一种从罗汉果废弃物中富集谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从罗汉果废弃物中富集谷氨酸脱羧酶制备γ?氨基丁酸的方法，属于有机酸生产领域。本发明将从罗汉果废弃物中的罗汉果果籽中提取的谷氨酸脱羧酶用于生物催化生产GABA，大大提高了罗汉果在生产中的使用效率。按照本发明所述的方法所得到的GABA产品经高效液相色谱法检测，谷氨酸转化率为99％，GABA收率大于95％。本发明生产GABA的过程未使用对人体有害的有机溶剂，生产过程绿色环保，产品安全，可用于食品、医药行业。
【专利说明】
一种从罗汉果废弃物中富集谷氨酸脱羧酶制备γ -氨基丁酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种从罗汉果废弃物中富集谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法，属于氨基酸及其衍生物生产领域。
【背景技术】
[0002]γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，由谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸的α-脱羧反应生成，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并具有调节血压与心率、增强脑活力、活化肝肾功能、改善更年期综合症等多种功效。鉴于GABA具有众多良性生理功能，现在GABA已被作为一种新型功能因子广泛应用于食品、医药等行业。在我国食品行业，国家卫生部于2009年9月27日第十二号公告批准GABA为新资源食品，其相关的保健制品也在国内保健品市场上快速成长起来。
[0003]目前工业上制备GABA作为安全级食品添加剂主要通过植物提取和生物合成法获得。自然界植物中GABA含量少且较难分离，工艺复杂且成本较高，无法大规模生产获得。生物合成法相对而言是一种安全经济的方法，在大肠杆菌发酵过程中利用其产生的谷氨酸脱羧酶作用将L-谷氨酸转化为GABA，再分离纯化获得GABA产品。但使用大肠杆菌制备食品添加剂尚无国家标准认可，存在安全性的问题，因此从自然界植物中富集天然谷氨酸脱羧酶并催化L-谷氨酸制备GABA可解决生产成本过高和食品安全隐患的问题。
[0004]罗汉果作为我国特有植物，因地域优势为罗汉果各方面研究提供了便利，对其研究主要集中在罗汉果复配及罗汉果甜苷V的提取纯化工艺。罗汉果提取的主要方式为果肉破碎、水提、浓缩、离子交换树脂脱色、打孔熟知吸附分离及氧化铝层析，最后经浓缩干燥得到产品。在罗汉果产品生产中往往将罗汉果果籽、果茎剔除，使得罗汉果未被充分利用，且增加了废弃物料的处理成本。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种从罗汉果果籽中富集谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤:
[0006](I)原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎；
[0007](2)谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为Ikg:(1-6 )L，提取过程中进行搅拌，28-30°C提取12-15h;提取液经离心过滤后得粗酶液。
[0008]在本发明的一种实施方式中，将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50mM的PH7.5磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为lkg:5L，提取过程中进行搅拌，30°C提取15h;提取液经卧式螺旋离心机、管式离心机、超滤后得粗酶液。
[0009]在本发明的一种实施方式中，卧式螺旋离心的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm，超滤中使用超滤膜节流分子量为20_60kDa。
[0010]本发明还提供一种应用上述方法得到的谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸生成GABA的方法:
[0011 ] (I)L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸为IL: (1-3)kg的比例，将L-谷氨酸添加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37°C催化10h。
[0012](2)脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，按1:(5-8)的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80°C烘干。
[0013]在本发明的一种实施方式中，步骤(I)，粗酶液与L-谷氨酸的用量比例为IL:3kg。
[0014]在本发明的一种实施方式中，步骤(I)，粗酶液与L-谷氨酸的用量比例为IL:1kg。
[0015]在本发明的一种实施方式中，步骤(2)，按1:8的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合。
[0016]本发明对罗汉果提取甜味剂后废弃物进行研究，将罗汉果废弃物中的罗汉果果籽提取的谷氨酸脱羧酶用于生物催化生产GABA，大大提高了罗汉果在生产中的使用效率。按照本发明所述的方法所得到的GABA产品经高效液相色谱法检测，谷氨酸转化率为99%，GABA收率大于95 %。
【附图说明】
[0017]图1不同提取溶剂添加比例对粗酶液中谷氨酸脱羧酶酶活的影响；其中:1-6号分别为罗汉果果籽与提取溶剂比例为1: 1、1: 2、1: 3、1:4、1:5和1:6。
[0018]图2不同提取溶剂添加比例对GABA得率的影响；其中:1-6号分别为罗汉果果籽与提取溶剂比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5和1:6。
[0019]图3不同磷酸吡哆醛添加量对GABA得率的影响；其中:I号不添加磷酸吡哆醛，2号添加0.02g/L磷酸吡哆醛。
[0020]图4不同L-谷氨酸添加量对GABA得率的影响，其中:1_4号分别为粗酶液与L-谷氨酸比例为1:1、1:2、1:3和1:4。
[0021 ]图5不同酒精比例对GABA得率的影响，其中:1_5号分别为酒精与催化液体积比例为1:5、1:6、1:7、1:8和1:9。
【具体实施方式】
[0022]酶活测定方法:取0.5mL粗酶液，加0.2mo 1/L的谷氨酸溶液(pH4.6) 1mL，于37 °C恒温水浴中，2001'/111；[11下振荡反应10111；[11后，立即沸水浴1min终止反应，10000r/min离心5min，收集上清液;量取1.0mL上清液于三角瓶中，加入39.0mL蒸馏水，混匀，吸取1.0mL于带塞试管中，加入ImL质量分数6%的苯酚和0.4mL次氯酸钠(活性氯质量分数多5.2% )，充分混匀，沸水浴1min后冰水浴20min，再加入3.1mL蒸馏水，然后在630nm处测吸光度;制作γ -氨基丁酸含量与吸光度关系的标准曲线，根据标准曲线和所测吸光度，计算出酶活。酶活力单位定义:在反应液中，每分钟催化底物生成Iymol γ -氨基丁酸所需的酶量为I个活力单位(U)。
[0023]GABA测定方法:按照国标QB/T 4587-2013进行。
[0024]实施例1
[0025]1.原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎；
[0026]2.谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50mM pH7.5磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例分别为1:1(1^:0、1:2(1^:1^)、1:3(1^:1^)、1:4(1^:0、1:5(1^:0和1:6(1^:0，提取过程中进行搅拌，30°(:提取1511。提取液经卧式螺旋离心机、管式离心机、超滤后得粗酶液，其中所述卧式螺旋离心的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm，超滤中使用超滤膜节流分子量为20_60kDa。
[0027]3.L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸为IL: 3kg的比例将L-谷氨酸加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0028]4.脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，然后按1:8的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80°C烘干。
[0029]从图1结果可以看出，随着罗汉果果籽与提取溶剂的比例从1:1提高至1:5，粗酶液中谷氨酸脱羧酶酶活从27U/mL提高至40U/mL，而1:6比例提取的粗酶液的酶活比1:5提取的粗酶液低，为39U/mL;从图2结果可知，随着罗汉果果籽与提取溶剂的比例从1:1提高至1:5，GABA得率逐渐提高，从80 %提高至98 %，而1:6比例提取的粗酶液用于生产GABA时，GABA得率与1:5比例相当，故选用罗汉果果籽与提取溶剂比例为1: 5。
[0030]实施例2
[0031 ] 1.原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎；
[0032]2.谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50mM pH7.5磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为l:5(kg:L)，提取过程中进行搅拌，30°C提取15h。提取液经卧式螺旋离心机、管式离心机、超滤后得粗酶液，其中所述卧式螺旋离心的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm，超滤中使用超滤膜节流分子量为20_60kDa。
[0033]3.L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸为IL: 3kg的比例将L-谷氨酸加到粗酶液中，分别不添加和添加0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0034]4.脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，然后按1:8的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80°C烘干。
[0035]结果表明(图3)，不添加磷酸吡哆醛GABA得率为仅为12%，而添加0.02g//L磷酸吡哆醛GABA得率为98%。故在GABA催化反应中需添加0.02g/L磷酸吡哆醛。
[0036]实施例3
[0037]1.原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎；
[0038]2.谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50mM pH7.5磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为l:5(kg:L)，提取过程中进行搅拌，30°C提取15h。提取液经卧式螺旋离心机、管式离心机、超滤后得粗酶液，其中所述卧式螺旋离心的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm，超滤中使用超滤膜节流分子量为20_60kDa。
[0039]3.L-谷氨酸催化:分别按1: 1、1:2、1:3、1:4(粗酶液:L-谷氨酸，L: kg)比例加入L-谷氨酸于粗酶液中，添加0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0040]4.脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，然后按1:8的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80°C烘干。
[0041 ] 结果表明(图4)，当粗酶液与L-谷氨酸比例从1:1提至1: 3，GABA得率均为98%。而粗酶液与L-谷氨酸比例为1:4时，L-谷氨酸未能完全转化，GABA得率为87%。故GABA催化反应选用粗酶液与L-谷氨酸比例为1: 3。
[0042]实施例4
[0043]1.原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎；
[0044]2.谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50mM pH7.5磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为l:5(kg:L)，提取过程中进行搅拌，30°C提取15h。提取液经卧式螺旋离心机、管式离心机、超滤后得粗酶液，其中所述卧式螺旋离心的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm，超滤中使用超滤膜节流分子量为20_60kDa。
[0045]3.L-谷氨酸催化:按1:3 (粗酶液:L-谷氨酸，L: kg)比例加入L-谷氨酸于粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37 °C催化I Oh。
[0046]4.脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，分别按1:5、1:6、1:7、1:8和1:9的体积比将体积分数为95 %的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80 0C烘干。
[0047]结果表明(图5)，按1:5、1:6、1:7、1:8的体积比将体积分数为95 %的乙醇溶液与脱色液混合后结晶，GABA得率逐渐提高，得率分别为70%、75%、89%和98%。继续提高体积比为1:9，结晶GABA得率相当，所以选用1:8体积比添加95%的乙醇进行结晶。
[0048]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1.一种获得谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎； (2)谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为Ikg:(1-6 )L，提取过程中进行搅拌，28-30°C提取12-15h;提取液经离心过滤后得粗酶液。2.根据权利要求1所述的一种获得谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，提取溶剂为50mM的pH7.5磷酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的一种获得谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，罗汉果果籽与提取溶剂比例为I kg: 5L，提取过程中进行搅拌，30 °C提取15h。4.根据权利要求1所述的一种获得谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，提取液经卧式螺旋离心机离心、管式离心机离心、超滤后得粗酶液，卧式螺旋离心机的转速为2500rpm，管式离心机转速为12000rpm。5.根据权利要求1所述的一种获得谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，提取液过滤时使用超滤膜节流分子量为20-60kDa的超滤膜。6.一种应用谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸生成GABA的方法:其特征在于，包括以下步骤: (1)原料前处理:罗汉果果籽洗净、破碎； (2)谷氨酸脱羧酶富集:将破碎后的罗汉果果籽进行浸提，提取溶剂为50-60mM的pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，罗汉果果籽与提取溶剂比例为Ikg:(1-6 )L，提取过程中进行搅拌，28-30°C提取12-15h;提取液经离心过滤后得粗酶液； (3)L-谷氨酸催化:按粗酶液:L-谷氨酸为lL:(l-3)kg的比例，将L-谷氨酸添加到粗酶液中，加入0.02g/L磷酸吡哆醛，37°C催化1h; (4)脱色、结晶和干燥:采用活性炭脱色，按1:(5-8)的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合，结晶过夜，抽滤，80 0C烘干。7.根据权利要求6所述的方法:其特征在于，步骤(3)，粗酶液与L-谷氨酸的用量比例为1L:3kg08.根据权利要求6所述的方法:其特征在于，步骤(3)，粗酶液与L-谷氨酸的用量比例为1L:1kg09.根据权利要求6所述的方法:其特征在于，步骤(4)，按1:8的体积比将体积分数为95%的乙醇溶液与脱色液混合。
【文档编号】C12N9/88GK105925557SQ201610415106
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】窦文芳, 许伟, 黄华学, 谢雁飞, 黄河
【申请人】无锡布莱尼斯生物科技有限公司, 湖南华诚生物资源股份有限公司