其是对于具有控制水稻的镉吸收的功能而言，是以往完全不知道的。
[0065]本发明所述的TRECA基因优选为包含由序列编号2所示的碱基序列构成的多核苷酸的0RF，只要包含相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF上加入5’以及3’ UTR后的基因也包含在本发明中。
[0066]对于本发明的TRECA基因来说，包括例如编码包含在序列编号I中记载的氨基酸序列中I个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
[0067]另外，即使在碱基序列发生了突变的情况下，也存在其不伴随蛋白质中的氨基酸突变的情况(简并突变)，这样的简并突变体也包括在本发明的基因中。
[0068]获得上述基因的方法并没有特别限定，可采用一般的方法。例如，从具有该基因的生物的基因组DNA、基因组DNA文库等中利用适当的限制性内切酶将该基因切出并进行纯化即可。即，本发明的重金属转运蛋白基因中包括基因组DNA以及化学合成DNA。基因组DNA的制备可以利用对于本领域技术人员而言常规的手段来进行。基因组DNA例如能够通过如下方式加以制备:从对象生物中提取基因组DNA，制成基因组文库(作为载体，可利用质粒、噬菌体、黏粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用以编码本发明的蛋白质的DNA(序列编号2)作为基础而制备出的探针，进行菌落杂交或噬菌斑杂交，由此来进行制备。
[0069]另外，还能够如下地加以制备:制成对编码本发明的重金属转运蛋白的DNA(序列编号2)特异的引物，进行利用该引物的PCR。
[0070]具体来说，为了制备编码与序列编号I中记载的重金属转运蛋白在功能上同等的蛋白质的基因，作为本领域技术人员熟知的方法，可举出利用“Southern，E.M.Journal of Molecular Biology, 98，503 (1975) ” 所记载的杂交技术、“Saiki, R.K.等Science, 230，1350-1354 (1985)、Saiki, R.K.等 Science, 239，487-491 (1988) ” 所记载的聚合酶链式反应(PCR)技术的方法。能够这样地通过杂交技术或PCR技术而分离出的编码与本发明的重金属转运蛋白具有同等的功能的蛋白质的基因也包括在本发明的基因中。
[0071]对于通过上述而分离出的基因来说，可认为在其编码的氨基酸水平上与本发明的蛋白质的氨基酸序列(序列编号I)具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸序列全体中为80%以上、进一步优选为90%以上、特别优选为95%以上的序列的相同性。序列的相同性可通过 FASTA 检索(Pearson ff.R.D.J.Lipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.85:2444-2448)或 BLASTP 检索来确定。
[0072]< 关于 TRECA 蛋白 >
[0073]本发明所述的TRECA蛋白是由TRECA基因来编码、存在于细胞膜上、控制镉及锰的吸收的蛋白质。在后述的全部缺失了编码本发明的TRECA蛋白的基因的系统(#7-2-13)或一部分发生了突变的系统(#3-6-4或#7-3-6等)中，镉及锰的吸收被大幅地抑制，由此可知，该蛋白质控制镉及锰的吸收。另外，在酵母中导入有TRECA基因的系统中，TRECA蛋白显示出铁的输送活性，而在带有突变型的treca蛋白的酵母中未显示出铁的输送活性，因此，TRECA蛋白还涉及铁的吸收。但是，上述的缺失系统或突变系统在铁的浓度上并没有变化(表2)，由此可预测出:与目前为止所报告的作为铁吸收相关蛋白质的IRT或ZIP家族(Bughio N.等(2002) Journal of Experimental Botany.53:1677-1682)相比，铁吸收能力低。
[0074]本发明所述的TRECA蛋白是包含以序列编号I所表示的氨基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号I所表示的氨基酸序列中I个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列、且具有TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或者与包含以序列编号I所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的同源性、且具有TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
[0075]<关于TRECA基因的突变型treca-Ι基因及treca-Ι蛋白>
[0076]本发明是序列编号3所示的TRECA基因的突变基因(以下称作treca_l基因。)。序列编号3所示的碱基序列是来自上述照射重离子束而得的Cd吸收抑制水稻#3-6-4的基因，是在上述序列编号2所示的TRECA基因中对cDNA的第10外显子的末端部位、碱基编号第1025至第1056的32bp加以置换而成为50bp后的基因。
[0077]本发明是上述序列编号3所示的treca-Ι基因的起始密码子至终止密码子为止的0RF，但只要含有相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF中加入5’和3’UTR而得的基因也包含在本发明中。
[0078]另外，本发明的treca-Ι基因包括例如编码包含在序列编号5中记载的氨基酸序列中I个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
[0079] 本发明所述的由treca-Ι基因编码的treca_l蛋白是氨基酸序列如序列编号5所示地从上述TRECA蛋白发生了突变且抑制了 Cd吸收功能的蛋白质。treca-Ι蛋白是包含以序列编号5所表的氣基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号5所表的氣基酸序列中I个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加后的氨基酸序列、并且丧失了 TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或是与包含以序列编号5所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80%以上、优选90%以上、进一步优选95%以上的同源性、且丧失了 TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
[0080]<关于TRECA基因的突变型treca-2基因及treca-2蛋白>
[0081]本发明是序列编号4所示的TRECA基因的突变基因(以下称作treca-2基因。)。序列编号4所示的碱基序列是来自照射上述重离子束而得的Cd吸收抑制水稻#7-3-6的基因，在上述序列编号2所示的TRECA基因(cDNA)中的碱基编号第915处发生了一个碱基缺失(胞嘧啶的缺失)。
[0082]本发明所述的treca-2基因优选为包含由序列编号4所示的碱基序列构成的多核苷酸的0RF，但是只要包含相当于该部分的部分，就可以为任意基因。例如，在该ORF中加入5’和3’UTR而得的基因也包含在本发明中。
[0083]本发明的treca-2基因包括例如编码包含在序列编号6中记载的氨基酸序列中I个或数个氨基酸发生了置换、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白质的突变体、诱导体。
[0084]由本发明所述的treca-2基因编码的treca-2蛋白是氨基酸序列如序列编号6所示地由上述TRECA蛋白发生了突变且抑制了 Cd吸收功能的蛋白质。treca-2蛋白是包含以序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质；或者是包含在以序列编号6所表示的氨基酸序列中I个或数个氨基酸发生了缺失、置换或添加后的氨基酸序列、且丧失了 TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质；或是与包含以序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质在氨基酸水平上显示出80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的同源性、且丧失了 TRECA蛋白的重金属输送功能的蛋白质。
[0085]<关于TRECA基因以及其突变型treca基因的重组载体>
[0086]基于本发明的重组载体是编入有上述TRECA基因、突变型的treca_l基因或treca-2基因中的任一种基因的重组载体。上述载体通过公知的转化方法被以能够表达的方式导入到目标植物中，由此使被编入到该植物中的基因或基因片段进行表达，从而能够获得本发明所述的蛋白质。
[0087]基于本发明的重组载体优选为双元载体(binary vector),其中,特别优选日本特开平10-155485号公报中记载的“大容量双元穿梭载体(binary shuttle vector)”。
[0088]<关于转化体>
[0089]在制作本发明的表达基因的转化体的情况下，将插入有上述基因的上述载体导入到目标植物细胞中。向该植物细胞中导入载体可使用公知的方法，例如可使用土壤农杆菌法、电穿孔法、基因枪法、显微注射法等，其中，最优选土壤农杆菌法。
[0090]上述本发明的表达基因的转化体并不限定为水稻，只要是具有控制根的Cd吸收的蛋白质、基因的植物，就没有限制。
[0091]〈关于基因标记>
[0092]本发明中的基因标记是根据上述TRECA基因与突变型treca基因的碱基序列的不同来识别个体的标记。
[0093]上述基因标记是根据碱基序列的不同来判断本发明的基因是否通过杂交或转化而被导入到另一水稻品种中的记号。以从水稻中提取出的基因组DNA为模版，使用具有根据基因组DNA的碱基序列而适当地选择的碱基序列的合成寡核苷酸作为引物，在使其混合后的反应液中进行PCR扩增反应,将包含其产物的反应液加入到例如琼脂糖电泳中后，可将扩增后的各种DNA片段区分，从而能够确认出该DNA片段对应于本发明的基因组DNA。
[0094]根据本方法，例如从越光(Koshihikari)等水稻品种和#3_6_4突变体中提取基因组DNA，根据能够将目标碱基部分(插入了碱基的部分)扩增的引物组的种类，将提取物的基于PCR的DNA扩增片段加入到电泳中后可分别区分为200~500bp和600~800bp，从而能够用于各个体的识别。在为#7-2-13突变体的情况下，通过不显现出DNA的扩增片段而能够与其他品种进行识别。需要说明的是，引物只要是能够将突变区域扩增的碱基序列，就没有限制。
[0095]在为#7-3-6突变体的情况下，利用能够将包含一个碱基缺失(一塩基欠損)区域的碱基部分扩增的引物组[例如[0s7g2572_F2976g(5’-TATATTCAGCCTGGGCAGATCGAG-3’:序列编号 7)、0s7g2572_R3815g(5’ -TGATGTACTGTCCAGCGTATGTGC-3’:序列编号 8)]等，通过PCR反应使DNA片段扩增，将带有因一个碱基缺失而新产生的限制性内切酶位点的DNA扩增片段利用特定的限制性内切酶(例如FspI)等加以切断处理，从而能够与其他品种进行。需要说明的是，引物只要是能够将突变区域扩增的碱基序列，则没有限制。另外，限制性内切酶只要能够将突变区域切断，就没有限制。
[0096]另外，在为#7-3-6突变体的情况下,将DNA扩增片段通过离心柱(spin column)法、玻璃珠吸附法等加以纯化，通过序列分析仪来读取扩增部分的DNA碱基序列，由此对本发明的DNA碱基序列中包含的一个碱基缺失进行检测，以该信息为基础开发SNP (单核苷酸多态性)标记，由此能够进行个体的识别。
[0097]<利用了重离子束的镉吸收抑制水稻突变体的制作>
[0098]对水稻种子照射重离子束。作为用于制作出镉吸收抑制水稻突变体的重离子束的辐射剂量，只要在不对水稻种子造成损伤且能够诱发突变的范围内，就没有特别限定，如果为能够高频度地诱发的碳离子束，则优选为20~60Gray的范围。
[0099]上述照射重离子束后的种子(第I代种子、以下简称为Ml。第2代以后也同样。)可供于通常的栽培，所得的M2种子可供于低Cd突变体的筛选。使用M2种子来筛选低Cd突变体的方法有下述的两种方法。
[0100]在M2的筛选中，将播种后经过10天的幼苗利用加入有Cd的水培液加以处理后，将幼苗的茎部切断，将从切断面流出的导管液利用原子吸光光度计等测定Cd浓度，筛选低Cd的突变体，此种方法在不仅为培养室等节省空间，而且在无法获得Cd污染土壤的情况下特别优选。另外，下一代种子(M3种子)可通过使从切断后的残株中长出的新芽(蘖)生长而加以确保。进而，通过使该种子(M3种子)自我繁殖，从而能够获得M4、M5等代发展了的低Cd吸收水稻。
[0101]在能够利用Cd污染土壤的情况下，将M2种子播种在培养土中后，将经过I个月的幼苗移植到Cd污染土壤中，经过收获、干燥、脱壳、磨皮的步骤而得到糙米，对于该糙米分析Cd浓度，筛选出糙米Cd浓度低的个体，从而能够得到低Cd吸收水稻(M3种子)。进而，通过使该种子进行自我繁殖，从而能够获得M4、M5等代发展了的低Cd吸收水稻，在这方面与上述水培栽培相同。[0102]<由低Cd吸收水稻的重金属转运蛋白基因的获得>
[0103]作为获得本发明所涉及的基因的方法，可举出杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)技术。前者例如制备与本发明的基因的碱基序列或其一部分特异地进行杂交的探针，筛选基因组DNA文库、cDNA文库。后者例如使用公知的日本晴的序列信息，设计通过PCR法使本发明的基因发生扩增的引物组(5，侧和3’侧)，将cDNA作为模版进行PCR，使两引物所夹持的DNA区域扩增，从而能够获得发明所涉及的基因。
[0104]<重金属转运蛋白的鉴定>
[0105]对于本发明所涉及的蛋白质来说，通过循环测序法来确定上述分离出的基因的碱基序列，从而能够根据密码子而将碱基序列转换成氨基酸序列。将该氨基酸序列对照水稻基因组数据库(RAP-DB)，从而能够鉴定出蛋白质。
[0106]<将低Cd吸收水稻突变体作为母本的新的低Cd吸收水稻的育种方法>
[0107]将具有根据本发明所得的DNA的低Cd吸收水稻突变体与已有的品种进行杂交，利用基于本发明的基因标记，由此能够效率良好地制作出新的低Cd吸收水稻品种。
[0108]作为该制作方法，具有以下的步骤。
[0109]1)将低Cd吸收水稻(A植物)与已有的水稻品种(B植物)进行杂交而作出Fl。
[0110]2)使上述Fl与上述B植物杂交。
[0111]3)从杂交后的植物中利用基因标记筛选出具有低Cd基因的个体。
[0112]4)通过与B植物重复地杂交的“回交”，而有目的地将A植物所具有的低Cd基因(例如treca-Ι基因或treca-2基因)导入到B植物中。
[0113]5)此时，为了从多数回交个体中仅筛选出具有低Cd基因的个体，能够活用基因标记。本发明的基因标记能够识别具有低Cd基因的个体及其以外的个体。
[0114]6)在筛选上述个体时，使用从幼苗阶段的茎叶、根中提取出的基因组DNA即可。
[0115]7)反复与B植物进行杂交，用标记筛选出进入有低Cd基因的个体，由此能够制作出基因组结构的大部分为B植物，仅Cd吸收为A植物的遗传性状的新品种(例如低Cd的Akitakomachi (?>吞亡二 t 怒))。
[0116]8)B植物可以为粳稻(Japonica)种，也可以为籼稻(Indica)种。
[0117]实施例
[0118]以下，通过实施例对本发明的内容进一步具体地示出，本发明并不限于本实施例的记载。
[0119]<实施例1 一 Cd吸收少的水稻突变体的筛选>
[0120](重离子束照射)
[0121]使用独立行政法人日本原子力研究研发机构高崎量子应用研究所的TIARA，将经重离子束照射(碳离子、320MeV，40Gy)后的水稻(品种越光(Koshihikari))种子(该种子为第I代种子，以下简称为M1，而将第2、第3代等称作M2、M3等。)3500粒播种在培养土(住友化学公司制、商品名> Y > I号)中，将所得的幼苗逐个地移植到(独)农业环境技术研究所所有的水田田地中，通过(独)农业环境技术研究所的例行的栽培管理而由各个体获得M2种子。将所得的M2种子约100，000粒全部混合，供试于以下的低Cd突变体的筛选步骤。
[0122](低Cd突变体的筛选方法以其I一导管Cd浓度为指标的简易筛选法)[0123]将M2的催芽种子播种在底面开孔为3mm 口径的孔的96孔的PCR板中，使板载于由聚苯乙烯泡沫塑料制成的漂浮台上，置于加入了木村B水培液(1/2浓度)的20L容量的盛装容器中。
[0124]将播种后经过10天的幼苗在加入了 0.1ppm的Cd浓度后的水培液中处理4天。处理后，将各个体的茎部在距离板2cm上部切断，使从切断面流出的导管液吸入到脱脂棉中，通过离心分离(2，OOOrpm, I分钟)，仅回收导管液。对于所选取使用的板，在96孔PCR板的底部开出2mm 口径的孔，填充脱脂棉后，与未开孔的板二板相重叠。使导管液吸入到脱脂棉中,通过离心分离(2，000rpm、l分钟)，回收到下方的板处。
[0125]通过上述回收的导管液在用0.1M硝酸稀释50~200倍后，利用原子吸光光度计(安捷伦科技公司制、商品名；speCtrAA220Z)测定Cd浓度。需要说明的是，与从越光(Koshihikari)收集的导管液的Cd浓度相比，仅回收显示为其1/5以下的Cd浓度的个体，为了易于产生蘖(从茬中长出的新芽)而确保下一代种子(M3)，移植到培养土中后进行收集。
[0126]通过上述方法，对约3，000个体进行Cd处理，从其中筛选生育与越光同等、且导管 Cd 浓度为越光的 1/5 ~1/20 的 4 种突变体(#3-5-20, #6-4-10, #11-6-12，#12-3-5)，另外，通过上述方法收集M3种子。将该突变体的导管Cd浓度示于表1。需要说明的是，在表I中，在同一板上分别对所栽培的越光与突变体进行比较。
[0127]【表1】
【权利要求】
1.一种基因，其包含下述(A)至(C)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白: (A)由序列编号2所表示的DNA碱基序列， (B)在序列编号2中记载的碱基序列中1个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的碱基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列， (C)与序列编号2中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
2.一种基因，其包含下述(D)至(F)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白: (D)由序列编号3所表示的DNA碱基序列， (E)在序列编号3中记载的碱基序列中I个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的碱基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列， (F)与序列编号3中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
3.一种基因，其包含下述(G)至(I)中的任一个碱基序列且编码与镉吸收的控制相关的转运蛋白: (G)由序列编号4所表示的DNA碱基序列， (H)在序列编号4中记载的碱基序列中I个或多个碱基发生了缺失、置换或添加的碱基序列，并且是编码控制铺吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列， (I)与序列编号4中记载的碱基序列在严格的条件下进行杂交、且编码控制镉吸收的蛋白质的基因的DNA喊基序列。
4.一种转运蛋白，其包含下述(J)至(L)中的任一个氨基酸序列且与镉吸收的控制相关: (J)序列编号I中记载的氨基酸序列， (K)在序列编号I中记载的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列， (L)与序列编号I中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
5.一种转运蛋白，其包含下述(M)至(O)中的任一个氨基酸序列且与镉吸收的控制相关: (M)序列编号5中记载的氨基酸序列， (N)在序列编号5中记载的氨基酸序列中I个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列， (O)与序列编号5中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
6.一种转运蛋白，其包含下述(P)至(R)中的任一个氨基酸序列且与控制镉吸收相关: (P)序列编号6中记载的氨基酸序列， (Q)在序列编号6中记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列， (R)与序列编号6中记载的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制镉吸收的蛋白质的氨基酸序列。
7.—种重组载体，其包含所述权利要求1至3中任一项所述的DNA。
8.一种转化体，其是包含权利要求2或3所述的DNA的转化体、或者是缺失了权利要求1所述的DNA的转化体。
9.一种转化体，其通过使用所述权利要求7所述的重组载体而得。
10.一种基因标记，其包含所述权利要求1至3中任一项所述的DNA。
11.一种镉吸收抑制水稻，其中，所述权利要求4所述的蛋白质的表达受到抑制。
12.—种镉吸收抑制水稻，其中，所述权利要求2或3所述的基因编码的蛋白质进行表达。
13.根据权利要求11或12所述的镉吸收抑制水稻，其出穗、收获量、味道与水稻品种越光为相同程度。
14.根据权利要求11或12所述的镉吸收抑制水稻，其中，所述镉吸收抑制水稻的出穗比水稻品种越光早约2周左右。
15.权利要求11至14中任一项所述的镉吸收抑制水稻突变体的筛选方法，其包括下述(A)的步骤和(B)的步骤、或者包括(A)的步骤和(C)的步骤， (A)将照射重离子束后的第I代种子栽培在田地中并收集第2代种子的步骤， (B)将在所述(A)的步骤中得到的第2代种子栽培在含有Cd的水培液中，收集切除茎叶而分泌出的导管液，根据该导管液中所含的Cd浓度来筛选Cd吸收抑制水稻突变体，并且收集第3代种子的步骤。 (C)将在所述(A)的步骤中得到的第2代种子的幼苗个体栽培在Cd污染土壤中，根据第3代种子的Cd浓度来筛选镉吸收抑制水稻突变体的步骤。
16.—种镉吸收抑制水稻,其是通过所述权利要求11至14中任一项所述的镉吸收抑制水稻突变体与已有的水稻品种的杂交而得的。
【文档编号】C12N5/10GK103917646SQ201280054062
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2011年11月4日
【发明者】石川觉, 仓俣正人, 安部匡, 井仓将人, 中西启仁, 西泽直子 申请人:独立行政法人农业环境技术研究所