专利名称：：利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法
技术领域：
：本发明涉及三株产胆盐水解酶(BileSaltHydrolase,BSH)的乳酸菌及两株产胆盐水解酶的酵母菌及其功能性饮料生产技术，适用于发酵蛋乳制品中降胆固醇的蛋乳发酵饮料的生产。
背景技术：
：益生菌(Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡,控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酵母属、克鲁维酵母属等。早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇的含量。迄今，国内外研究者对于乳酸菌降低胆固醇的作用机理尚存在不同观点，主要集中于以下三点(l)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。胆盐水解酶(BSH)是乳酸菌产生的代谢产物。Klaver等利用多株乳杆菌和双歧杆菌进行的降胆固醇研究证实乳酸菌产生的胆盐水解酶能在人体肝肠循环中将结合态胆盐降解产生氨基酸与溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。酵母菌包括乳糖发酵性和乳糖非发酵性二类。乳糖发酵性酵母有克鲁维酵母属(如马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母)、假丝酵母属(如乳酒假丝酵母)和酒香酵母属等，它们能产生P-半乳糖苷酶，在牛乳中生长能发酵乳糖产生乙醇和C02,是制作乳酒的良好菌种。有关酵母菌的益生性也有文献报道。酵母菌作为益生菌的应用起源于饲料，如Sacc/wramj/cM6o"/"/y板被用于不同类型痢疾的治疗。Psomas等(2003年)研究了^cc/zaram;;c^^w/a"板具有降低胆固醇的功能。也有啤酒酵母拮抗大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌等肠道病原菌生长的报道。啤酒酵母能够通过肠道存活，进一步说明了它被作为益生菌的可能性。Submmanian等(1983年)研究了应用嗜酸乳杆菌和乳糖发酵性酵母——马克斯克鲁维酵母和C"w&Wa戸ei^^o/^"/^共生发酵生产嗜酸酵母乳产品，发现嗜酸乳杆菌的生长受酵母菌存在的刺激。利用酵母菌在生长过程中的呼吸作用，以生物法耗氧，创造一个适合于嗜酸乳杆菌生长繁殖、产酸代谢的厌氧环境。目前，国内有关发酵型蛋奶饮料研究较多，而降胆固醇的发酵蛋乳饮料工艺研究刚刚起步。包惠燕等(2003年)研究了乳酸菌发酵对蛋奶胆固醇的影响，结果显示嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌单独与混合发酵均可使蛋奶中胆固醇量下降10%左右；尹忠平等(2007年)以鲜鸡蛋为主要原料，利用乳酸菌(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌复合菌种)发酵作用加工凝固型降胆固醇发酵全蛋饮料。其胆固醇降低率可达36.03%。而本发明专利是以牛奶与鸡蛋为主要原料，利用从藏灵菇中筛选的高产胆盐水解酶的乳酸菌(嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种)和马克斯克鲁维酵母菌采用二步发酵法制备降胆固醇蛋乳发酵饮料，其胆固醇降低率可高达89.3%。迄今，国内外尚无关于马克斯克鲁维酵母菌具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶的相关文章报道和专利报道。而关于利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌应用于降胆固醇蛋乳发酵饮料的生产亦未见国内外文献报道和专利报道。
发明内容本发明的第一个目的是提供三株具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的乳酸菌。本发明所提供的乳酸菌是干酪乳杆菌(/^"0^"7/1^0^^)虹1菌株，乳酸乳球菌享L酸亚禾中(丄actococc船/ac似subsp./acfe)KS4，嗜热链球菌(S/re/tococcwsAwmo/7/H7M)Tx菌株，已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏号分别为:CGMCCW1809(菌株KL1)，CGMCCW2l807(菌株KS4)，CGMCCW2l8lO(菌株Tx)。干酪乳杆菌(Z^cfo6acz7/wsca"/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亚种(Z^c,ococcwj/ac船subsp./ac泡)KS4，嗜热链球菌(S/re/tococcws^ermo;/H7ws)Tx，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)。在含有碳酸药和纳他霉素的MRS选择性培养基上，干酪乳杆菌a^toZ^"7/"jcose/)KL1菌株的菌落大小23mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaC03的透明圈，菌落有较高點性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G+无芽孢杆菌；乳酸乳球菌乳酸亚种(丄a"ococctw/ac他subsp./acfe)KS4禾tl嗜热链球菌(5^eptococcws^2emzo//H7MS)Tx菌株的菌落大小为12mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，无光泽，凸起，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaC03的透明圈，菌落有较高黏性。个体形态呈球形或卵圆形，一般成对或链状排列，G+兼性厌氧菌。上述方法得到具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的乳酸乳球菌乳酸亚种KS4，嗜热链球菌Tx，干酪乳杆菌KL1属于本发明保护范围。本发明的第二个目的是提供两株具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的酵母菌。本发明所提供的酵母菌是马克斯克鲁维酵母(i^;^ram;;c"maWaw一Kl和M3菌株。已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏号分别为CGMCCW2l812(菌株Kl)，CGMCCJ^1811(菌株M3)。马克斯克鲁维酵母(ii:/w"eram;;c"mflm'aww》Kl和M3分离筛选自吉林省白城市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)。在含有抗生素的马铃薯乳糖(PDA)选择性培养基上马克斯克鲁维酵母(ii:/^yveraw;;c"wwx/""w力Kl和M3菌落大小为34mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，有光泽，微隆起，乳白色，不透明；个体形态呈卵圆形或短椭圆形(K1菌株)、长椭圆形或圆柱形(M3菌株)，不形成假菌丝；无性繁殖为多边芽殖，在马铃薯乳糖培养基中生长出芽高，有性繁殖形成子囊孢子；有很强的发酵能力，能产生P-半乳糖苷酶，在牛奶中发酵乳糖产乙醇含量可达3.0^(m/m)以上，在蛋乳发酵饮料中乙醇含量可达0.7%l,0%(m/m)。上述方法得到具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶的马克斯克鲁维酵母Kl和M3菌株属于本发明保护范围。本发明的第三个目的是提供利用三株乳酸菌及一株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法。本发明所提供制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法是由具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的干酪乳杆菌(Z^"o^d//^cwe/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亚种(丄a"ococcus/a池subsp./a"&)KS4，嗜热链球菌()S^ptococa^/em2qp^Ms)Tx三株乳酸菌及马克斯克鲁维酵母(X/w"eram""man:/amw)Kl或M3酵母菌制得。所述方法中，原辅料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%,料水比1:1(附F),蔗糖添加量7。/。(附F)，CMC-Na用量0.3%，卡拉胶用量0.2%。全蛋液最佳杀菌条件为67。C，20min。原料经杀菌、冷却后利用三株乳酸菌与一株酵母菌进行二步发酵。所述方法中，利用三株乳酸菌与一株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇蛋乳饮料最佳发酵工艺条件是前期乳酸菌发酵(一次发酵)条件发酵温度为43'C，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例l:l:l，接种量3%;后期酵母菌发酵(二次发酵)条件发酵温度32"C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，发酵时间26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)，接种量1。/。(K1或M3菌株)。在此优化发酵条件下制作的产品经4"C低温后熟ld后，原料中胆固醇降低率为59.6。/o(Kl菌株)75.0。/。(M3菌株)，产品乙醇含量为0.7。/o(M3菌株)1.0。/o(Kl菌株)(m/m)，酸度60。T(M3菌株)62。T(K1菌株)。成品蛋乳饮料呈乳黄色，口感细腻、滑幼，爽口，风味独特，有浓郁的酯香风味伴着清淡的醇香，酸甜度适中；质地不分层也不絮凝，呈均匀一致的起泡性乳浊液，是一种营养丰富，对人体健康有益的功能性饮品。上述方法得到降胆固醇蛋乳发酵饮料配方、最佳发酵工艺条件及其产品与专用生产菌株也属于本发明保护范围本发明的第四个目的是提供利用三株乳酸菌及两株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法。本发明所提供制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法是由具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的干酪乳杆菌(丄flctoZ)aci//^caw')KLl,嗜热链球菌OS^tococcus//^ww^i/泌)Tx，乳酸乳球菌乳酸亚种(丄flctococc附/flc泡subsp./ac故)KS4三株乳酸菌及马克斯克鲁维酵母(X/M"eraw;;caswam'a"t^)Kl与M3两株酵母菌制得。所述方法中，原辅料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%，料水比1:1(『/F)，蔗糖添加量7%(『/F)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉胶用量0.2%。全蛋液最佳杀菌条件为67'C，20min。原料经杀菌、冷却后利用三株乳酸菌与两株酵母菌进行二步发酵。所述方法中，利用三株乳酸菌与两株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇蛋乳饮料最佳发酵工艺条件是前期乳酸菌发酵(一次发酵)条件发酵温度43'C，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例1:1:1，接种量3%;后期酵母菌发酵(二次发酵)条件发酵温度30'C，发酵时间24h，Kl/M3菌种比例l:l，接种量1%。在此优化发酵条件下制作的产品经4'C低温后熟ld后，原料中的胆固醇降低率为89.3%，产品乙醇含量为0.75。/。(m/m)，酸度为60°T。成品蛋乳饮料色泽呈乳黄色，口感细腻、幼滑、爽口，酸甜度适中；风味独特，有浓郁的酯香风味伴着清淡的醇香，蛋腥味不明显；质地不分层亦无絮凝沉淀，组织状态呈均匀一致的起泡性乳浊液。在63'Cx30min热处理条件下进行巴氏杀菌，蛋乳饮料未出现乳清分离和沉淀现象。其风味和感官状态未发生变化。利用三株高产胆盐水解酶的乳酸菌与两株酵母菌通过在优化条件下进行二步发酵，以及全蛋液在适宜条件下巴氏杀菌(67-C，20min)，既掩盖解决了全蛋液浓厚的蛋腥味问题，又可高效降低原料中的胆固醇含量，是一种集营养与保健为一体的功能性饮品。故可利用高产胆盐水解酶的益生乳酸菌与酵母菌株大规模生产降胆固醇的蛋乳发酵饮料。上述方法得到降胆固醇蛋乳发酵饮料配方、最佳发酵工艺条件及其产品与专用生产菌株也属于本发明保护范围。应用干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx、马克斯克鲁维酵母Kl和M3菌株生产降胆固醇蛋奶发酵饮料工艺流程图说明如下1、原料乳的处理(l)原料乳制作蛋奶发酵饮料的原料乳要求菌数一般低于1(^个/mL，不含抗生素和消毒药，不宜选用患乳房炎乳。(2)净化以离心机除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的杂质。(3)标准化原料乳的主要成分指标应符合食品卫生国家标准GB5408-85。其总干物质应不低于11.5%，脂肪含量根据产品不同大体调整为4种3.2%、2.5%、1.0%和<0.1%,可通过脱除奶油或添加1%3%的脱脂奶粉或稀奶油以调整总干物质或脂肪含量。(4)预热、均质将原料乳加热至6070'C，均质机中于1315MPa压力下对预热原料乳均质处理。目的是使牛乳质地更加细腻、平滑，亦可使脂肪球变小而防止脂肪上浮。(5)杀菌、冷却将原料乳加热至9095。C，保温510min，迅速冷却至43。C。2、全蛋液的处理(l)全蛋液将经过洗蛋机清洗(用含有清洗剂的流动清水)、消毒(用消毒剂)灯检后的合格鸡蛋自动接收逐个用打蛋机打破，蛋壳掰开，蛋液经管道流入容器。(2)匀质用匀质机乳化1030min。利用匀质机的剪切力和蛋黄含有的卵磷脂(乳化剂)，可使脂肪胆固醇乳化成极小颗粒。(3)加糖水、稳定剂配料将原料用水加热至6(TC，加入7%(『/^)的蔗糖，0.3%CMC-Na，0.2%卡拉胶，搅拌溶解后，与匀质后的全蛋液混合。(4)杀菌、冷却将全液蛋加热至67'C，保温20min，迅速冷却至43""C。3、混合将原料乳处理液与全蛋处理液混合后[原料奶与全蛋液各占总量的35%和15%，料水比为l:l(,AO]，待接种。4、接种乳酸菌发酵剂、一次发酵(前期发酵)将干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx菌株的单一发酵剂按1:1:1比例混合，加入复合发酵剂的总接种量为3%,于发酵罐中保温43'C静置发酵8h后，进行酵母菌的二次发酵。5、接种酵母菌发酵剂、二次发酵(后期发酵)二次发酵工艺l:加入马克斯克鲁维酵母M3或K1菌株单一发酵剂，总接种量1%,于发酵罐中保温32°C(K1菌株)及34°C(M3菌株)静置发酵26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)后，进行低温后熟。二次发酵工艺2:将马克斯克鲁维酵母M3和Kl菌株的单一发酵剂按1:1比例混合，加入复合发酵剂的总接种量1%，于发酵罐中保温3(TC静置发酵24h后，进行低温后熟。6、低温后熟发酵罐通入-4'CNaCl盐水，使发酵蛋乳温度降至04"C后熟ld。目的是利用生产菌种分泌的胆盐水解酶在低温下继续作用于原料胆固醇而提高降低率，并防止杂菌污染繁殖。低温条件下的后熟有利于蛋乳发酵饮料风味物质的形成，最终获得风味柔和、清凉爽口、浓郁的成品蛋乳发酵饮料。7、罐装与巴氏杀菌将发酵蛋乳罐装于瓶中，压盖后，于63。C保温杀菌30min(为保持蛋乳发酵饮料的生物活性可省去加热杀菌工序)，冷却后即为成品。干酪乳杆菌(丄acto6ac///^cme/)KLl乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcMS/acfesubsp./ac泡)KS4，嗜热链球菌(5Vre;tococcw;yAwwop/K7ws)Tx、马克斯克鲁维酵母(7a"_yveram，ycasmara^m^)Kl和M3菌株，分离筛选于东北普通家庭的藏灵燕(又称开菲尔粒)，具有可靠的安全性，利用高产胆盐水解酶的三株乳酸菌株和两株酵母菌株制备的功能性蛋乳发酵饮料，可使原料中的胆固醇降低率为59.6%75.0%(酵母菌单一发酵剂)，最高可达89.3%(酵母菌复合发酵剂)，产品乙醇含量为0.7。/。1.0。/。(m/m)，酸度为6062°T。成品色泽呈乳黄色，口感细腻、幼滑、爽口，酸甜度适中；风味独特，有浓郁酯香风味伴随清淡醇香，蛋腥味不明显；质地不分层亦无絮凝沉淀，组织状态呈均匀一致的起泡性乳浊液。本发明制作降胆固醇蛋乳发酵饮料的原料来源方便，发酵工艺简单，发酵周期短，操作简单，对原料胆固醇的降低率高，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积百分含量。实施例i、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的干酪乳杆菌0:"ctoto"7/^owe/)KLl，乳酸乳球菌乳酸亚种(丄"ctococcw/flcfosubsp./ac他)KS4,嗜热链球菌CS^取ococcwsAermopMws)Tx菌株的筛选与鉴定1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶乳酸菌株的筛选取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10—410—6的稀释菌液。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37"C培养24h，挑取有溶解圈的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37。C培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37"C增菌培养23代，再以1%2%接种量转接入含胆固醇的1号培养基，37'C培养20h后，以邻苯二甲醛比色法测定I号培养基中发酵前后胆固醇的含量，并计算胆固醇降低率(％)。根据胆固醇降低率确定高效降胆固醇的菌株。具体测定方法取0.4mL培养前后的发酵液于比色管中，加入0.2mL邻苯二甲醛(lmg/mL，无水乙醇配制)和4mL混合酸(r冰醋酸/F浓硫酸=1:1)，充分混合后室温静置10min，以不含胆固醇的I号培养基为空白调O，于550nm测定吸光值(A)，在胆固醇-吸光值标准曲线上查得发酵前后胆固醇的含量(结果见表1)。表l不同乳酸菌株降低胆固醇的初筛试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>研究表明，采用高通量筛选技术和邻苯二甲醛法获得高效降低胆固醇的乳酸菌是KS4、KL1和Tx菌株。其中KS4菌株降低胆固醇能力最强，其次是KL1和Tx菌株。它们在有关文献报道中属于降低胆固醇能力较强菌株。将初筛后获得的具有高效降胆固醇的菌株，在含0.1%胆固醇和0.3%牛黄胆酸钠的MRS培养基平板上(分别以含0.1%胆固醇的MRS培养基、0.3%牛黄胆酸钠的MRS培养基作为对照)，对称放置牛津杯，加入O.lmLMRS培养菌液，于37'C厌氧培养34d后，观察牛津杯周围是否有银色沉淀现象，其结果见表2。阳性者以茚三酮法检测银色沉淀物中是否有胆盐的水解产物——氨基酸存在，根据蓝紫色反应初步确定菌株是否产生胆盐水解酶。将茚三酮反应阳性菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。表2产胆盐水解酶乳酸菌株复筛试验结果、一---一一一一菌株代号试验项目""""^^—KS4KL1Tx含胆固醇和牛黄胆酸钠的MRS培养基沉淀现象含胆固醇的MRS培养基沉淀现象含牛黄胆酸钠MRS培养基沉淀现象茚三酮反应检测胆盐的水解产物++++++++++++注"+"表示牛津杯周围有不同程度的银色沉淀现象；"_"表示无沉淀现象。由表1和表2结果显示，沉淀圈的大小与胆盐水解酶的活力和降低胆固醇的百分率成正比。复筛试验总体比较，菌株KS4、KL1和Tx能够高产胆盐水解酶，其中菌株KS4产酶能力最强，其次是KL1和Tx菌株。高效降低胆固醇的乳酸菌株源于其产生多量或高活力的胆盐水解酶。可利用这些高产胆盐水解酶的乳酸菌株进一步开发研制高效降胆固醇的蛋奶发酵饮料。2、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶乳酸菌株的鉴定常规生理生化试验鉴定糖醇类发酵试验，耐盐试验(7，/。NaCl)，不同温度试验(1(TC、40°C)。Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定挑取MRS平板上的目的单菌落划线接种于BUA+B平板上(含5%无菌脱纤维绵羊血)，37t:培养得到注"+"95%以上的菌株为阳性；"-"95%以上的菌株为阴性。实施例2、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶的马克斯克鲁维酵母(《/"pew加F幼附ara:/fl"附)Kl和M3菌株的筛选与鉴定1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶酵母菌株的筛选取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10'410'6的稀释菌液。以稀释倾注法接种平板，倒入含抗生素的马铃薯乳糖选择性培养基，28'C培养23d。根据酵母菌的菌落特征和水浸片镜检结果，将上述平皿目的菌落分别划线接种于相应斜面培养基上，28'C培养23d。转接种于马铃薯乳糖液体培养基中，28'C增菌培养23代，再以1%2%接种量分别转接入含胆固醇的I号培养基与含胆固醇和2°/。乳糖的1号培养基中，28'C培养20h后，以邻苯二甲醛比色法测定I号培养基中发酵前后胆固醇的含量，并计算胆固醇降低率(％)。根据胆固醇降低率确定高效降胆固醇的菌株。具体测定方法将培养前后的10mL发酵液以10000r/min离心10min，分别取0.4mL离心上清液于比色管中，加入0.2mL邻苯二甲醛(lmg/mL)和4mL混合酸(F冰醋酸/F浓硫酸=1:1)，充分混合后室温静置10单菌落后，以Biolog的专用接种液调整菌悬液的浊度至65±2%T，接种于AN微量鉴定板中，3537。C厌氧培养2448h后，于鉴定仪上读取鉴定结果。鉴定结果如表3所示。鉴定菌株KL1为干酪乳杆菌a。cto6acz'"wscasd),菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcMs/aWssubsp./acto)，菌株Tx为嗜热链球菌表3菌株KL1、KS4、Tx的鉴定项目与结果鉴定项目菌株代号KS4KL1++++++++i+++++i++i++++i++++i+a糖糖醇糖糖苷糖苷糖糖糖糖wcc、=1籽藻梨三叶萄杨二二,o。o^w棉海山蔗松七葡水松果蜜乳^S§料min，以不含胆固醇的I号培养基为空白调O，于550nm测定吸光值(A),在胆固醇-吸光值标准曲线上查得发酵前后胆固醇的含量(结果见表4)。表4不同酵母菌株降低胆固醇的初筛试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注表中数据为n=3测定之平均值。研究表明，Kl和M3菌株在含有乳糖与不含乳糖的I号培养基中降低胆固醇能力有所不同。Kl菌株在无乳糖的I号培养基比有乳糖的降低胆固醇的百分率相对较高；相反，M3菌株在有乳糖的I号培养基比无乳糖的降低胆固醇的百分率相对较高。初筛试验总体比较，M3菌株比K1菌株降低胆固醇能力较强。将初筛后获得的具有降胆固醇的菌株，在含0.1%胆固醇和0.3%牛黄胆酸钠的马铃薯乳糖培养基平板上(分别以含0.1%胆固醇的马铃薯乳糖培养基、含0.3%牛黄胆酸钠的马铃薯乳糖培养基作为对照)，对称放置牛津杯，加入O.lmL马铃薯乳糖培养菌液，于28'C厌氧培养3d后，再经4-C冷藏7d，分别测定牛津杯周围培养基内沉淀圈的大小，其结果见表2。根据沉淀圈的大小初步确定菌株是否产生胆盐水解酶及其活力和产量的高低。将产胆盐水解酶的菌株划线接种于马铃薯乳糖斜面试管，培养后保存备用。表5产胆盐水解酶酵母菌株复筛试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表4和表5结果显示，沉淀圈的大小与胆盐水解酶的活力和降低胆固醇的百分率成正比，而且发现冷藏温度下一周内沉淀圈会继续扩散，说明冷藏温度下酵母菌的胆盐水解酶活性较高于适宜生长温度条件。复筛试验总体比较，M3菌株比Kl菌株产生的胆盐水解酶活力较高。高效降低胆固醇的酵母菌株源于其产生多量或高活力的胆盐水解酶。可利用这些高产胆盐水解酶的酵母菌株进一步开发研制高效降胆固醇的蛋奶发酵饮料。2、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶酵母菌株的鉴定常规生理生化试验鉴定糖类发酵试验，碳源同化试验，氮源同化试验。Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定挑取28'C培养2d的马铃薯乳糖平板上的目的单菌落，划线接种于BUY平板上，2628t:培养2d得到单菌落后，用无菌超纯水接种液调整菌悬液的浊度至47±2°/。丁，接种于YT微量鉴定板中，2628'C培养24h、48h、72h后，于鉴定仪上读取鉴定结果。鉴定菌株K1和M3为马克斯克鲁维酵母C^wjveram;^esww;a'am^)。其结果如表6所示。表6菌株K1、M3的鉴定项目与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注"+"95%以上的菌株为阳性；"-"95%以上的菌株为阴性。实施例3、利用高产胆盐水解酶的三株乳酸菌及一株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇的蛋乳发酵饮料1、乳酸菌单一发酵剂的制备将lOmL脱脂乳装入试管，经0.07Mpa灭菌20min，冷却至37"C,以蜗巻接种环钓取23环分别接种产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4，嗜热链球菌Tx脱脂乳保藏菌株，37。C培养至乳凝固，如此活化23代。将上述活化好的菌株分别以1%2%接种量转接至10ml无菌脱脂乳中，37"C培养过夜至乳凝固，再以2%3%接种量转接至盛200ml灭菌牛奶三角瓶中，37。C培养至乳凝固，即为单一菌种发酵剂。2、酵母菌单一发酵剂的制备将lOmL改良马铃薯乳糖培养基装入试管，经0.07Mpa灭菌20min，冷却至28'C，以接种环钓取12环分别接种产胆盐水解酶的马克斯克鲁维酵母M3和Kl斜面保藏菌株，于28'C培养至培养液混浊，再以1%2°/。转接10ml改良马铃薯乳糖培养基中，28。C培养2021h(有大量气泡和菌体沉淀产生)，如此活化23代，以血球计数板法测定菌数达5xl(^7xl(^个/ml，冷藏备用。将上述活化菌株分别以1%2%接种量转接至10ml无菌脱脂乳中，28'C培养20h左右，如此活化23代，再以2。/。接种量转接至盛200ml灭菌牛奶三角瓶中，28'C培养20h左右，即为单一菌种发酵剂。3、降胆固醇蛋乳饮料生产发酵条件的优化(1)乳酸菌一次发酵(前期发酵)条件的优化原辅料配方全蛋液用量15%，原料奶用量35%，料水比l:l(附fO，蔗糖添加量7%(『/^)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉胶用量0.2%。原料经杀菌、冷却后进行乳酸菌一次发酵条件的优化。根据初步单因素多水平试验结果，选取影响降胆固醇蛋乳饮料品质较大的发酵温度、发酵时间、菌种比例和接种量进行四因素三水平[L9(3"]正交试验(见表7)，以酸度、感官评价综合评分(总分50分，其中色泽5分、滋味和气味30分、组织状态15分)作为试验测定指标，通过极差分析和方差分析确定其最佳一次发酵工艺条件。表7乳酸菌一次发酵条件优化正交试验设计因素水平表因素水平发酵温度rc)发酵时间(h)菌种比例接种量(％)Tx/KS4/KLl13761:0.5:0.5224081:1:13343102:0.5:0.54表8乳酸菌一次发酵条,化结果与初始发酵条件结果对照指标发酵发酵菌种比例接种量感官评价A550nm胆固醇降低率/%温度厂c时间/minTx/KS4/KLl/%/分ir鎌后对照组优化组3743881:1:11:1:13346.548.00.2710.2090.2710.18926.134.5通过对酸度、感官评价试验指标进行极差分析和方差分析，确定发酵时间是影响蛋乳发酵饮料品质的主要因素，发酵温度次之，接种量相对影响较小，菌种比例影响最小。为了获得高效降低胆固醇和优良品质的蛋乳发酵饮料，针对乳酸菌一次发酵条件进行了优化。通过正交试验，以酸度、感官评价为评价指标，确定降胆固醇的蛋乳饮料最佳一次发酵条件为发酵温度43i:，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例l:l:l，总接种量3%。由表8可见，在此优化发酵条件下，原料中胆固醇降低率为34.5%，而对照组为26.1%。(2)酵母菌二次发酵(后期发酵)条件的优化在乳酸菌最佳一次发酵条件前提下，根据初步单因素多水平试验结果，选取影响降胆固醇蛋乳饮料品质较大的发酵温度、发酵时间和接种量进行三因素三水平[L9(3"]正交试验(见表9、10)，以测定酸度、感官评价综合评分(总分20分，其中色泽5分、口感5分、滋味5分、香气5分〉作为试验指标，通过极差分析和方差分析确定其最佳二次发酵工艺条件。表9M3菌株二次发酵条件优化正交试验设计因素水平表水平因素发酵温度('c)发酵时间(h)接种量(％)13020123224233428表10Kl菌株二次发酵条件优化正交试验设计因素水平表水平因素发酵温度rc)接种量t(%)发酵时间(h)130122232226334330表ll酵母菌最佳二次发酵条件及产品指标测定结果指标发酵温度厂C发酵时间Anin乾《鹏*感官评价乙醇含量酸度/。T550nm胆固醇降低率/%/分/%繊后M3菌株Kl菌株323424261117.515.30,71.060620.4210.4210.1300.19075.059.6通过对酸度、感官评价试验指标进行极差分析和方差分析，确定发酵时间是影响蛋乳发酵饮料品质的主要因素，发酵温度次之，接种量相对影响较小。为了获得高效降低胆固醇和优良品质的蛋乳发酵饮料，针对K1或M3酵母菌株二次发酵条件进行了优化。通过正交试验，以酸度、感官评价为评价指标，确定降胆固醇的蛋乳饮料最佳二次发酵条件为发酵温度32'C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，发酵时间26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)，接种量P/。(K1或M3菌株)。由表11可知，在此优化发酵条件下制作的产品经4'C低温后熟ld后，M3和K1菌株对原料中的胆固醇降低率分别为75.0%和59.6%，进一步证明了M3菌株比K1菌株降低胆固醇能力较强。产品乙醇含量为0.7。/。1.0。/。(m/m)，酸度为6062°T。成品蛋乳饮料呈乳黄色，口感细腻、滑幼，爽口；风味独特，有浓郁的酯香风味伴着清淡的醇香，酸甜度适中；质地不分层也不絮凝，呈均匀一致的起泡性乳浊液。本试验利用三株高产胆盐水解酶的乳酸菌与一株酵母菌通过在优化条件下进行二步发酵，以及全蛋液在适宜条件下巴氏杀菌(67'C20min)，既掩盖了全蛋液浓厚的蛋腥味问题，又可降低原料中的胆固醇含量，是一种营养丰富，对人体健康有益的功能性饮品。故可利用产胆盐水解酶的益生菌株大规模生产降胆固醇的蛋乳发酵饮料。实施例4、利用高产胆盐水解酶的三株乳酸菌及两株酵母菌二步发酵法制备降胆固醇蛋乳发酵饮料1、乳酸菌复合发酵剂的制备按实施例3所述方法制备乳酸菌单一菌种发酵剂。在接种前将菌株Tx、KS4、KL1单一菌种发酵剂按l丄l比例均匀混合，即为乳酸菌复合发酵剂。2、酵母菌复合发酵剂的制备按实施例3所述方法制备酵母菌单一菌种发酵剂。在接种前将菌株M3和Kl单一菌种发酵剂按1:1比例均匀混合，即为酵母菌复合发酵剂。3、降胆固醇蛋乳饮料生产发酵条件的优化(1)乳酸菌一次发酵(前期发酵)条件的优化按实施例3所述方法，原辅料配方全蛋液用量15%,原料奶用量35%，料水比1:1(『/F)，蔗糖加量7。/。(『/F)，CMC-Na用量0.3。/。，卡拉胶用量0.2%。原料经杀菌、冷却后进行乳酸菌一次发酵条件的优化。乳酸菌最佳一次发酵条件为发酵温度43'C，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例为1:1:1，接种量3%。(2)酵母菌二次发酵(后期发酵)条件的优化在乳酸菌最佳一次发酵条件前提下，根据初步单因素多水平试验结果，选取影响降胆固醇蛋乳饮料品质较大的发酵温度、发酵时间和接种量进行三因素三水平[L9(3"]正交试验(见表12)，以测定酸度、感官评价综合评分(总分50分，其中色泽5分、滋味和气味30分、组织状态15分)作为试验指标，通过极差分析和方差分析确定其最佳二次发酵工艺条件。表12M3与Kl菌株二次发酵条件优化正交试验设计因素水平表水平因素发酵温度rc)发酵时间(h)接种量(％)130241232262334283表13酵母菌二次发酵条件优化结果与初始发酵条件结果对照发酵发酵蓉《鄉iS感官评价/分乙醇含量/%酸度/。TA550nm胆固醇指标温度厂c时间/hmttr纖后降低率/%对照组优化组343028243140.146.71.050.7564600.2920.0750.2920.06383.989.3通过对酸度、感官评价试验指标进行极差分析和方差分析，确定发酵温度是影响蛋乳发酵饮料品质的主要因素，发酵时间次之，接种量相对影响较小。为了获得高效降低胆固醇和优良品质的蛋乳发酵饮料，针对M3与Kl酵母菌株二次发酵条件进行了优化。通过正交试验，以酸度、感官评价为评价指标，确定降胆固醇的蛋乳饮料最佳二次发酵条件为发酵温度30。C,发酵时间24h，Kl/M3菌种比例1:1，接种量1%。由表13可知，在此优化发酵条件下制作的产品经4。C低温后熟ld后，原料中的胆固醇降低率为89.3%,产品乙醇含量为0.75%(m/m)，酸度为60°T。成品蛋乳饮料色泽呈乳黄色，口感细腻、幼滑、爽口，酸甜度适中；风味独特，有浓郁的酯香风味伴着清淡的醇香，蛋腥味不明显;质地不分层亦无絮凝沉淀，组织状态呈均匀一致的起泡性乳浊液。在63°O30min热处理条件下进行巴氏杀菌，蛋乳饮料未出现乳清分离和沉淀现象。其风味和感官状态未发生变化。但是，为了保持蛋乳发酵饮料的生物活性，可省去加热杀菌工序。4、邻苯二甲醛法测定蛋乳发酵饮料中胆固醇的含量试管中加入发酵蛋奶样品l.OOg，加入23mL甲醇氯仿混合液(F甲e/T氣仿=2:1)，混匀，于45'C水浴加热15min，滤纸过滤于具塞比色管中，并补充甲醇氯仿混合液至10mL。取上述样品处理液0.4mL，加入lmg/mL的邻苯二甲醛(无水乙醇配制)0.2mL、混合酸(K蹄酸/F浓硫酸=l:l)4.0mL，于2037。C静置10min。以试剂空白(甲醇氯仿混合液0.4mL、邻苯二甲醛0.2mL、混合酸4.0mL)调零，于波长550nm处测定样品的吸光值。将测得样品吸光度y值代入胆固醇-吸光值标准曲线中的线性回归方程少=0.0026x+0.0333(及2=0.9959)求得胆固醇含量x值(mg/100mL)。胆固醇降低率(％)=(发酵前胆固醇含量-发酵后胆固醇含量)/发酵前胆固醇含量。蛋乳饮料不同发酵阶段降低胆固醇的效果如表14所示。表14乳酸菌与酵母菌在不同发酵阶段降低胆固醇的效果指标A550nm胆固醇降低率/%s-酵母菌二次发酵后熟享,爛-酵母菌二^次发酵后熟优化组0.2920.1970.0730.06136.784.789.3对照组0.2920.2210.0930.07527.576.983.9由表14可见，利用乳酸菌复合发酵剂在最佳一次发酵条件下(发酵温度43°C，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例1:1:1，总接种量3%)进行前期发酵，乳酸菌对原料胆固醇的降低率为36.7%，由此证明乳酸菌产生的胆盐水解酶在体外具有较好降胆固醇作用。为了进一步增强降低胆固醇效果，本试验在乳酸菌最佳一次发酵条件前提下，利用酵母菌复合发酵剂在最佳二次发酵条件下(发酵温度3(TC，发酵时间24h，M3/K1菌种比例1:1，总接种量1%)进行后期发酵。结果表明，酵母菌对原料胆固醇的降低率为84.7%，说明马克斯克鲁维酵母合成的胆盐水解酶活力及其产量明显高于乳酸菌，在体外具有高效降低食品中胆固醇的作用。发酵产品经4t:低温后熟ld,原料胆固醇的降低率提高至89.3%，进一步证明了马克斯克鲁维酵母胆盐水解酶在冷藏温度下仍然维持较高活性。显示发酵后的产品经过后熟阶段，不仅继续降低原料胆固醇含量，而且能够提高产品品质，使蛋乳发酵饮料的风味更加柔和，清凉爽口。本试验利用三株高产胆盐水解酶的乳酸菌与两株酵母菌通过在优化条件下进行二步发酵，以及全蛋液在适宜条件下巴氏杀菌(67-C，20min)，既掩盖解决了全蛋液浓厚的蛋腥味问题，又可高效降低原料中的胆固醇含量，是一种集营养与保健为一体的功能性饮品。故可利用高产胆盐水解酶的益生乳酸菌与酵母菌株大规模生产降胆固醇的蛋乳发酵饮料。本专利所属项目h北京市自然科学基金"藏灵菇克鲁维酵母菌降胆固醇作用及机理的研究"项目编号5092008项目起止时间2009.01-2011.12项目负责人刘慧本专利所属项目2:北京市自然科学基金"藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究"项目编号5062006项目起止时间2006.01-2008.12项目负责人刘慧本专利所属项目3:北京市大学生科学研究与创业行动计划"藏灵菇源益生菌降胆固醇蛋乳发酵饮料的研制"项目起止时间2008.09-2009.06项目申请人贾慧项目指导教师刘慧。权利要求1、利用产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法，其技术特征在于从藏灵菇中筛选获得5株高产胆盐水解酶(BSH)的乳酸菌、酵母菌，均具有高效降低胆固醇和优良发酵性能。菌株产生的BSH及胞外多糖不仅具有免疫调节、降胆固醇及抗肿瘤等功效，而且通过蛋液适当杀菌及蛋乳二步发酵，既解决原料蛋腥味问题，又可高效降低原料胆固醇含量，发酵产品属于一种功能性饮品。2、根据权利要求1所述的用于生产降胆固醇蛋乳发酵饮料的5株具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌属于本发明保护范围。3株乳酸菌的分类命名是菌株虹1为干酪乳杆菌(丄""0&"7/"1^0^/)(00^10:]^1809)，菌株Tx为嗜热链球菌(5^e/tococcwAem7o/M^)(CGMCCJ^1810)，菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(丄"ctococc^/ac泡subsp./acfe)(CGMCC地1807);2株酵母菌的分类命名是菌株Kl为马克斯克鲁维酵母CS:/w"eram;;cesm^jd^ms)(CGMCCJV21812),菌株M3为马克斯克鲁维酵母(《/w;^era/w;;caswarar/am^)(CGMCCW1811)。3、根据权利要求1所述的利用5株具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的配方、最佳发酵工艺条件及其产品与专用生产菌株也属于本发明保护范围。原辅料配方全蛋液15%，牛奶35%，料水比1:1(附D，蔗糖7。/。(附F)，CMC-Na0.3%，卡拉胶0.2%。全蛋液最佳杀菌条件67。C，20min。利用干酪乳杆菌KL1，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4，嗜热链球菌Tx的一次最佳发酵工艺条件为发酵温度43°C，发酵时间8h，Tx/KS4/KLl菌种比例1:1:1，复合发酵剂接种量3%。利用马克斯克鲁维酵母M3和Kl的二次最佳发酵工艺条件为①发酵工艺1:Kl或M3菌株单一发酵剂接种量为1%，发酵温度32°C(K1菌株)及34'C(M3菌株)，发酵时间26h(Kl菌株)及24h(M3菌株)；②发酵工艺2:发酵温度3(TC，发酵时间24h，Kl/M3菌种比例l:l，复合发酵剂接种量1%。二次发酵后于4t:后熟ld。全文摘要本发明涉及一种利用产胆盐水解酶(BSH)的乳酸菌、酵母菌制备降胆固醇蛋乳发酵饮料的方法，属于一种功能性饮品。配方全蛋液15％，牛奶35％，料水比1∶1(W/V)，蔗糖7％，CMC-Na0.3％，卡拉胶0.2％。一次发酵条件嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、干酪乳杆菌KL1按1∶1∶1比例混合，接种量3％，43℃发酵8h。二次发酵条件马克斯克鲁维酵母M3和K1复合(1∶1)或单一菌种接种量1％，30℃(复合菌)或32～34℃发酵24～26h，4℃后熟1d，原料胆固醇降低率最高达89.3％。利用菌株高产BSH、胞外多糖等特性，不仅有免疫调节、降胆固醇及抗肿瘤等功效，而且通过蛋液适当杀菌及蛋乳二步发酵，既解决蛋腥味问题，又可高效降低原料胆固醇含量。本发明制作蛋乳饮料的发酵工艺简单，周期短，成本较低，适于工业化生产。文档编号A23L2/38GK101642274SQ20091009138公开日2010年2月10日申请日期2009年8月21日优先权日2009年8月21日发明者慧刘,嵩张,张红星,徐振杰,彦梁,慧贾,赵贵龙,钟思琼申请人:北京农学院