耐受非蛋白质氨基酸的转基因植物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了耐受生物除草剂特别是植物毒性非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸(m-酪氨酸)氨基酸类似物和其盐的转基因植物。本发明还提供了用于制备该转基因植物的手段和方法。
【专利说明】耐受非蛋白质氨基酸的转基因植物
发明领域
[0001]本发明涉及耐受生物除草剂特别是植物毒性非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸氨基酸类似物和其盐的转基因植物，并涉及用于制备该转基因植物的方法。
[0002]发明背景
[0003]“化感作用(allelopathy) ”是指植物通过该植物向环境中释放的化学物质(化感物质(allelochemical))对周围的物种的影响(抑制或刺激)的术语。化感物质通常是可在任何植物部分被合成的并可对靶生物体具有有利(正向化感作用)或不利(负面化感作用)影响的次生代谢物。化感物质不是化感作用(耐受)植物的代谢(即生长、发育和繁殖)所需要的，而干扰非耐受物种的重要代谢途径，为耐受植物提供相对优势。化感作用效应在希腊时代已被意识到。数种广泛使用的作物植物诸如小麦、水稻和黄瓜的化感作用效应的优势是已知的并被使用。最近，在杂草管理方面实施这一现象的可能性的意识已出现。在其它观察到的化感物质中，显示有前景的植物毒性活性的间-酪氨酸，被提议作为可能的环境友好的杂草抑制剂(Bertin C.等人，2007.Proceedings of the National Academyof Sciences of U.S.A104, 16964-16969)。
[0004]间-酪氨酸(m-Tyr)是天然存在的非蛋白质氨基酸。其可通过两种可能的合成途径被生产:通过多巴胺合成的通路或通过苯丙氨酸被活性氧(reactive oxygen species)的氧化。常见蛋白质氨基酸酪氨酸(对-酪氨酸)的异构体(isomer)m-Tyr，已在番樱桃大戟(Euphorbia myrsinites)(驴尾大戟)和一些羊茅草物种中被发现。源自植物的m_Tyr被发现对广泛的物种是有 毒的。以低至2 μ M的浓度添加至琼脂介质的m-Tyr抑制拟南芥(Arabidopsis thaliana)根的生长的50 且50 μ M的浓度完全阻止种子萌发(BertinC.等人2007，同上)。
[0005]蛋白质中间-酪氨酸(m-Tyr)连同邻-酪氨酸(o_Tyr)和左旋多巴(L_dopa)的出现已被广泛用作针对蛋白质造成的氧化损伤的程度的指标。已证明，在真核细胞中，某些外源提供的氧化的氨基酸包括m-Tyr，可通过生物合成通路而不是经由化学反应掺入蛋白质。因此，在许多情况下，体内受损的氨基酸可用于蛋白质的从头合成是可能的。该理论被以下的发现支持:暴露于m-Tyr导致宽范围的植物物种包括商业上重要的单子叶和双子叶作物植物的生长抑制。已进一步表明，m-Tyr的植物毒性是通过在蛋白质合成期间其代替苯丙氨酸掺入蛋白质导致的。
[0006]苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)属于氨酰-tRNA合成酶(aaRS)家族，其在遗传密码的翻译中起关键作用。aaRS确保遗传密码翻译的保真度，将适当的氨基酸共价附着至相应的核酸接头分子(adaptor molecule)-tRNA。aaRS是众所周知的多样化酶家族,在一级序列、亚基大小和低聚组织方面显著不同。系统发生和结构分析揭示了 PheRS的三种主要形式:a)异源四聚的(α β)2细菌PheRS ；b)异源四聚的(α β ) 2古细菌/真核-细胞质PheRS ;和c)单体线粒体PheRS。
[0007]由aaRS且特别是PheRS促进的氨酰化反应的精确度，基于氨基酸底物的精确识另O。然而，由于由数个氨基酸共享立体化学相似性，发生识别错误。苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)仅通过芳环的一个羟基基团被区分，并因此Phe和Tyr之间的区分并非总是被实现。PheRS以1:1000的错误率成功地区分这些氨基酸。通过PheRS连同其它aaRS的校正活性(editing activity)确保了蛋白质生物合成的总精确度的较高水平。校正活性与特异性位点相关，其中错酰化(misacylated)的tRNA被水解。
[0008]本发明的一些发明人及同事研究了不同来源包括细菌(嗜热栖热菌(Thermusthermophilus, Tt)和大肠杆菌(Escherichia col i, Ec))及人(细胞质(Hsct)和线粒体(Hsmt))来源的PheRS激活m-Tyr并将其附着至tRNAphe的能力(K1 ipcan, L.，等人，2009.Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A106, 11045-11048)。自由基损伤的(radical-damaged)氨基酸通过这些酶被激活，如通过ATP水解测定的。氨酰化的稳态动力学测量(由酸性凝胶电泳方法测定)未显示tRNAphe与m-Tyr通过细菌PheRS的错载(mischarging)(图1)。该观察结果作为用于校正机制效率的指示。此外，当细菌PheRS与预装载的m-Tyr-tRNAphe —起孵育时，m-Tyr从tRNA脱酰化，提供了所谓的反式校正活性(trans-editing activity)的证据(Ling, J.等人，2007.Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A104, 72-77)。与此相反，线粒体酶可以稳定地合成m-Tyr-tRNAphe。HsmtPheRS不包含校正结构域，并因此不能使非关联(cognate)氨基酸从 tRNA 脱酸化(Roy, H.等人,2005.The Journal of biologicalchemistry280, 38186-38192 ；Kotik-Kogan, 0.等人，2005.Structured, 1799-1807)，为这些残基掺入蛋白质多肽链提供路径。tRNAphe氨酰化的动力学参数分析表明，通过HsmtPheRS附着的m-Tyr的催化效率(keat/Km)只比正确的氨基酸低5倍，主要是由于较高的Km值。线粒体PheRS对m-Tyr的相对高的催化活性和缺乏校正活性可以解释m_Tyr具有对植物的极大的毒性作用。在植物中，超过150种蛋白质在线粒体和叶绿体中表达，且存在于植物细胞器中的单体苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)与人类线粒体PheRS非常相似。因此，m_Tyr代替Phe掺入至细胞器蛋白质导致大量损伤的蛋白质，因此降低细胞活力。m-Tyr对哺乳动物细胞的中等毒性可以通过在这些细胞中线粒体仅编码13种蛋白质的事实来解释。
[0009]减少除草剂的使用已成为保持可持续农业和景观管理中的显著目标。在发展用于杂草控制的可有效取代危险化学品的使用的生物和有机方法中存在不断的努力。与此同时，采取分子遗传学方法和/或采用天然产物努力实现用于保护作物植物免受植物毒性化合物损害的手段和方法。
[0010]例如，国际PCT申请公布号W0/2005/077171公开了用于通过用一种或多种氨基酸包衣或引发种子以赋予对除草剂的耐受性，保护植物免受除草剂伤害和损伤的方法，所述除草剂破坏了用除草剂处理的植物的氨基酸的生产。
[0011]m-Tyr对植物的显著毒性而对真菌、哺乳动物或细菌的降低的作用，导致其开发作为生物除草剂。美国专利申请公布号20080261815公开了使用来自羊茅草物种的间-酪氨酸化合物抑制杂草生长并增强非杂草植物的生长的方法，并且还公开了鉴定具有除草剂性质的植物的方法。使用间-酪氨酸作为生物除草剂的不足是，其不仅对杂草而且对作物植物都是有毒的。
[0012]对将高效实现用于产生耐受植物毒性化感物质例如非蛋白质氨基酸包括间-酪氨酸的转基因植物特别是作物植物或观赏植物的手段存在公认的需求。
[0013]发明概述[0014]本发明提供了用于赋予转基因植物耐受植物生长介质中存在的植物毒性非蛋白质氨基酸的手段和方法。本发明还提供了耐受植物毒性非蛋白质氨基酸特别是间-酪氨酸(m-Tyr)和其盐的转基因植物。
[0015]本发明部分基于以下意外的发现:在植物细胞内表达细菌苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)，特别是当PheRS在线粒体和/或叶绿体中表达时，赋予了植物对间-酪氨酸的耐受性。该耐受性是由于引入的细菌PheRS水解错酰化的m-Tyr-tRNAphe并阻止非蛋白质氨基酸掺入蛋白质的能力。
[0016]因此，根据一个方面，本发明提供了包含至少一种含有编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的细胞的转基因植物，该aaRS或其片段包含能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA的校正模块，其中该植物耐受非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
[0017]在本发明的上下文中，术语“耐受非蛋白质氨基酸类似物”指的是转基因植物在以显著抑制相应非转基因植物生长的浓度包含非蛋白质氨基酸类似物的生长介质中生长的能力。根据某些实施方案，生长抑制表现为以下的至少一种:减小的根长、减小的根径(rootradical)、减小的根质量、减小的植株高度、植物组织形态或颜色的异常变化、减小的植物芽(shoot)质量和/或芽数，和其任何组合。根据一些实施方案，分离的非蛋白质氨基酸类似物或包含其的组合物被添加至生长介质。根据其它实施方案，非蛋白质氨基酸类似物从产生其的植物分泌至 生长介质。
[0018]根据某些实施方案，非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物，且aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
[0019]根据某些实施方案，m-Tyr化合物具有式I的结构式或其盐:
[0020]式1:
[0021]
【权利要求】
1.一种转基因植物，所述转基因植物包含至少一个包含编码氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的细胞，所述aaRS或其片段包括能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA的校正模块，其中所述植物耐受所述非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物生长在以显著抑制相应的非转基因植物生长的浓度包含所述非蛋白质氨基酸或其盐的介质中。
3.根据权利要求3所述的转基因植物，其中生长抑制表现为以下的至少一种:减小的根长、减小的根径、减小的根质量、减小的植株高度、植物组织形态或颜色的异常变化、减小的植物芽质量、减小的植物芽数，和其任何组合。
4.根据权利要求1所述的转基因植物，其中所述非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物,且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式I的结构式或其盐:
6.根据权利要求5所述的转基因植物，其中所述m-Tyr化合物具有式II的结构式:
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述PheRS是包含2个PheRS-α和2个PheRS-β链的异源四聚的细菌PheRS。
8.根据权利要求7所述的转基因植物，其中所述细菌PheRS选自由以下构成的组:大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)PheRS 和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)PheRS。
9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述大肠杆菌PheRS-α由具有SEQIDNO:1中列出的核酸序列的多核苷酸编码，且所述大肠杆菌PheRS-β由具有SEQ ID Ν0:2中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
10.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述大肠杆菌PheRS-α包含SEQID NO: 3中列出的氨基酸序列，且所述大肠杆菌PheRS-β包含SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
11.根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述嗜热栖热菌PheRS-α包含SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜热栖热菌PheRS-β包含SEQ ID Ν0:6中列出的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的转基因植物，其中编码所述aaRS或其片段的所述多核苷酸还包含编码选自由以下构成的组的靶向肽的核酸序列:线粒体靶向肽和叶绿体靶向肽。
13.根据权利要求1所述的转基因植物，所述植物包含编码所述aaRS或其片段的还包含编码线粒体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，与编码所述aaRS或其片段的还包含编码叶绿体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的组合。
14.根据权利要求12-13中任一项所述的转基因植物，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都由具有SEQ ID N0:7中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
15.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都包括SEQ ID N0:8中列出的氨基酸序列。
16.一种由根据权利要求1所述的转基因植物产生的植物种子，其中所述种子用于培育包含编码具有校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的转基因植物，所述校正模块能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA，其中所述转基因植物耐受所述非蛋白质氨基酸类似物和其盐。
17.—种组织培养物，包含根据权利要求1所述的植物的至少一个转基因细胞或源自其的原生质体。
18.根据权利要求17所述的组织培养物，其中所述组织培养物再生包含编码具有校正模块的氨酰tRNA合成酶(aaRS)或其片段的至少一种外源多核苷酸的转基因植物，所述校正模块能够水解被非蛋白质氨基酸类似物错酰化的tRNA，所述转基因植物耐受所述非蛋白氨基酸类似物和其盐。
19.一种用于生产耐受植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物的方法，所述方法包括(a)用编码包含校正模块的氨酰tRNA合成酶aaRS或其片段的至少一种外源多核苷酸转化植物细胞，所述校正模块能够水解非蛋白质氨酰化的tRNA;及(b)再生转化的细胞为耐受所述植物毒性非蛋白质氨基酸类似物或其盐的转基因植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述非蛋白质氨基酸类似物是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物,且所述aaRS是苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述PheRS是包含2个PheRS-α和2个PheRS-β链的异源四聚的细菌PheRS。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细菌PheRS选自由以下构成的组:大肠杆菌(E.coli)PheRS和嗜热栖热菌PheRS。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述大肠杆菌PheRS-a由具有SEQID N0:1中列出的核酸序列的多核苷酸编码，且所述大肠杆菌PheRS-β由具有SEQ ID Ν0:2中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
24.根据权利 要求22所述的方法，其中所述嗜热栖热菌PheRS-a包括SEQID N0:5中列出的氨基酸序列，且所述嗜热栖热菌PheRS-β包括SEQ ID Ν0:6中列出的氨基酸序列。
25.根据权利要求19所述的方法，其中编码所述aaRS或其片段的所述多核苷酸还包含编码选自由以下构成的组的靶向肽的核酸序列:线粒体靶向肽和叶绿体靶向肽。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物细胞被编码所述aaRS或其片段的还包含编码线粒体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸，与编码所述aaRS或其片段的还包含编码叶绿体靶向肽的所述核酸序列的所述多核苷酸的组合转化。
27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都由具有SEQ ID N0:7中列出的核酸序列的多核苷酸编码。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述线粒体靶向肽和所述叶绿体靶向肽的每一个都包含SEQ ID N0:8中列出的氨基酸序列。
29.一种由根据权利要求19所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物耐受所述植物毒性非蛋白质氨基酸。
30.根据权利要求29所述的转基因植物，其中所述植物生长在以显著抑制相应的非转基因植物生长的浓度含有所述非蛋白质氨基酸或其盐的介质中。
31.根据权利要求29所述的转基因植物，其中所述植物毒性非蛋白质氨基酸是间-酪氨酸(m-Tyr)化合物。
【文档编号】C12N9/00GK103946376SQ201280053924
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年11月1日 优先权日:2011年11月3日
【发明者】马克·萨夫罗, 利龙·克利普肯, 因巴尔·梅蒙, 伊加尔·菲纳罗夫 申请人:耶达研究与发展有限公司