改进的重组人胆盐刺激脂酶制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及改进的重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL)制剂，包括适于形成rhBSSL的冻干制剂的制剂、rhBSSL的冻干制剂本身、rhBSSL的单位剂型和rhBSSL的重建制剂。本发明的制剂包含rhBSSL、结晶填充剂和是与所述结晶填充剂不同的化学实体的非晶稳定剂。本发明的制剂具有一种或多种期望的性质，包括涉及在溶液中的稳定性、减少聚集和/或不溶性聚集体的形成的那些。本发明的冻干制剂具有药学实用性，特别是用于向人类婴儿施用rhBSSL。
【专利说明】改进的重组人胆盐刺激脂酶制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及改进的重组人胆盐刺激脂酶(recombinant human bilesalt-stimulated lipase, rhBSSL)制剂,包括适于形成rhBSSL的冻干制剂的制剂、rhBSSL的冻干制剂本身、rhBSSL的单位剂型和rhBSSL的重建制剂。本发明的制剂具有一种或多种期望的性质，包括涉及在溶液中的稳定性、减少的聚集和/或不溶性聚集体的形成的那些。本发明的冻干制剂具有药学实用性(pharmaceutical utility),尤其是向人类婴儿施用 rhBSSL。
【背景技术】
[0002]在成年人中，辅脂酶依赖性胰脂酶(colipase-dependentpancreaticlipase, PTL)是负责膳食甘油三酯(TG)消化的主要酶。在新生婴儿，且尤其是早产儿中，外分泌胰腺功能没有完全发育(Manson&Weaver, 1997 ；Arch DisChild Fetal Neonatal Ed, 76:206-211)。因此，相比成年人胰腺，婴儿中胰脂酶的表达较低(Lombardo, 2001 ；Biochim Biophys Acta, 1533:1-28 ；Li 等人 1007 ；Pediatr Res, 62:537-541)，相比成年人，在建立脂肪消化期间的管腔内的PTL活性要低得多(Fredrikzon等人,1978 ；Paediatr Res, 12:138-140)且脂肪吸收不良并不少见(Carnielli 等人，1998 ；Am J Clin Nutr67:97-103 ； Chappe 11 等人，1986 ；J Pediatr, 108:439-443)。Lindquist 和 Hernell(1990 ;Curr Opin Clin Nutr MetabCare, 13:314-320)已综述了生命早期中脂类的消化和吸收的主题。
[0003]在出生时，人类胎儿从以葡萄糖为主的能量供应转换为以脂类为主的能量供应，因为脂肪或更具体的TG作为新生儿的主要能量物质，其构成了人乳(human milk)和大多数婴儿配方食品(infant formulae)中总能量的一半。因此,膳食TG的有效消化和吸收对婴儿生长和发育是至关重要的。在母乳喂养(breastfed)的婴儿中，由宽特异性脂酶，胆盐刺激脂酶(BSSL) (EC3.1.1.13)补偿低PTL活性，胆盐刺激脂酶(BSSL)从泌乳乳腺分泌至乳中以及从外分泌胰腺分泌。在早产儿中，母乳进食期间母乳似乎提供了十二指肠内含物中BSSL的主要部分(Fredrikzon等人，1978)，且母乳喂养的婴儿比配方食品喂养(formula-fed)的婴儿更有效地消化和吸收脂肪以及重要地长的长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA) ( Bernback等人，1990 ；J Clin Invest, 85:1221-1226 ；Carnielli 等人，1998)。
[0004]人乳作为足月儿以及早产儿营养来源的优势已在许多研究和专家小组的建议中被证明。因此，世界范围内推荐的喂养方法是母乳喂养。然而，由于医学原因，母乳喂养或喂食母亲自己的母乳并不总是可能的或推荐的，且由于一些其它的原因可能不会进行母乳喂养。在婴儿不是母乳喂养的情况下，通常使用婴儿配方食品或库存的和非库存的巴氏消毒的和/或冷冻母乳。然而，在某些方面，对新生儿来说所有这些在营养上都是次优的(suboptimal)。
[0005]由于病毒(人类免疫缺陷病毒[HIV]、巨细胞病毒[CMV]、肝炎)感染和较低程度的致病菌的传播的风险，在所谓乳库(milk bank)中使用的供体乳在使用前通常进行巴氏消毒。然而，BSSL在人乳的巴氏消毒过程中被灭活(BjdrkSten等人，1980 ；Br MedJ, 201:267-272);其也不存在于任何现有的为早产的或足月新生儿提供营养的许多不同的配方食品中。相比巴氏消毒的母乳，已显示在喂养新鲜母乳的婴儿中脂肪吸收、体重增加和线性生长更高(Andersson 等人 2007 ;Williams 等人，1978 ；Arch Dis Child43:555-563)。这是为什么倡导不能喂养其自己母亲的乳汁的新生儿、尤其是早产儿应喂养来自其他母亲的非巴氏消毒的乳汁的一个原因(Bjdrksten等人，1980)。
[0006]如由BUickbe丨名和 Hernell (1981 ;Eur J Biochem, 116:221-225)和ffang&Johnson(1983)报道的，已将天然人乳BSSL(hBSSL-ΜΑΜ)纯化至均一性，且Nilsson (1990 ；Eur J Biochem, 192:543-550)鉴定了人 BSSL 的 cDNA 序列并在 W091/15234和TO91/18923中公开。来自数个实验室的表征和序列研究表明，蛋白质hBSSL-MAM和胰羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase,CEH)(也称为胰BSSL) 二者是同一基因的产物(例如，Baba 等人，1991 ;Biochem, 30:500-510 ；Hui 等人，1990 ；FEBS Lett, 276:131-134 ；Reue等人，1991 ；J Lipid Res, 32:267-276)。在分离cDNA序列之后，已在包括转基因绵羊(rhBSSL-OVI)中产生了 rhBSSL 及其变体；例如在 US5716817、W094/20610 和 W099/54443中描述的。
[0007]Andersson 等人，2007 (Acta Paediatr96:1445-1449)报道了显不母亲自己的乳汁的巴氏消毒降低了早产儿的脂肪吸收和生长的随机研究，并提出这些影响是由于基于乳汁的BSSL经由巴氏消毒的灭活。最近，两个随机和对照临床试验报道了，向巴氏消毒的母乳或婴儿配方食品添加rhBSSL并施用至早产儿，显示这些婴儿的生长速度的统计学显著的改善。例如，如由Maggio等人在“The Power or ProgrammingConference2010:1nternational conference on developmental origins of health anddisease”, Munich, 2010 年 5 月 6-8 日中展不的，及如由 Carnielli 等人在“The3rdcongressof the European Society of Paediatric Societies，，，Copenhagen, 2010 年 10 月 24 日中展示的。后者的展示还报 道了相比具有安慰剂的婴儿配方食品，当将rhBSSL添加到婴儿配方食品时，总脂肪吸收系数(CFA)及二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)-两种医学和发育重要的长链多不饱和脂肪酸酸(LCPUFA)的改善的肠道吸收趋势中小的但非统计学显著的增加。
[0008]如上所述，来自母乳的BSSL是与由成熟的人胰腺产生的CEH相同的脂酶，其对成年人中TG的消化是重要的。因此，rhBSSL也已被开发作为用于成年人中由于慢性胰腺炎或囊性纤维化(CF)的外分泌胰腺功能不全(PI)的疗法(例如，Strandvik等A , 2004 ； 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI ;摘要发表于Pediatr Pulmonol，S27:333)。最近已宣布，用rhBSSL的口服混悬液(其中描述为“布塞脂酶a (bucelipase alpha)”)，以170mg每天3次的剂量持续5_6天，以评价对患有CF和PI的成年患者脂肪吸收的影响的另外的II期试验(临床试验.政府标识号 NCT00743483)已完成，且结果展不在第 34 届 European Cystic Fibrosis SocietyConference, Hamburg, Germany, 2011 年 6 月 8 日至 11 日中。
[0009]随着rhBSSL的治疗效用的越来越多的证据，提供具有特定属性的、和/或可用于向成年人或向婴儿、特别地向早产儿施用的用于制药用途的rhBBSL的制剂将是期望的。例如，提供显示改善的或延长的稳定性，例如在减少的高分子量聚集体的形成方面；具有实用的或方便的存储条件；具有更可靠和更均匀的重建属性；显示较长的保质期；具有适合于制造或包装的特征；和/或具备其它期望属性的rhBBSL的制剂将是期望的。
[0010]治疗性蛋白质通常被提供为冻干制剂，该冻干制剂包含一定量的感兴趣的蛋白质及一种或多种制药赋形剂，例如填充剂(bulking agent)、稳定剂、和/或盐。冻干(还称为冷冻干燥)指的是使用低的温度和压力以通过升华(即从固态到蒸汽而不通过液相的相的变化)从液体制剂中除去溶剂通常为水的过程。冻干通常包括三个基本步骤:(I)冷冻；
(2)一级干燥(primary drying);和(2) 二级干燥(secondary drying)。
[0011]冷冻干燥通常被认为对生物分子例如蛋白质的生物活性是破坏性的。损害程度随着不同生物分子和不同条件有很大差别，且不同的研究者已研究了不同的系统。水溶液的冷冻可造成溶质浓度或pH的初始增加，相比冷冻本身其对不稳定的蛋白质可更具破坏性。填充剂可被用于旨在增强固体团块(solid cake)的形成和干燥能力，或改善其药物优美性(elegance)。稳定剂可被用于旨在稳定生物分子的活性，取决于系统而具有有限的且不同程度的成功。Crowe,等人(1987 ；Biochem J ；242:1-10)描述了通过糖类稳定干燥的磷脂双分子层和蛋白质，并还在“The trehalose myth revisited:1ntroduction to a symposiumon stabilization of cells in the dry state”Cryobiology43, 89-105 (2001)中综述了细胞的海藻糖稳定机制的理解。
[0012]不同的研究人员已报道了使用多种赋形剂和赋形剂的组合以保护多种生物分子，包括以下实例。
[0013]W003/009817 描述了使用甘露醇或甘氨酸作为填充剂，以形成IGG抗体的稳定的冻干制剂。
[0014]W02006/075072描述了用于生物传感器的多种酶包括脂酶的冷冻干燥的制剂。甘
氨酸和甘露醇在其中用作结晶填充剂，而蛋白质通常呈非晶态。
[0015]在EP1932519中，描述了骨形态发生蛋白特别是重组人生长和分化因子(rh⑶F)的冻干制剂，包括包含甘露醇的制剂及包含约PH4的甘氨酸的rhGDF的单独制剂。
[0016]W02006/023665描述了 IL-1拮抗剂制剂，包括包含5_50mg/mL的蛋白质和0.25-3.0%的甘氨酸作为冻干保护剂(Iyoprotectant)的预冻干制剂。
[0017]Chang等人(1996 ；Pharm Res, 13:243-249)描述了重组人白介素-1受体拮抗剂(rhlL-lra)的稳定的冷冻干燥的制剂的形成，包括测试甘露醇或甘氨酸作为填充剂与非晶蛋白质稳定剂尤其是蔗糖组合使用。
[0018]Hirakura等人(2004 ；Int J Pharm ；386:53-67)研究了在冷冻过程中温度变化对含有磷酸钠(10mM，pH7.0)和甘氨酸(300mM)的重组人白介素_11 (rhIL-11 ；5mg/mL)的冻干制剂的影响。
[0019]Leuckel 等人(1998 ;Pharm Dev and Tech3:325_336)研究了甘氨酸、赖氨酸-HCl或甘露醇作为结晶填充剂与非晶稳定剂蔗糖或海藻糖组合对冷冻浓缩物和冻干物的属性的影响。在没有任何蛋白质存在下，取决于赋形剂的特定组合和其浓度比，总有一个赋形剂能够形成晶体。
[0020]Meyer 等人(2009 ；Eur J Pharm Sci, 38:29-38)研究了填充剂对冻干的抗 TNF 鼠(murine)单克隆IgG的稳定性的影响。评价了鹿糖作为稳定剂与填充剂甘露醇或甘氨酸组合对抗体稳定性的影响。[0021]Tian等人(2007 ；Int J Pharmac, 335:20-31)评价了氨基酸制剂中人源化单克隆抗体的稳定性。测试了抗CDlla和抗IgE抗体中组氨酸、精氨酸、甘氨酸或天冬氨酸的保护作用。
[0022]W099/27983描述了当使用时较少“喷出(blow-out) ”的含有人生长激素的冷冻干燥制剂的一剂注射(one-dose syringe)。每单位剂量包含少于1.4mg的蛋白质和各种比例的其它赋形剂，包括约0.2mg的甘氨酸和1.1mg的甘露醇/mg蛋白质,并且还包括磷酸钠和
磷酸二钠。
[0023]W02006/081320描述了适于冷冻干燥的液体制剂，其包含至少20mg/mL的蛋白质、以小于I的重量:重量比的结晶填充剂和非晶溶质。甘露醇和甘氨酸在其中被描述为常规的“结晶填充剂”，而且它们还可以被用作稳定剂，只要其在冷冻干燥过程之后保持非晶态。一个实例在液体制剂中包括至少2.0% w/v的稳定剂。
[0024]US2006/0275306描述了从液体制剂获得的多种冻干的抗-1gG或抗-HER2抗体制剂，包括包含21mg/mL抗体与分别以250/25mM或55/276mM的甘露醇/甘氨酸的抗体制剂。
[0025]Pyne等人(2003 ；J Pharm Sci92:2172-2283)研究了甘露醇-甘氨酸系统中的溶质结晶及其对冷冻干燥制剂中蛋白质稳定的影响。在冷冻物质中甘露醇和/或甘氨酸晶体的形成受多种因素的影响，包括冷冻速率、液体预冻干制剂中甘露醇和甘氨酸的相对浓度和磷酸盐缓冲液的存在/浓度。
[0026]W02007/112757公开了用于从多种液体制剂包括pH7.9 (pH范围从7.5到8.5)的含有3.67mM Na2HPO4,27mM甘氨酸、250mM甘露醇的本体溶液，浓缩多肽包括重组人胆色素原脱氨酶(rhPBGD)以形成此 蛋白质的冻干制剂的过程。
[0027]这些研究者报道了使用多种不同的赋形剂或其组合的不同程度的成功，如通过多种方法对多种生物分子和蛋白质测量的。这些研究者都未报道rhBSSL制剂。
[0028]EP0317355总体公开了膳食组合物，其包含来自第一来源的营养基(nutritionalbase)，该营养基包含脂肪且缺乏胆盐刺激脂酶；和来自第二来源的有效量的胆盐刺激脂酶。
[0029]W091/18923总体公开了包含重组人胆盐刺激脂酶的药物组合物，W094/20610总体请求保护了包含人胆盐刺激脂酶变体的药物组合物，且W099/54443总体公开了包含从转基因动物制备的人胆盐刺激脂酶的药物组合物。在每个例子中都描述了此类药物组合物可用于改善早产出生的婴儿中的膳食脂类的利用率或用于治疗与胰腺功能不全相关的病理病症例如用于治疗囊性纤维化。
[0030]共同待审的W02012/052059和W02012/052060 (其内容在此通过引用整体被并入)公开了重组人胆盐刺激脂酶的药物组合物的制备和在早产人类婴儿中增加生长速率和/或增加某些LCPUFDA的吸收的用途。其中公开的单位剂量是冷冻口服溶液，包含溶解于1.3mL注射用水的15mg/mL重组人胆盐刺激脂酶。单位剂量从溶解于注射用水的冻干的松散(bulk)重组人胆盐刺激脂酶制成的溶液的等份制备。简而言之，冻干的松散重组人胆盐刺激脂酶通过以下获得:使用重组CHO细胞产生蛋白质，使用多个步骤包括阴离子交换层析、渗滤、浓缩、和最后的冷冻干燥从细胞纯化重组蛋白质。由于rhBSSL药物物质冻干自rhBSSL的磷酸盐/氯化钠缓冲的本体溶液(bulk solution),冻干制剂和成品单位剂量还包含磷酸二氢钠和氯化钠。[0031]因此,存在关于提供生物分子诸如蛋白质的冻干保护(Iyoprotection)的赋形剂的最佳组合是什么的相矛盾的证据，且不存在关于那些用于或形成包含rhBSSL的冻干制剂的具体指导。不是赋形剂的任一组合都最适合于所有蛋白质，而是需要有效程度(significant degree)的实验以获得研究中蛋白质的期望的结果。对适于rhBSSL的一种或多种药学上可接受的赋形剂，包括在冻干、储存、和/或使用期间保护蛋白质的赋形剂，或提供其它期望属性包括保质期、制造和/或重建特征、或一个或多个如本文描述的其它属性的赋形剂或其组合存在需求。
[0032]发明简述
[0033]本发明的不同的方面和实施方案提供了上述一个或多个技术问题的解决方案，如在本文和/或权利要求中定义的或另外公开的。通常地，且通过简述的方式，本发明的主要方面可被如下描述:
[0034]在一方面，本发明涉及适于冻干的制剂，所述制剂包含重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL);结晶填充剂；及是与所述结晶填充剂不同的化学实体的非晶稳定剂。
[0035]在另一方面，本发明涉及通过本发明的液体制剂冻干获得的冻干制剂，其中所述冻干制剂包含rhBSSL、结晶填充剂和非晶稳定剂。在相关的方面，本发明还涉及此类冻干制剂的单位剂量。在其它相关的方面，本发明还涉及制备此类冻干制剂的方法，并涉及通过此方法获得的冻干制剂。
[0036]在又另一方面，本 发明涉及制备rhBSSL的重建制剂的方法，所述方法包括以下步骤:提供本发明的冻干制剂或单位剂量；和在液体中重建所述冻干制剂或单位剂量。在相关的方面，本发明涉及rhBSSL的重建制剂，包括:(i)以约IOmg和约20mg之间的绝对量存在的所述rhBSSL ； (ii)以约27mg和约62mg之间的绝对量存在的甘露醇；且(iii)以约2mg和约6mg之间的绝对量存在的甘氨酸；且其中所述制剂在液体婴儿喂养品中重建，且所述重建制剂具有约6.4和约7.4之间的pH。
[0037]在另外的方面，本发明涉及甘氨酸稳定存在于冻干制剂中的rhBSSL的用途，所述冻干制剂还包括不是甘氨酸的结晶填充剂，其中:所述甘氨酸基本上以非结晶形式存在于所述冻干制剂中；和/或所述冻干制剂以约0.2mg/mg所述rhBSSL和约0.3mg/mg所述rhBSSL之间的相对量包括所述甘氨酸。
[0038]在又另外的方面，本发明涉及减少和/或最小化存在于液体婴儿喂养品中的rhBSSL的不溶性聚集体形成的方法，所述方法包括以下步骤:提供本发明的冻干制剂或单位剂量；和在液体婴儿喂养品中重建所述冻干制剂或单位剂量。
[0039]在特定的方面，本发明还涉及确定rhBSSL聚集减少的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供本发明的冻干制剂或单位剂量；(ii)储存所述冻干制剂或单位剂量 '及(iii)在一个或多个时间点确定所述冻干制剂或所述单位剂量中所述rhBSSL的高分子量百分比(% HMW)的水平，从而确定所述rhBSSL的聚集水平。
[0040]附图简述
[0041]胤I显示于+5°C在O和18个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性(通过由SE-HPLC检测的集成主峰(integrated main peak)量化):(a)显示集成主峰的绝对％的减少；及(b)显示集成主峰相对％减少的减少(每种制剂第O个月的主峰设定为100% )。存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度的一般种类由标绘符号的阴影法指不，以实心符号表不77mM的“高”甘氨酸浓度，空心符号(open symbol)表示OmM的“低”甘氨酸浓度，且阴影线符号表示27mM(对于N6和N7)和33mM(对于N4)的
“中等”甘氨酸浓度。
[0042]Ml显示于+25°C在O和18个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性(通过由SE-HPLC检测的集成主峰量化):(a)显示集成主峰的绝对％的减少；及(b)显示集成主峰相对％减少的减少(每种制剂第O个月的主峰设定为100% )0使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0043]显示于+40 °C在O和9个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性(通过由SE-HPLC检测的集成主峰量化):(a)显示集成主峰的绝对％的减少 '及(b)显示了集成主峰相对％减少的减少(每种制剂第O个月的主峰设定为100% )0使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0044]Si显示于+5°C在O和18个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率(通过由SE-HPLC检测的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)显示使用总的集成HMW峰的绝对％的速率；及(b)显示使用总的集成HMW峰的相对％增加的速率(每种制剂第O个月的总HMW峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0045]_显示于+25°C在O和18个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率(通过由SE-HPLC检测的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)显示使用总的集成HMW峰的绝对％的速率；及(b)显示使用总的集成HMW峰的相对％增加的速率(每种制剂第O个 月的总HMW峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0046]厘卫显示于+40 °C在O和9个月之间的储存期间，实验AH7507的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率(通过由SE-HPLC检测的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化):(a)显示使用总的集成HMW峰的绝对％的速率；及(b)显示使用总的集成HMW峰的相对％增加的速率(每种制剂第O个月的总HMW峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0047]Ml显示从实验AH7507的冻干制剂的N4、N5、N6和N7获得的PXRD图样的叠加。箭头标记对应于被发现只存在于制剂N5的结晶的β-甘氨酸的峰。
[0048]Μ8显示代表于+40°C储存9个月后，实验AH7507制剂的预冻干制剂中的rhBSSL聚集(通过由SE-HPLC检测的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化)对甘氨酸浓度之间的关系的散点图。存在于每种预制剂中的甘露醇的浓度由标绘符号的阴影法指示，以实心正方形表示307mM的“高”甘露醇浓度，空心正方形表示132mM的“低”甘露醇浓度，及阴影线正方形表示220mM的“中等”甘露醇浓度。
[0049]图9显示基于来自在+5°C和+25°C下储存18个月后的实验AH7507的制剂的数据,MLR模型的通过SE-HPLC检测的集成主峰的系数图。
[0050]图10显示来自被用于分析通过SE-HPLC检测的来自在+5°C下储存18个月后的实验AH7507的制剂的集成主峰的MLR模型的等值面(rhBSSL单体)。
[0051]图11显示基于来自在+5°C和+25°C下储存18个月后的实验AH7507的制剂的数据，MLR模型的通过SE-HPLC检测的所有集成高分子量(HMW)峰的和的系数图(rhBSSL聚集体)。
[0052]图12显示来自被用于分析通过SE-HPLC检测的来自在+5°C下储存18个月后的实验AH7507的制剂的所有集成高分子量(HMW)峰的和的MLR模型的等值面(rhBSSL聚集体)。
[0053]胤显示储存于+5°C在O至12个月储存后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性-通过由SE-HPLC检测的集成主峰量化:(a)集成主峰的％减少 '及(b)集成主峰的相对％减少(每种制剂第O个月的主峰设定为100% )。注意，对于实验AH7517，仅收集了第0、6、9和12个月时的数据。存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度的一般种类由标绘符号的阴影法指示，以实心符号表示56mM的“高”甘氨酸浓度，空心符号表示OmM的“低”甘氨酸浓度，及阴影线符号表示44mM(对于G2)和50mM(对于G3)的“中等”甘氨酸浓度。
[0054]胤Ii显示在+25°C储存O至12个月后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性-通过由SE-HPLC检测的集成主峰量化:(a)集成主峰的％减少；及(b)集成主峰的相对％减少(每种制剂第O个月的主峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示收集的时间点和存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0055]图15显示在+40°C储存后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL单体的不稳定性-通过由SE-HPLC检测的集成主峰量化:(a)储存O至12个月后集成主峰的％减少。注意，对于实验AH7517，仅收集了第0、3和6个月时的数据；及(b)储存O至6个月后集成主峰的相对％减少(每种制剂的第O个月的主峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0056]图16显示在+5 °C储存O至12个月后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率-通过由SE-HPLC检测的所有集成高分子量(HMW)峰的和量化:(a)总的集成HMW峰的增加 '及(b)总的集成HMW峰的相对％增加(每种制剂的第O个月的总HMW峰设定为100% )。注意，对于实验AH7517，仅收集了第0、6、9和12个月时的数据，并使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0057]胤II显示在+25°C储存O至12个月后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率-通过由SE-HPLC检测的所有集成高分子量(HMW)峰的和量化:(a)总的集成HMW峰的增加 '及(b)总的集成HMW峰的相对％增加(每种制剂的第O个月的总HMW峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示收集的时间点和存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0058]图18显示在+40°C储存后的实验AH7513和AH7517的冻干制剂的rhBSSL聚集的速率-通过由SE-HPLC检测的所有集成的高分子量(HMW)峰的和量化:(a)储存O至12个月后总的集成HMW峰的增加。注意，对于实验AH7517，仅收集了第0、3和6个月时的数据；及(b)储存O至6个月后总的集成HMW峰的相对％增加(每种制剂的第O个月的总HMW峰设定为100% )。使用与上文描述相同的阴影法指示存在于每种预制剂中的甘氨酸浓度。
[0059]图19显示PXRD图样:获得自:(a)实验AH7513的rhBSSL Fl的冻干制剂。箭头标记对应于该制剂中存在的结晶的甘氨酸的峰；及(b)实验AH7517的rhBSSL G3的冻干制剂。箭头标记本来将指示结晶的甘氨酸的存在的峰的预期位置(在此制剂中丢失)。[0060]图20显示在不同温度下储存12个月的rhBSSL冻干制剂的SDS-PAGE的结果，以及它们各自的高分子量(HMW)聚集体的程度:(a)实验AH7513的制剂Fl和F2 ;及(b)实验AH7517的制剂G2和G3。
[0061]本发明的公开内容
[0062]本发明，及其特定的非限制性方面和/或实施方案，可更详细地总体描述如下:
[0063]在一方面，本发明涉及适于冻干的制剂，所述制剂包含:(i)重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL) ；(ii)结晶填充剂 '及(iii)是与所述结晶填充剂不同的化学实体的非晶稳定剂。
[0064]除非另有说明，如下文叙述的术语一般都通过其通用含义来理解。
[0065]在本说明书和权利要求中使用术语“包括(comprising) ”或“包括(comprising
of)”的情况下，其不排除其它元素。为了本发明的目的，术语“由......组成(consisting
of) ”被认为是术语“包括”的一个优选实施方案。如果下文中一个组被定义为包括至少一定数目的实施方案，那么这也被理解为公开了优选由这些实施方案的全部和/或只有这些实施方案组成的组。
[0066]在本发明的环境中，术语“约(about)”或“约(approximately) ”表示本领域技术人员将理解仍确保所讨论特征的技术效果的准确度的区间。该术语通常表示从指定数值偏差±20%、± 15%、± 10%、以及优选±5%。如将被本领域普通技术人员领会的,对于给定技术效果的数值的特定此类偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然的或生物技术效果通常可具有比人造的或工程化技术效果更大的此类偏差。
[0067]在当提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一(a)”、“一(an)”或“该(the) ”的情况下，这包括该名词的复数，除非另外特别说明某些事。
[0068]1.冻干法概况
[0069]冻干(也称为冷冻干燥)指的是使用低的温度和压力以通过升华过程(即，从固态到蒸汽而不通过液相的相的变化)从液体制剂除去溶剂通常为水的过程。冻干通过减少一种或多种溶剂组分至不再支持化学反应或生物生长的水平，有助于稳定药物制剂。
[0070]冷冻干燥过程是已知的。在某些情况下，冷冻干燥在“多歧管(manifold) ”过程中进行，其中烧瓶、安瓿或小瓶(vial)被分别连接到多歧管或干燥罐的接口。在其它情况下，冷冻干燥作为“分批”过程进行，其中一个或多个类似大小的载有类似产物的容器被一起放置于盘式干燥器中，在“批量(bulk)”过程中，将产物倒入大容量盘(bulk pan)并被干燥作为单个单元。在终止之前将产物从冷冻干燥罐中移出且然后包装在气密容器中。本文所描述的发明可与任何这些过程组合使用。
[0071]一般来说，冻干法经历至少三个阶段:冷冻；一级干燥；和二级干燥。在某些情况下，在冷冻和一级干燥阶段之间包括退火步骤可以是期望的。
[0072]在典型的冷冻干燥过程的第一步骤中，蛋白质水溶液的样品被冷却至低于该产物的塌陷温度(collapse temperature),直到该溶液被冷冻。在一级干燥的第二步骤中，施加真空至冷冻物质，且在某些情况下，热量被传递到冷冻团块导致升华。一般来说，冷冻干燥被用于从溶液或制剂中除去水。由于发生升华，水蒸汽穿过冷冻团块到冷冻干燥罐中。由于温度升高，存在较高的饱和蒸气压，其导致增加的干燥速率。这导致缩短的冷冻干燥周期。在此阶段期间干燥温度的上限确保了产物的温度被保持低于该产物的塌陷温度。
[0073]在冷冻干燥期间，产物的“塌陷”与干燥制剂的减少的表面面积、体积的减小相关，且也可能与渐增的随后的重建时间相关。在冷冻干燥的物质塌陷事件中，尚未被除去的溶剂可成为被捕获的。这可非期望地降低终产物的稳定性及对其性能产生不利影响。塌陷温度是指物质软化至不能支撑其自身结构的点所处的温度。通常，随着溶剂水平经由升华而减少，塌陷温度升高。在含有蛋白质的大多数系统中，该温度的起始未被良好定义，并且可跨越一个温度范围而发生。因此，在较高的温度下将维持其较高的结构稳定性的物质可以允许较快的处理。因此，除了在随后的储存期间稳定蛋白质，该混合物的成分可在冷冻干燥过程中赋予稳定性。
[0074]除了在一级干燥期间升华的游离的冰，仍然存在大量的结合到产物的水分子。在二级干燥的第三步骤中，这些水被除去(被解吸)。因为所有的游离冰已在一级干燥中被除去，现在可显著地增加产物温度，而不必担心塌陷。二级干燥(解吸)实际上在一级阶段期间开始，但在升高的温度下(通常在30°C至50°C范围内)，解吸更加迅速地进行。二级干燥速率取决于产物温度。可将真空系统保持在一级干燥期间所用的相同的水平，或可被改变。二级干燥继续进行直到该产物具有长期储存可接受的含水量。取决于应用，充分干燥的产物的含水量一般在0.5%和3%之间。
[0075]通过冻干法的脱水完成后，蛋白质作为粉末或“块状物”被留下。通过减少块状物中的一种或多种溶剂组分(通常为水)至不再支持显著的化学或物理降解速率的水平，冻干法有助于稳定药物制剂。块状物的结构在允许物质(例如治疗性蛋白质和任何其它赋形剂)被重建方面是重要的。如果块状物具有小孔，在冷冻干燥过程期间水的除去可受到阻碍。结果，干燥过程是不完整的，且块状物具有高含水量。如果块状物上形成有大孔，干燥过程是更有效的，且块状物具有低含水量。
[0076]I1.制剂
[0077]如上所述，冻干法 是其中适于冻干的液体制剂经受冷冻干燥处理以获得冻干(冷冻干燥)的制剂的方法。冷冻干燥制剂中的内含物可根据活性剂和预期的施用途径而改变。液体制剂一般包括溶剂和溶质。溶质通常包括活性剂，和任选地一种或多种赋形剂。所得的冷冻干燥制剂包含非晶固体基质和少量的残余未冻溶剂。非晶固体基质包括活性剂，和任选地一种或多种赋形剂。
[0078]通常，制剂中不是溶剂或活性剂的任何组分都被称为“赋形剂”，在制剂中包括“赋形剂”的原因有多种，尽管许多赋形剂的主要功能是为活性成分提供稳定的液体环境，或在冷冻或干燥过程中保护活性剂。某些赋形剂可被用于实现制剂中的多种效果。例如，二糖，诸如鹿糖可作为冷冻保护剂、冻干保护剂、填充剂和张力调节剂(tonicity modifier)。当其它赋形剂存在时，赋形剂的表现可发生变化。一些组合具有正协同效应，其它组合则具有负协同效应。当共同作用的赋形剂的效应的和大于各个赋形剂的累加效应时发生正协同效应。当赋形剂组合的效应的和小于各个赋形剂的效应的和时出现负协同效应。下文提供了活性剂、溶剂和赋形剂的实例。
[0079]活性剂和重组人胆盐刺激脂酶:
[0080]如本文所用的，术语“药物制剂”是指包括至少一种活性剂，所述活性剂是重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL)或所述活性剂之一是重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL)的制剂两者。
[0081]作为本发明多个方面中的组分的重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL)，是本文所描述、定义或提及的蛋白质。例如，其包括本领域普通技术人员可识别为人胆盐刺激脂酶的多肽，其中所述人脂酶已从经调整或修饰(例如，通过重组基因技术)以产生此类多肽的非人类来源例如非人类生物体中产生或分离。
[0082]人胆盐刺激脂酶(BSSL)是以多种标识符或别名被知悉的酶；例如，“羧基酯脂酶(CEL) ”、“胆盐激活脂酶(BAL) ”、“胆盐依赖性脂酶(BSDL) ”、“羧酸酯酶”、“羧酸酯水解酶(CEH) ”，和一些其它别名和描述，如对本领域普通技术人员而言从信息来源诸如“GeneCards”(www.genecards.0rg)将容易可得的。从人乳(和胰腺)已鉴定了人BSSL的许多天然的氨基酸序列和同种型，并且已描述了许多不同的氨基酸序列(典型地，从cDNA或基因组序列预测的)；所有这些在本文都被包含在术语“人胆盐刺激脂酶”之内。例如，人胆盐刺激脂酶首先作为包含20至26个氨基酸信号序列的前体序列(precursorsequence),以及描述为具有722至733个氨基酸的蛋白质的成熟全长形式天然地产生(例如参见，Nilsson 等人，1990 ；W091/15234, W091/18923 ;由 cDNA 序列预测的多肽 GenBank提交 ID:X54457 ;GenBank ID:CAA38325.1 ;“CEL/BSSL” 的 GeneCards 条目；GenBankID:AAH42510.1 ；RefSeq ID:NP_001798.2 ；Swiss-Prot ID:P19835)。在另外的实例中，人胆盐刺激脂酶的其它较短的同种型在Venter等人(2001 ；Science, 291:1304-1351)；GenBnk ID:AAC71012.1 ;Pasqualini 等人(1998 ;J Biol Chem, 273:28208-28218) ；GenBankID:EAW88031.1 ;W094/20610 和Bliickbery 等人(1995 ；Eur J Biochem, 228:817-821)中被描述。
[0083]在特定实施方案中，人胆盐刺激脂酶包含具有包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的蛋白质。在其它特定实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂酶具有选自公开于以下的BSSL的成熟或前体形式的氨基酸序列=Nilsson等人，1990 ；W091/15234, W091/18923；RefSeq ID:ΝΡ_001798.2；GenBank ID:AAH42510.1 ；GenBankID:CAA38325.1 ;“CEL/BSSL”的 GeneCards 条目；Swiss-Prot ID:P19835。在另外的此类实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂酶包括具有公开于先前的参考文献中的任何序列或SEQID NO:2的至少720个连续氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。在其它实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂酶包括具有在SEQ ID N0:2或W091/15234中公开的至少从位置I至101的氨基酸序列，或在SEQ ID N0:2中公开的至少从位置I至535的氨基酸序列的蛋白质，例如公开于Hansson等人，1993 ；J Biol Chem, 35:26692-26698的“变体A”，其中此类蛋白质
具有胆盐结合和/或胆盐依赖性脂酶活性，如可通过例如在BlSekberg等人(1995 ；Eur JBiochem228:817-821)中公开的方法确定。
[0084] 因此，现在对于本领域普通技术人员将明显的是，在本发明的某些实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂酶的这些描述的形式的一种或多种可用于本发明的多个方面。另外，对于此类人员将明显的是，具有胆盐依赖性脂解活性的其它(重组)蛋白质(例如，如可通过公开于BMckberg等人，1995的方法确定的)，及氨基酸序列与本文描述的、定义的或提及的那些多肽序列相似的(重组)蛋白质，在本发明中也可具有效用，并因此也被术语“人胆盐刺激脂酶”包含。在某些此类实施方案中，蛋白质显示与本文中描述的、定义的或提及的序列跨越至少约30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733或750个氨基酸的超过90%,95%,98%,99%,99.5%的序列同一性。在其它实施方案中，可对本文公开的、定义的或提及的BSSL多肽序列之一进行一个或多个氨基酸取代。例如，可对SEQ ID N0:2中公开的序列进行1、2、3、4、5或直至10个氨基酸的取代、缺失或添加。此类氨基酸的改变可以是中性改变(诸如中性氨基酸取代)，和/或其可以以某种(期望的)方式影响蛋白质的糖基化、结合、催化活性或其它性质。具有此类取代的蛋白质，只要它们具有胆盐依赖性脂解活性，也将被本领域普通技术人员识别为本发明意义中的“人胆盐刺激脂酶”。
[0085]在 其它实施方案中，人胆盐刺激脂酶是从具有合适的核酸序列的核酸可表达的或本来由其编码。通过非限定性实例的方式，所述脂酶是从包含SEQ ID NO:1的位置151和2316之间的序列或公开于W094/20610或Nilsson等人(1990)的序列的核酸可表达的或本来由其编码。如还将被本领域普通技术人员领会的，“合适的核酸序列”还将包含先前的核酸序列的变体。例如，不会改变由三联体密码子编码的氨基酸的一个或多个核苷酸碱基的改变(诸如在第3个密码子位置处)也将是“合适的”。如果此类核酸序列的亚片段编码如本文所述的人胆盐刺激脂酶的(短的)同种型，则该亚片段也将是“合适的”。此外，编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的变体的蛋白质的核酸序列，诸如上文描述的那些，也将是“合适的”。因此，本发明设想了其中(重组)人胆盐刺激脂酶是由与包含SEQ ID N0:1的位置151和2316之间的序列的核酸或包含位置151和755位之间的序列的核酸杂交的核酸可表达或本来由其编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质具有胆盐依赖性脂解活性的实施方案。在某些此类实施方案中，在严格条件下进行杂交，诸如将被普通技术人员知晓的，以及在一般教科书例如 Joe Sambrook和 David Russell 的“Molecular Cloning:A LaboratoryManual” (CSHL出版)中描述的。
[0086]在特定实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂酶是通过本文描述的、定义的或提及的核酸表达而产生的。
[0087]本文描述的，定义的或提及的人胆盐刺激脂酶，在本发明的环境中是重组胆盐刺激脂酶(rhBSSL);即，其中所述人脂酶已由经调整或修饰的(例如，通过重组基因技术)以产生此类脂酶的非人类来源，诸如非人类生物体产生或从其中分离。在特定实施方案中，rhBSSL使用无细胞和/或体外转录-翻译技术从本文描述的、定义的或提及的分离的核酸分子产生。可选地,使用重组非人类生物体,其中所述非人类生物体包括此核酸的至少一个拷贝，并且其中所述核酸可被所述非人类生物体表达以产生期望的蛋白质:rhBSSL。例如，可使用重组细菌、藻类、酵母或其它真核细胞，并且在某些实施方案中，从此类重组细胞的培养物中制备rhBSSL。在其它实施方案中，可由经修饰的或特定选择的人细胞的身体外(extra-corporal)培养物,例如通过它们的体外培养物制备rhBSSL。在又其它实施方案中，rhBSSL可通过其从转基因动物例如转基因牛(cattle)、绵羊(sheep)、山羊(goat)或兔的乳汁的分离而制备。本领域普通技术人员将知晓可用于使用重组技术产生人胆盐刺激脂酶的许多技术。
[0088]已显示可从重组细胞培养物包括大肠杆菌(E.coli)、小鼠和仓鼠(Hansson等人，1993)以及巴斯德毕赤酵母(P.pastor is) (Trimple 等人,2004 ；Glycobiol, 14:265-274)细
胞的培养物产生重组人胆盐刺激脂酶。还已显示可从转基因小鼠的乳汁(Strdmqvist等人，1996 ;Transgen Res, 5:475-485)以及从转基因绵羊的乳汁(W099/54443)中产生和分离重组人胆盐刺激脂酶。在本发明的某些实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶从此类重组细胞的培养物或从此类转基因动物的乳汁中分离。在可选的实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶不是从转基因绵羊或转基因小鼠的乳汁中分离的重组人胆盐刺激脂酶。[0089]在本发明的特定实施方案中，从重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的表达产物中分离重组人胆盐刺激脂酶、由重组CHO细胞系产生重组人胆盐刺激脂酶、或可由重组CHO细胞系表达或可从其中分离重组人胆盐刺激脂酶。使用重组CHO细胞系表达系统产生此类脂酶，可产生展示特定结构、活性或其它特征性质，诸如一个或多个描述于共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060中的特征性质的rhBSSL，这两个申请的内容通过引用并入本文。以非限制性实例的方式，可用于本发明的rhBSSL可使用与本文的示例类似的或基本如本文示例中描述的或如共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060中描述的过程被分离，和/或展示与本文的示例类似的或基本如本文示例中描述的或如共同待审的申请 TO2012/052059 和 W02012/052060 中描述的特征。
[0090]在本发明的某些实施方案中，由国际非专有名称(InternationalNon-proprietary Name, INN)词干(stem) “布塞脂酶”鉴定了重组人胆盐刺激脂酶(参见WHO Drug Informational, 21:62，2007)，例如因为其具有其中示出的氨基酸序列。当参考SEQ ID N0:2使用时，本发明的重组人胆盐刺激脂酶可具有位置Cys64-Cys80和Cys246-Cys257 处的一个或多个二硫键，和 / 或在 Asn-187、Thr-538、Thr-549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631 和 Thr-642 处的一个或多个可能的糖基化位点处被糖基化(在一个此种实施方案中，图1.1中图示的)。在某些此类实施方案中，rhBSSL呈糖型(glycoform)，且例如可具有“布塞脂酶α ”的INN。
[0091]在本发明的其它特定实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶具有不同于天然人胆盐刺激脂酶(BSSL-MAM)和/或不同于例如在W099/54443中描述的已由从转基因绵羊的乳汁中分离产生的重组胆盐刺激脂酶(rhBSSL-OVI)的形式的结构、组成和/或其它特性。某些此种结构和/或组成差异、或其它不同的特性在共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060中被描述。以非限制性实例的方式，在某些此类实施方案中，可用于本发明的重组人胆盐刺激脂酶(基本)无其它乳蛋白质或乳汁组分。如基于本发明的公开内容将明显的是，在某些实施方 案中，在向人类婴儿施用之前将rhBSSL添加至基于乳汁的婴儿喂养品。因此，在此类实施方案中，“不含其它乳蛋白质或乳汁组分”将应用于在将重组胆盐刺激脂酶添加至所述基于乳汁的婴儿食品前不久(例如临添加之前)存在的重组胆盐刺激脂酶的该形式、组合物或制剂。例如，在此类实施方案中，包含rhBSSL或容易被提供用于添加至任何婴儿配方食品和/或巴氏消毒的母乳的rhBSSL的量的本发明药物组合物或试剂盒组分不含此类基于乳汁的污染物。在某些此类实施方案中，rhBSSL无乳汁酪蛋白和乳清蛋白，例如乳铁蛋白，或者无乳汁中天然的其它污染物，尤其是其中来源于人、绵羊或小鼠的乳汁的此类源自乳汁的蛋白质和其它污染物。在这些实施方案中，“无”任何特定此类蛋白质或污染物指通过常规检测方法未能够检测到此类蛋白质或其它污染物的实质的量。可选地，任何此类特定杂质可以以低于约5%、例如低于约2%、1%、0.5%或0.1%的水平存在或基本上或实质上不存在，或所有此类源自乳汁的蛋白质或其它污染物的全部以低于约5%,例如低于约2%、I %、0.5 %或0.1 %的水平存在或基本或实质上不存在。如本领域普通技术人员将理解的，从细胞培养物例如从重组CHO细胞中产生和分离的重组人胆盐刺激脂酶将被认为“无”此类基于乳汁的污染物。
[0092]在本发明的某些其它此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶具有大于约70%的纯度，例如大于约80 %、90 %或95 %的纯度。在特定的此类实施方案中，此类百分比纯度是总蛋白质的百分比纯度。如上所述，在可应用的实施方案中，纯度测量是在添加至任何婴儿喂养品或其它施用介质之前的含有所述脂酶的组合物的纯度测量。可通过RP-HPLC、SE-HPLC或SDS-PAGE (采用SypiORuby或银染色)技术确定此类纯度值。
[0093]在本发明的其它实施方案中，尤其是如果重组人胆盐刺激脂酶是使用(表达自)重组CHO细胞产生的，当使用时本发明的rhBSSL可通过一种或多种结构、活性或其它特性例如以下描述的那些被表征。基于本发明的公开内容及例如包括在共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060中描述的那些，确定此类结构、活性或其它特性的方法对本领域普通技术人员而言将是已知的。
[0094]在本发明另外的某些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶具有土土天然人胆盐刺激脂酶(BSSL-MAM)的糖基化水平(整体/全部)，和/或具有太土从转基因绵羊乳中分离的重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL-OVI)的糖基化水平(整体/全部)。糖基化的水平，诸如BSSL(或其样品)的单糖和/或唾液酸含量的水平可使用高pH阴离子交换色谱-脉冲电流检测(HPAEC-PAD)测量。在本发明特定实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶的总单糖含量(摩尔单糖/摩尔rhBSSL)在约20和100之间、约25和65之间或约25和55之间，例如在约40至45摩尔/(摩尔rhBSSL)。在本发明某些实施方案中，rhBSSL的总唾液酸含量(摩尔唾液酸/摩尔rhBSSL)在约20和35之间，例如在约25和30摩尔/(摩尔rhBSSL)之间。
[0095]在本发明的又其它某些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶具有不同于BSSL-MAM和/ 或不同于rhBSSL-OVI的糖基化模式，例如O-聚糖。可使用具有激光诱导荧光检测的毛细管电泳(CE-LIF)和/或HPAEC-PAD检测此类差异。在本发明特定实施方案中，rhBSSL可具有约20和50摩尔之间的N-乙酰神经氨酸(NANA = Neu5Ac)/摩尔rhBSSL [摩尔/(摩尔rhBSSL)]，例如约25和40摩尔/(摩尔rhBSSL)之间。用于本发明的rhBSSL可具小于约5摩尔N-羟乙酰神经氨酸(NGNA = Neu5Gc)/摩尔rhBSSL，例如小于约2摩尔/(摩尔rhBSSL)，或其中NGNA基本不可检测。用于本发明的rhBSSL可具有小于约20摩尔岩藻糖/摩尔rhBSSL，例如小于约10、小于约5、小于或约2摩尔/(摩尔rhBSSL)，并且在某些实施方案中，岩藻糖基本不可检测。用于本发明的rhBSSL可具有约5和25摩尔之间的半乳糖胺/摩尔rhBSSL，例如约10和20之间或约15和18摩尔之间/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有小于约10摩尔葡萄糖胺/摩尔rhBSSL，例如小于约5、小于约3或约2摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有约5和25摩尔之间的半乳糖/摩尔rhBSSL，例如约10和20之间或约15和18摩尔之间/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有小于约5摩尔葡萄糖/摩尔rhBSSL，例如少于约2摩尔/(摩尔rhBSSL)或其中葡萄糖基本不可检测。用于本发明的rhBSSL可具有约2和8摩尔之间的甘露糖/摩尔rhBSSL，例如约4和6摩尔之间/(摩尔rhBSSL)。在本发明特定实施方案中，rhBSSL可具有关于其如或基本如共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060的表1.1中所示的单糖和/或唾液酸含量的特征谱(profile)。
[0096]在本发明其它实施方案中，可用于本发明的重组人胆盐刺激脂酶在凝集素结合或Lewis-抗原结合测试的特征谱或量,例如分别在Bliiekberg等人(1995)和Landberg等人(1997)中描述的那些试验和特征谱方面与BSSL-MAM以及与rhBSSL-OVI不同。此类凝集素结合或Lewis-抗原结合测试可指示这些不同形式的BSSL之间的糖基化模式的差异。可使用其它技术鉴定和/或表征可用于本发明的重组人胆盐刺激脂酶。例如，rhBSSL可通过以下被表征(和/或与BSSL-MAM或与rhBSSL-OVI相区分):内切蛋白酶Lys-C消化，然后用具有定量UV检测(214nm处)的反相HPLC分析所得肽，并记录/检查所得色谱图。所得色谱图中的差异可归因于-并因此还反映了-包括rhBSSL的特定肽的糖基化的独特特征，其具有保留时间方面的特定差异。
[0097]在本发明又另外的实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶具有90KDa和75KDa之间的分子量。在特定的此类实施方案中，所述脂酶的分子量在约84KDa和86KDa之间，例如约85KDa。可通过常规技术包括MALDl-MS确定分子量。使用相同检测技术，通过比较，BSSL-MAM的分子量被测量为实质上较大(例如，约IOOKDa)，且rhBSSL-OVI的分子量被测量为实质上较小(例如，约78KDa)。
[0098]在本发明其它另外的此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶可包括具有不同氨基酸长度的序列的重组人胆盐刺激脂酶分子的群。在某些此类实施方案中，与最长或(预测的)全长形式(例如由SEQ ID N0:2所示)相比，以C末端1、2、3、4、5或直至10个氨基酸较短的形式存在的脂酶分子的量大于以此类最长或(预测的)全长形式存在的脂酶分子的量的50%。在某些此类实施方案中，约100%和500%之间的最长(或预测的全长)脂酶分子的量是作为较短脂酶分子例如从C末端短I或2个氨基酸存在的量。在特定的此类实施方案中，约200%和400%之间，例如约300%的最长(或预测的全长)分子(例如由SEQID NO: 2所示)的量，是作为较短脂酶分子例如从C末端短I或2个氨基酸存在的量。在特定实施方案或前述中，小于1%的最长(或预测的全长)所述脂酶分子的量，是作为短了2个氨基酸的脂酶分子存在的量。在其它实施方案中，在2至5倍之间，例如约3倍数目的最长(或预测的)所述脂酶分子以从C末端比此类最长(或预测的分子短1、2、3、4、5或直至10个氨基酸的形式存在。
[0099]在本发明又其它另外的此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂酶可具有比从乳汁中分离的BSSL和/或rhBSSL-OVI更大的比活性。例如，rhBSSL的比活性可以在高于BSSL-MAM和/或rhBSSL-OVI的比活性的约15%和35%，例如约20%或25%之间(基于质量)。测量人BSSL的比活性的技术将为普通技术人员所知晓并且包括使用丁酸4-硝基苯酯(PNPB)测定，如本文示例中一般描述的。BSSL的其它体外测定是已知的，例如通过使用阿拉伯树胶中乳化的甘油三油酸酯作为BSSL的底物并使用胆酸钠(IOmM)作为激活的胆盐(例如，如由 Bjjickberg和 Hernell, 1981 ;Eur J Biochem，116:221-225 描述的)。在特定实施方案中，在测量比活性之前，可通过例如使用肝素亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的技术将BSSL纯化至高纯度。
[0100]如普通技术人员将理解的是，用于本发明的重组人胆盐刺激脂酶可通过本文描述的或定义的一种以上的区别特征来表征，例如上述那些。例如，2个或多个(例如3、4、5或更多个)此类特征的组合可一起表征用于本发明的重组人胆盐刺激脂酶的特定实施方案。
[0101]在本发明该方面的某些实施方案中，所述rhBSSL以约lmg/mL和约35mg/mL之间的浓度存在；优选地，其中所述浓度为约10mg/mL和约15mg/mL之间；更优选地,其中所述浓度选自由下列构成的组:约llmg/mL ;约12mg/mL ;约13mg/mL ;和约14mg/mL。在可选的实施方案中，例如其中较低有效量的rhBSSL是期望的那些实施方案中，所述rhBSSL以约I和约5mg/mL之间；优选约2、3或4mg/mL的浓度存在。[0102]如现在将在普通技术人员的能力之内的，存在于制剂或组合物中的rhBSSL的量/浓度可以绝对量(例如，质量或摩尔量)和/或按照活性单位的数目表示。参考活性标准BSSL分子，可使用本文描述的PNPB测定容易确定rhBSSL的活性。活性rhBSSL的合适质量在以上给出的质量范围内。由于复合物蛋白质例如rhBSSL的分子量可例如由于糖基化的差异而不同，所述脂酶的量可以以除按照质量以外例如按照(活性)摩尔量的方式来定义。技术人员将容易地能够进行从特定mg量到对应的微摩尔量的其它转换。可选地，重组人胆盐刺激脂酶的量可按照脂酶活性以酶单位(U)表示，例如定义为在测定条件下催化形成I微摩尔产物/分钟的所述脂酶的量，例如，在诸如本文中描述的BSSL活性的体外测定中确定的。
[0103]溶剂
[0104]如之前讨论的，冻干法是借以将溶剂从液体制剂中除去的过程。如本文所用的，术语“溶剂”是指能够溶解或悬浮一种或多种溶质的制剂的液体组分。术语“溶剂”可以指单一溶剂或溶剂的混合物。用于药物制剂的常用溶剂为注射用水(WFI)。取决于制剂或冷冻干燥过程，在液体制剂中包括一种或多种有机溶剂可以是期望的。例如，在制剂中包括有机溶剂以增强一种或多种活性成分的溶解度可以是期望的。合适的有机溶剂的实例包括，但不限于，乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇、丙酮、环己烷和二甲基亚砜(DMSO)。
[0105]填充剂
[0106]填充剂的目的是向制剂提供体积(bulk)并增强块状物形成。如本文所用的，术语“填充剂”包括“结晶”和“非结晶”填充剂两种。术语“结晶”填充剂指的是在典型的冻干条件下能够形成晶体结构的填充剂。
[0107]通常，结晶填充剂 是指在冷冻期间(例如，约0°C和约_50°C之间的温度)能够结晶的填充剂。在冷冻过程期间，结晶填充剂可需要退火、热处理步骤或其它组分以促进结晶。例如，取决于冻干过程的条件和/或存在于制剂中的其它赋形剂，填充剂在冻干期间可以是或可以不是结晶的。典型地，当液体制剂包含足够量的结晶填充剂(例如，当结晶填充剂与非晶溶质/组分(例如，rhBSSL或其它赋形剂)的比为至少约1.0、约1.25或约1.5)并允许在冻干过程中结晶时，该结晶填充剂可形成制剂的非晶组分(例如，rhBSSL)的结构支撑基质。如本文所用的，术语“结构支撑基质”是指晶体结构提供的对制剂的支撑物(类似于“支架”)，使得块状物的宏观结构在一级干燥期间基本上不受属于结构支撑基质的间隙之内的非晶溶质的任何“微塌陷”的影响。该结晶结构支撑基质可允许一级干燥，具有在产物的非晶组分的玻璃化转变温度之上的产物温度。
[0108]在此方面的某些实施方案中，结晶填充剂对rhBSSL的相对质量浓度大于约I比1，例如大于约1.25比1、大于约1.5比1、大于约2.0比I或大于约2.5比1，例如约2.0比I和5.0比I之间。
[0109]在本发明所有方面的特定实施方案中，所述结晶填充剂不是氨基酸，诸如多元醇，例如，其中所述结晶填充剂是甘露醇。
[0110]如由实施例3证明的，本发明人惊奇地发现，相比不包括结晶填充剂的液体制剂，结晶填充剂诸如甘露醇的添加显著提高了 rhBSSL的冻干制剂的稳定性。
[0111]在适于本发明的冻干法的制剂的特定实施方案中，所述结晶填充剂是以约50mM和约500mM之间的浓度存在的甘露醇；优选地，其中所述浓度为约IOOmM和400mM之间，或150mM和300mM之间。在优选的此类实施方案中，甘露醇的浓度为约175mM和约250mM之间，且更优选地，其中所述甘露醇以约180mM和约210mM之间的浓度存在；例如，其中甘露醇的浓度选自由下列构成的组:约185mM ;约190mM ;约195mM ;约200mM ;和约205mM。
[0112]稳定剂
[0113]稳定剂可包括本发明的制剂和/或组合物。在特定实施方案中，本发明的制剂和/或组合物还可包括稳定剂，诸如非晶稳定剂，其是与所述结晶填充剂不同的化学实体。
[0114]术语“非晶”稳定剂是指在典型的冻干条件下，能够采取非晶形式的稳定剂。术语“非晶”被普通技术人员通常理解，并包括描述缺少-至可检测的程度-晶体的长程有序特征的固体的含义。
[0115]在本发明的制剂和/或组合物的某些实施方案中，非晶稳定剂不是蔗糖；优选地，所述非晶稳定剂不是糖类；更优选地，所述非晶稳定剂是氨基酸。在特定的此类实施方案中，所述非晶稳定剂选自由下列构成的组=L-精氨酸；L-组氨酸；L-脯氨酸；L-丙氨酸；和甘氨酸；最优选地，其中所述非晶稳定剂是甘氨酸。
[0116]如由本文的实施例所证明的，本发明人惊奇地发现，非晶稳定剂诸如甘氨酸的添加，对存在于冻干制剂中的rhBSSL的稳定性具有附加的和协同效应。此类有益效果尤其是当甘氨酸以特定范围的浓度/量存在于制剂中时被显示。
[0117]因此，在适于本发明的冻干法的制剂的特定实施方案中，所述非晶稳定剂是甘氨酸，以约IOmM和约IOOmM之间的浓度存在于此制剂中；优选地，其中所述甘氨酸的浓度在约20mM和约70mM之间； 更优选地，其中所述浓度在约30mM和55mM之间；最优选地，所述甘氨酸以约35mM和50mM之间的浓度，诸如以选自由下列构成的组的甘氨酸浓度存在于此制剂中:约 36mM ;约 38mM ;约 40mM ;约 42mM ;约 44mM ;约 46mM ;和约 48mM。
[0118]pH或缓冲剂
[0119]缓冲液通常被包含在药物制剂中以保持制剂的pH处于生理上可接受的pH。制剂的期望pH还可受到活性剂的影响。例如，大部分生物药物活性剂在特定pH范围内具有较高的活性。通常，制剂的pH被保持在约4.0和约8.0之间、约5.5和约7.5之间、或约6.0和约7.2之间。通常，缓冲液以约2mM至约50mM、或约IOmM和25mM之间的浓度被包含在液体制剂中。
[0120]合适的缓冲液的实例包括源自酸诸如磷酸、乌头酸、柠檬酸、gluaric、苹果酸、琥珀酸和碳酸。通常地，采用缓冲液作为这些酸之一的碱金属盐或碱土金属盐。通常，缓冲液是磷酸盐或柠檬酸盐，通常是柠檬酸盐，例如柠檬酸钠或柠檬酸。其它合适的缓冲液包括醋酸盐、Tris和组氨酸缓冲液。
[0121]在适于冻干的制剂的特定实施方案中，所述制剂具有约6.3和约7.5之间的pH值；优选地，所述pH值在约6.6和约7.2之间；更优选地，其中所述pH值选自由下列构成的组:约6.7 ;约6.8 ;约6.9 ;约7.0 ;和约7.1。
[0122]在某些实施方案中，适于冻干的制剂还可包括磷酸钠缓冲液。在特定的此类实施方案中，适于冻干的制剂包含以约2mM和约20mM之间的磷酸盐浓度存在的磷酸钠；优选地，其中所述磷酸盐浓度为约5mM和约15mM之间；更优选地，其中所述磷酸盐浓度选自由下列构成的组:约6mM ;约8mM ;约IOmM ;约12mM ;和约14mM。
[0123]将被普通技术人员理解的是，磷酸盐的浓度将包括，取决于pH而处于可应用的相对浓度的任何或三种形式的磷酸盐形式(H3P04、(H2PO4) \ (HPO4)2-或(PO4)3-),在生物pH范围下其将通常包括(H2PO4)' (即04)2_离子作为占主导地位的磷酸盐形式。因此，在生理pH下，磷酸钠缓冲液通常由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠之间的平衡提供。
[0124]其它赋形剂
[0125]其它赋形剂可被添加至本发明的任何制剂/组合物。其它赋形剂可以包括等渗剂，例如盐和/或防腐剂、甜味剂、着色剂、填充剂(filler)，等等。
[0126]在特定实施方案中，本发明的制剂/组合物还可包括氯化钠。例如，适于冻干的制剂可包括氯化钠，以约IOmM和30mM之间的氯化物浓度存在；优选地，其中所述氯化物浓度为约15mM和25mM之间；更优选地，其中所述氯化物浓度选自由下列构成的组:约ISmM ;约20mM ;约 22mM ;和约 24mM。
[0127]II1.本发明的特定制剂和其它方面
[0128]本发明人在本文公开了包括rhBSSL的适于冻干的具有特定浓度范围内的特定组合的赋形剂的特定制剂。如实例中所证明的，此制剂在形成rhBSSL的冻干制剂方面具有特定效用，其显示了本文已描述的一个或多个特征中的改善。因此，在特定实施方案中，适于本发明的冻干法的制剂包含:
[0129].以约10mg/mL和15mg/mL之间的浓度存在的rhBSSL ;
[0130].以约180mM和210mM之间的浓度存在的甘露醇；
[0131].以约35mM和50mM之间的浓度存在的甘氨酸；
[0132]?以约2mM和20mM之间优选约5mM和15mM之间的磷酸盐浓度存在的磷酸钠；和
[0133].以约5mM和50mM之间优选约15mM和25mM之间的氯化物浓度存在的氯化钠，
[0134]?其中制剂具有约6.3和7.2之间的pH值。当此(液体)制剂通过例如如本文描述的方法冷冻干燥时，形成了 rhBSSL的冻干制剂，其显示本已描述的一个或多个特征中的改善。
[0135]因此，本发明的另一方面涉及通过适于冻干的制剂的冻干可获得的，诸如获自适于冻干的制剂的冻干的冻干制剂，如本文描述的。
[0136]在某些此类方面中，所述冻干制剂中的rhBSSL基本上以非结晶形式存在。例如，小于约20%、10%、5%、2%、1%、0.5%或0.1%的所述rhBSSL可以呈结晶形式，或没有结晶形式的rhBSSL可例如通过粉末X-射线衍射分析是可检测的。在优选的此类实施方案中，所述rhBSSL以非晶形式存在。
[0137]在冻干制剂的特定实施方案中，结晶填充剂是甘露醇。在某些此类实施方案中，所述甘露醇基本上呈结晶形式存在；和/或所述甘露醇以约Img和约10mg/mg所述rhBSSL之间的相对量被包含。优选地，甘露醇以约2mg和约5mg/mg rhBSSL之间，更优选地以约2.7mg和约3.lmg/mgrhBSSL之间的相对量被包含。提及组分的“基本上存在”是指，以约5%和约50%之间，例如以约10%和约50%之间或约25%和约50%之间的组分呈给定的形式。在优选的实施方案中，所述甘露醇绝大多数呈结晶形式存在。提及组分的“绝大多数存在”是指，大于约50 %，诸如大于约60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的组分呈给定的形式。
[0138]本发明人证明，除了结晶填充剂之外，令人惊讶地，在本发明的某些冻干制剂中没有检测到其它结晶形式。特别地，并参考实施例4中描述的制剂，不存在结晶甘氨酸、结晶磷酸钠的证据，且甚至不存在结晶氯化钠的证据。[0139]因此，在冻干制剂的优选实施方案中，所述甘露醇是所述制剂的基本呈结晶形式存在的唯一组分。例如，甘露醇是冻干制剂中晶体可被检测到的唯一组分；例如，通过使用粉末X-射线衍射分析检测。在冻干制剂的可选实施方案中，所述甘露醇是基本呈结晶形式存在的唯一赋形剂；或其中所述甘露醇是制剂中存在的唯一填充剂；和/或是呈结晶形式存在的唯一填充剂，例如基本呈结晶形式存在。
[0140]本发明的冻干制剂包含是与所述结晶填充剂不同的化学实体的非晶稳定剂。在本发明的冻干制剂的优选此类实施方案中，所述非晶稳定剂是甘氨酸，并且:所述甘氨酸基本呈非结晶形式存在；和/或所述甘氨酸以约0.1mg和约0.5mg/mg所述rhBSSL之间的相对量被包含。优选地，甘氨酸以约0.1mg和约0.4mg/mg rhBSSL之间，更优选地以约0.2mg和约0.3mg/mg rhBSSL之间的相对量被包含。在更优选的实施方案中，本发明的冻干制剂包含甘氨酸作为所述非晶稳定剂，其中所述甘氨酸呈非晶形式存在。例如，通过粉末X-射线衍射分析没有能够检测到呈结晶形式的甘氨酸，例如特别地不存在可检测的特征为结晶甘氨酸的峰，例如不存在可检测的D值17.906、23.693和/或28.4292 Θ处的粉末X-射线衍射峰。
[0141]在冻干制剂的特定此类优选形式中，所述甘氨酸是制剂中存在的唯一稳定剂，和/或是基本呈非结晶形式存在的唯一稳定剂，且在又更优选的形式中，甘氨酸是呈非晶形式存在的唯一稳定剂。
[0142]在另外的实施方案中，本发明的冻干制剂包含磷酸钠；优选地，其中所述磷酸钠基本呈非结晶形式存在；和/或所述磷酸钠以约0.015mg和约0.25mg/mg所述rhBSSL之间的相对量被包含。在此类实施方案中，所述磷酸钠可包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
[0143]本发明人证明了 如下惊人的发现:尽管甘氨酸(已知促进磷酸钠结晶的赋形剂)存在于本发明的某些制剂中，结晶磷酸钠是不可检测的。因此，在某些实施方案中，本发明的冻干制剂包含呈非晶形式存在的磷酸钠。
[0144]在又另外的实施方案中，本发明的冻干制剂包含氯化钠；优选地，其中所述氯化钠基本呈非结晶形式存在；和/或所述氯化钠是以约0.02mg和约0.3mg/mg所述rhBSSL之间的相对量被包含。
[0145]本发明人证明了如下惊人的发现:尽管氯化钠通常容易形成晶体，结晶磷酸钠是不可检测的。因此，在某些实施方案中，本发明的冻干制剂包含呈非晶形式存在的氯化钠。
[0146]本发明人在本文公开了包含rhBSSL的具有特定相对量范围内的特定组合的赋形剂的特定制剂。如实例中证明的，此冻干制剂显示本文已描述的一个或多个特征中的改善。因此，在特定实施方案中，本发明的冻干制剂包含每mg所述rhBSSL的以下物质:
[0147].甘露醇，以约2mg和约5mg之间，优选约2.7mg和约3.1mg之
[0148]间的相对量存在；
[0149].甘氨酸，以约0.1mg和约0.4mg之间，优选约0.2mg和约0.3mg
[0150]之间的相对量存在；
[0151].磷酸钠，以约0.05mg和约0.15mg之间的相对量存在；及
[0152].氯化钠，以约0.06mg和约0.18mg之间的相对量存在。
[0153]在本发明此类特定冻干制剂的优选实施方案中:甘露醇基本呈结晶形式存在，优选甘露醇绝大多数呈结晶形式存在；甘氨酸呈非晶形式存在；磷酸钠呈非晶形式存在；和/或氯化钠呈非晶形式存在。
[0154]如现在对普通技术人员将明显的是，本发明的冻干制剂可以以不同的绝对量被制备，诸如以大规模制造批次制备，例如约:100g, lKg、IOKg, 100Kg、250Kg或500Kg的此类冻干制剂。然而，关于向个体诸如有需要的患者施用，可以以单次或多次此类量以任何给定的施用或施用过程被施用至个体的总计较小的量将是期望的。
[0155]因此，在另一方面，本发明涉及本发明的冻干制剂的此期望的量，作为如本文描述的冻干制剂的单位剂量，其中所述rhBSSL以约Img和约500mg之间的绝对量存在于此单位剂量中。在此单位剂量的优选实施方案中，rhBSSL以约5mg和约25mg之间的绝对量存在，且更优选地，其中所述量选自由下列构成的组:约8mg ;约IOmg ;约12mg ;约14mg ;和约16mg。通过此类单位剂量的应用的非限制实例的方式，包括约25mg和50mg之间的那些单位剂量可在治疗成年人囊性纤维化和/或胰腺功能不全的患者中具有效用；且包括约IOmg和20mg之间的那些单位剂量可在治疗婴儿诸如早产婴儿中具有效用。在某些实施例中，诸如在“半剂量(half-dose) ”可被需要以补充全单位剂量的情况下，例如当需要针对体重的准确剂量诸如用于施用至早产和/或小婴儿时，本发明的单位剂量可包括以约2mg和IOmg之间的绝对量，诸如选自以下的rhBSSL的量存在的rhBSSL:约4mg ;约6mg ;和约8mg。如本文所述的，普通技术人员现在将容易能够依据活性rhBSSL的量，诸如由通过例如使用如本文所述的活性测定的一些酶单位(U)，表示本发明任何冻干制剂或单位剂量中rhBSSL的量。 [0156]在某些实施方案中，本发明的单位剂量可用于和/或特别适于向早产的婴儿施用。例如，所述施用可包括通过胃肠道施用液体婴儿喂养品，其中在所述施用之前，所述冻干制剂的所述单位剂量已被重建成所述婴儿喂养品。在某些实施方案中，所述液体婴儿喂养品是基于乳汁的或基于脂肪的(例如基于乳汁或植物脂肪的)液体婴儿喂养品。在特定实施方案中，液体婴儿喂养品是巴氏消毒的母乳，并且在可选的实施方案中，其是婴儿配方食品，例如在共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060中公开的。经胃肠道施用可通过喂食，诸如通过瓶子方便地进行。可选地，施用可通过其它工具实现；例如，通过使用滴管、注射器、匙或浸溃的布，诸如如果婴儿具有口的畸形则可能需要。在某些实施方案中，诸如在体重过轻、早产或虚弱的婴儿的情况下，可直接通过胃、胃造口术、或十二指肠管向胃肠道进行施用。
[0157]早产的婴儿特别危险，并因此需要精心喂养和治疗剂的施用。因此，对用于向此类婴儿施用的稳定的并因此保留其经过长时间段的治疗效果的治疗剂存在巨大需求。用于向此类婴儿施用的治疗剂的稳定性的显著或本质变化可导致在治疗过程中向此类婴儿的不完全的_、过度的-或可变的-给药；可能伴随致命的结果。
[0158]因此，在某些实施方案中，本发明包括如本文所述的冻干制剂，或如本文所述的单位剂量，其中所述rhBSSL包括稳定的rhBSSL。“稳定的”是指当以建议的剂量储存时，该rhBSSL和/或该制剂作为整体的治疗活性或潜能持续期望的时间段被保持。通过非限制性实例的方式，此类期望的时间段可以是持续至少约:3个月、6个月、12个月、12个月、18个月、24个月或更长，例如72个月:且此类建议的储存温度可以是约_18°C、+4°C、+18°C或约+22。。。
[0159]在本发明的某些实施方案中，包含稳定的rhBSSL的冻干制剂或单位剂量在例如储存此类时期和时间段期间不容易形成聚集体。在某些此类实施方案中，聚集体是不溶性聚集体。治疗制剂，即使口服给予的治疗制剂且特别是给予早产的婴儿的治疗制剂中rhBSSL的不溶性聚集体的存在，都可对剂量并因此对治疗的疗效和/或安全性具有显著影响。因此，rhBSSL的不溶性聚集体的量的减少将会是期望的，因为其可有助于rhBSSL的疗效及较安全的治疗用途中较少的变化。通过非限制性实例的方式，“不容易形成”聚集体包括储存在+25°C下6个月后，小于约5 %，例如小于约3 %、2.5 %或2 %的rhBSSL聚集体存在。rhBSSL聚集体的量可被定量，例如，通过如本文描述的SE-HPLC。可选地，聚集体形成的速率可以小于本文所述的制剂NI所示的速率。
[0160]在某些实施方案中，所述冻干制剂或单位剂量中聚集体的形成是所述冻干制剂在约0°C和约+40°C之间的温度下储存的结果；优选地，其中所述储存温度选自由下列所构成的组:约+5°C ;约+10°C ;约+15°C ;约+20°C ;和约+25°C。在其它实施方案中，此类聚集的形成可由表面相互作用、(UV)光、放射线、化学改性、表面活性剂的存在所致。 [0161]在某些实施方案中，当储存于+4°C、+18°C或约+22°C时，冻干制剂或单位剂量的保质期被延长，例如直至约18个月、25个月、或72个月。
[0162]在又另一方面中，本发明涉及制备rhBSSL的冻干制剂的方法，所述方法包括以下步骤:提供适于如本文描述的、定义的或请求保护的冻干法的制剂；及冻干所述制剂。所述方法可包括以下步骤:冷冻所述适于冻干的制剂；一级干燥所述冷冻制剂；及二级干燥一级干燥的制剂。
[0163]在该方法的优选实施方案中，此方法的每个步骤都可施用如本文描述的、或定义的关于此步骤的参数进行。例如，并如本文实施例4中更详细陈述的，冷冻步骤可通过以约0.8V /小时的速率将适于冻干的制剂冷却至约-50°C进行，并且在另外的此类实施方案中，冷冻制剂可通过在_50°C下保持5小时被平衡。关于一级干燥，此步骤可通过施加约0.2mbar的真空和0°C的搁板温度(shelf temperature)进行,并持续约13小时和/或直到样品的温度接近搁板温度，指示冰晶升华完成。二级干燥可通过降低室压力至约0.02mbar并以约1°C /小时的速率将搁板温度升高至约+25°C被启动，且二级干燥可持续约10小时，直至产物具有约0.8%和0.2%之间的水分含量。液体制剂的冻干可在放置于冻干室中玻璃小瓶中进行；然后当冻干完成时，在真空条件下用橡胶塞密封小瓶。
[0164]在相关的方面，本发明还涉及通过上文描述的方法可获得的诸如获自上文描述的方法的rhBSSL的冻干制剂。
[0165]为了将rhBSSL施用至个体，本发明的冻干制剂通常被重建；其被溶解在溶剂(通常是水基的)中以形成可更容易地被所述个体可生物利用的rhBSSL溶液。因此，在另外的方面，本发明涉及制备rhBSSL的重建制剂的方法，所述方法包括以下步骤:提供如本文描述的、定义的或请求保护的冻干制剂，或如本文描述的、定义的或请求保护的单位剂量；及在液体例如在诸如水基溶剂的溶剂中重建所述冻干制剂或单位剂量。
[0166]在特定的此类方法中，所得的重建制剂具有约5.9和7.9之间的pH ;优选地，其中所述PH在约6.4和7.4之间；更优选地，其中所述pH选自由下列构成的组:约6.5 ;约6.6 ;约 6.7 ;约 6.8 ;约 6.9 ;约 7.0 ;约 7.1 ;约 7.2 ;和约 7.3。
[0167]在另外的此类方法中，所得的重建制剂以约2.5mg和约50mg之间的量包含所述rhBSSL ;优选地,其中所述量在约5mg和约25mg之间；更优选地,其中所述量选自由下列构成的组:约 7.5mg ;约 IOmg ;约 12.5mg ;约 15mg ;约 17.5mg 和约 20mg。
[0168]本发明的某些应用涉及提供适于向人类婴儿施用的rhBSSL的制剂。因此，在该方法的某些实施方案中，冻干制剂或单位剂量在液体婴儿喂养品中被重建，并且因此所述构成的制剂在液体婴儿喂养品中被重建。
[0169]在本发明的某些实施方案中，液体婴儿喂养品是非新鲜母乳，冻干制剂或单位剂量在其中被重建，是巴氏消毒乳汁。在其它实施方案中，母乳在例如巴氏消毒之后已被冷冻。在特定实施方案中，用于本发明的母乳来自乳汁库。乳汁库可包括收集捐赠的母乳、确保乳汁安全和质量并且使其可用于有需要的婴儿的全国性组织National MilkBank(NMB)，或1985年成立的以设置北美洲乳汁库的建立和运作标准并促进北美洲乳汁库的建立和运作的捐赠者母乳库的非营利性协会Human Milk Banking Association ofNorth America (HMBANA)。
[0170]在可选的实施方案中，在婴儿配方食品中重建冷冻制剂或单位剂量。技术人员将知晓许多市售可得的婴儿配方食品，其包括:Enfamil?、Pregestimil?、Nutramigen?和Nutramigen AA?(所有均由 Mead Johnson 销售或制造)；Similac?、Isomil?、Alimentum?和 EleCare?(所有均由 Abbott Laboratories, Ross division 销售或制造)；Nestl6:世界最大的配方食品生产商，制造了 GoodStart?(由Nestle/Gerber Products Company销售或制造)；Farexl?和Farex2?(由Wockhardt Nutrition销售或制造)。对于早产儿，其它婴儿配方食品例如 Similac Neosure、EntramiI Premature、Similac Special Care、Cow&Gate Nutriprem2和EntramiI Enfacare也是可用的。对于所有婴儿配方食品共有的是，它们包含作为脂酶诸如rhBSSL的底物的脂类的来源。在特定实施方案中，婴儿配方食品具有通常与共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060的展示A中显示的规格(specifications) 一 致、或基本如共同待审的申请W02012/052059和W02012/052060的展不A 中显不的规格，或如由 ESPGHAN Coordinated International Expert Group (Koletzko等人，2005 ；J Ped GastroNutr41:584-599)推荐的组成(添加rhBSSL之前)。在某些实施方案中，婴儿配方食品包含如所述展示B中所示的一种或多种成分并处于近似水平。在特别有益的实施方案中，婴儿配方食品包含至少0.5% (总脂肪)的二十二碳六烯酸(DHA)和/或花生四烯酸(AA)，并且在另外的此类实施方案中，其中AA的浓度应至少达到DHA的浓度，和/或如果添加二十碳五烯酸(C20:5n-3)，其浓度不超过DHA的含量。
[0171]包含从本发明储存的例如在+25°C下持续9个月的冻干制剂或单位剂量重建的rhBSSL的此类液体婴儿喂养品，与从现有技术的rhBSSL制剂(rhBSSL的水溶液)制造的液体婴儿喂养品、或从不含任何填充剂或稳定剂的冻干rhBSSL制造的液体婴儿喂养品，各自均相似地在+25°C储存9个月相比，预期具有较低水平的不溶性聚集体。
[0172]在特定方面，本发明涉及rhBSSL的重建制剂，包括:
[0173]⑴所述rhBSSL，以IOmg和20mg之间的绝对量存在；
[0174](ii)甘露醇，以27mg和62mg之间的绝对量存在；
[0175](iii)甘氨酸，以2mg和6mg之间的绝对量存在；且其中所述制剂在液体婴儿喂养品中被重建；且所述重建制剂具有6.4和7.4之间的pH。
[0176]本发明人在本文还证明，在rhBSSL的冻干制剂中使用甘氨酸，还提供了该特定蛋白质的此类制剂的惊人的和有益的性质。因此，在另一方面，本发明涉及甘氨酸稳定存在于冻干制剂中的rhBSSL的用途，其中:
[0177].所述甘氨酸基本呈非结晶形式存在于所述冻干制剂中；和/或
[0178].所述甘氨酸以约0.1mg和约0.4mg/mg所述rhBSSL之间、优选约0.2mg和约0.3mg/mg所述rhBSSL之间的相对量包含在所述冻干制剂中。
[0179]所述冻干制剂还包含不是甘氨酸的结晶填充剂，诸如结晶填充剂为甘露醇。在此方面的优选实施方案中，所述冻干制剂中存在的所述甘氨酸呈非晶形式存在。
[0180]在此用途的更优选的此类实施方案中，冻干制剂还包含每mg所述rhBSSL的以下物质:
[0181].甘露醇，以约2mg和约5mg之间、优选约2.7mg和约3.1mg之间的相对量被包含在所述冻干制剂中作为所述结晶填充剂；
[0182].磷酸钠，以约0.05mg和约0.15mg之间的相对量被包含在所述冻干制剂中；及
[0183].氯化钠，以约0.06mg和约0.18mg之间的相对量被包含在所述冻干制剂中。
[0184]在此用途的又另外优选的此类实施方案中，在此类冻干制剂中:
[0185].所述甘露醇基本呈结晶形式存在；
[0186]?所述甘氨酸呈非晶形式存在； [0187].所述磷酸钠呈非晶形式存在；且
[0188].所述氯化钠呈非晶形式存在。
[0189]在某些实施方案中，甘氨酸的此用途提供了具有提高的稳定性的rhBSSL制剂。因此，在特定实施例中，所述rhBSSL的所述稳定通过形成所述rhBSSL的聚集体的速率被表征。例如，所述聚集体的形成是所述冻干制剂在约0°C和+40°C之间的温度下储存的结果；优选地，其中所述储存温度选自由下列构成的组:约+5°C ;约+10°C ;约+15°C ;约+20°C ;和约 +25 0C ο
[0190]因此，在相关的方面，本发明涉及减少和/或最小化存在于液体婴儿喂养品中的rhBSSL的不溶性聚集体的形成的方法，所述方法包括以下步骤:提供:如本文描述的、定义的或请求保护的冻干制剂或单位剂量；及在液体婴儿喂养品中重建所述冻干制剂或单位剂量。
[0191]在此方法的某些实施方案中，制剂或单位剂量被直接添加至液体婴儿喂养品并在其中溶解。在可选的实施方案中，冻干制剂或单位剂量首先被溶解在第一液体(例如水)中，然后将其加入液体婴儿喂养品。
[0192]在此方法的其它实施方案中，此方法被实践:以增加存在于所述婴儿喂养品的溶液中的活性rhBSSL相对于不溶性聚集体的量的量；和/或减少不同液体婴儿喂养品之间的rhBSSL效力的可变性。
[0193]表征本发明的制剂和/或组合物的一个重要方法是rhBSSL聚体程度的确定。因此，本发明一个另外的方面涉及确定rhBSSL聚集的减少的方法，所述方法包括以下步骤:提供如本文描述的、定义的或请求保护的冻干制剂或单位剂量；储存所述冻干制剂或单位剂量；并在一个或多个时间点确定所述冻干制剂或所述单位剂量中所述rhBSSL的高分子量百分比HMW)的水平，从而确定所述rhBSSL的聚集水平。rhBSSL聚集的程度和/或水平可通过任何合适的方法被确定和/或被定量，例如通过SE-HPLC检测rhBSSL的％ HMW水平，如例如在本文实施例中描述的。[0194]在优选的此类方法中，所述方法包括以下步骤:确定所述冻干制剂在+5°C储存18个月后是否包括小于约3.5%、3.0%、2.5%、2.25%、2.0%、1.75%或1.5%的所述rhBSSL的HMW种类，如通过SE-HPLC确定的。
[0195]被理解的是，将本发明的教导应用于特定问题或环境，根据本文包含的教导，将在具有本领域普通技术的人员的能力之内。本文引用的所有参考文献、专利和出版物在此通过引用以其整体并入。本发明的制剂和组合物的实例和其制备或使用的代表性方法、用途或过程在下文呈现。
实施例
[0196]下面的示例，包括所进行的实验和实现的结果，也说明了本发明多种目前特定的实施方案，并被提供仅用于说明的目的，且不应被解释为限制本发明。
[0197]实施例1:实验AH7507
[0198]实验设置:使用具有2个中心点的全因子2水平设计(22)，研究了结晶填充剂和任选非晶稳定剂对rhBSSL的冻干制剂的性质的影响。以各种组合和量的赋形剂被用于制备7个具有复I中展示的组成的冻干制剂。加入温度作为用于待被储存18个月的样品的因子设计的第三因子(在+5°C和+25°C下储存18个月)，且样品还在+40°C下储存9个月的较短时期。在储存期间定期从多种冻干制剂中取样，并使用尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)、粉末X-射线衍射(PXRD)和其它技术研究。
[0199]表1AH7507的冻干制剂的冻干粉末中rhBSSL和赋形剂的量。
[0200]
【权利要求】
1.一种适于冻干的制剂，所述制剂包含: (i)重组人胆盐刺激脂酶(rhBSSL)； (?)结晶填充剂 '及 (iii)非晶稳定剂，所述非晶稳定剂是与所述结晶填充剂不同的化学实体。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述非晶稳定剂选自由下列构成的组:L-精氨酸；L-组氨酸；L-脯氨酸；L-丙氨酸；和甘氨酸。
3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述非晶稳定剂是甘氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述非晶稳定剂以IOmM和IOOmM之间的浓度存在。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中所述非晶稳定剂以35mM和50mM之间的浓度存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制剂，其中所述结晶填充剂是甘露醇。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，其中所述结晶填充剂以IOOmM和400mM之间的浓度存在。
8.根据权利要求7 所述的制剂，其中所述结晶填充剂以180mM和210mM之间的浓度存在。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的制剂,其中所述rhBSSL以lmg/mL和35mg/mL之间的浓度存在。
10.根据权利要求9所述的制剂,其中所述rhBSSL以10mg/mL和15mg/mL之间的浓度存在。
11.根据权利要求10所述的制剂，所述制剂包含: (i)以10mg/mL和15mg/mL之间的浓度存在的rhBSSL； (ii)以180mM和2IOmM之间的浓度存在的甘露醇；及 (iii)以35mM和50mM之间的浓度存在的甘氨酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制剂，所述制剂具有6.3和7.5之间的pH值。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的制剂，所述制剂还包含以2mM和20mM之间的磷酸盐浓度存在的磷酸钠。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的制剂，所述制剂还包含以5mM和50mM之间的氯化物浓度存在的氯化钠。
15.一种冻干制剂，所述冻干制剂是通过根据权利要求1至14中任一项所述的制剂的冻干可获得的。
16.一种rhBSSL的重建制剂，所述重建制剂包含: ⑴以IOmg和20mg之间的绝对量存在的所述rhBSSL ； (?)以27mg和62mg之间的绝对量存在的甘露醇； (iii)以2mg和6mg之间的绝对量存在的甘氨酸；且 其中所述制剂在液体婴儿喂养品中被重建；且所述重建制剂具有6.4和7.4之间的pH。
17.甘氨酸用于稳定冻干制剂中存在的rhBSSL的用途，所述冻干制剂还包含不是甘氨酸的结晶填充剂，其中所述甘氨酸基本呈非结晶形式存在于所述冻干制剂中；和/或所述冻干制剂以0.2mg/mg所述rhBSSL和0.3mg/mg所述rhBSSL之间的相对量包含所述甘氨酸。
【文档编号】A23C9/152GK104023742SQ201280053920
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年9月25日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】威廉·埃克 申请人:瑞典孤儿比奥维特鲁姆有限公司