一种st细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法
【专利摘要】本发明提供一种适用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基。
【专利说明】一种ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配制和使用方法，更具体的，涉及一 种用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒（CSFV)引起的一种高度接触 性热性传染病，它具有高度的传染性和致死性，给养猪业造成了严重的经济损失。目前，接 种猪瘟疫苗是控制猪瘟的重要手段。用于制备猪瘟疫苗的细胞有ST细胞、PK-15细胞、SK-6 细胞及MPK细胞等。
[0003] 猪瘟疫苗的生产工艺目前主要是转瓶培养，进行大规模生产时：（1)需要大量的 人力物力，生产效率较低，生产成本较高；（2)转瓶内的培养条件无法做到及时调整，无法 确保细胞处在最佳生长状态，获得的细胞密度及猪瘟病毒滴度较低；(3)转瓶中的细胞碎 片及杂蛋白多，导致各批次疫苗产品的均一性较差，质量不稳定。
[0004] 采用生物反应器的微载体培养细胞制备猪瘟疫苗的研究越来越多。通过生物反应 器的灌流培养方式可以实现大规模高密度培养动物细胞。为达到良好的培养效果，生物反 应器的参数设置和所选培养基的成分是其中的重要因素。通常生长及维持培养基中通常需 要加入10% -20%的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支 持蛋白。但是，动物血清也有其明显的缺点：成分不明确，产品批间差异不易控制，价格昂 贵，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病 毒等。目前，针对生物反应器大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基的研究尚未 见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种适用于大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基及其 使用方法。使用本发明所述的培养基，使ST细胞的大规模高密度培养在低血清浓度条件下 进行。接种猪瘟病毒后，使用本发明所述的无血清、低蛋白的培养基用来维持病毒在培养液 中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使ST细胞可高效的贴附在微载体上，细胞 生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-7d内达到极高密度；接种猪瘟病毒 后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液12-17d。
[0006] 本发明所述的一种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其组成成 分及重量份为：
[0007] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 5-40 L-丙氨酸(L-Alanine) 5-15 L-精氨酸(L-Arginine) 80-130 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 5-15 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 10-20
[0008] L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30-70 L-谷氧酸(L-Glutamic Acid) 5-15 L-谷氨醜胺(L-Glutamine) 250-600 L-组氨酸(L-Histidine) 30-60 L-轻腩氨酸(L-Hydroxyproline) 5-10 L-异亮M 酸(L-Isoleucine) 50-120 L-亮氨酸(L-Leucine> 50-120 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70-150 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10-30 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 30-80 L-丝氨酸(L-Serine) 10-50 L-苏氣酸(L-Threonine) 40-100 L-色氨酸(L-Tryptophan) 5-20 L-缬氨酸(L-Valine) 30-100 L-脯氨酸(L-Proline) 5-15 L-酷氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40-110 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500-7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70-100 氯化钾(Potassium Chloride) 200-500 无水氯化 I丐(Calcium Chloride) 100-300 一水磷酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110-150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001-0.01 泛酸 ?丐(D-Calcium pantothenate) 1-10 氯化胆碱(Choline chloride) 1-10 叶酸(Folic Acid) 1-10 肌醇(i-Inositol) 1-10 烟酰胺(Niacinamide) 1-10 核黄素 (Riboflavin) 0.05-0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1-10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 500-4000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 50-120 酚红(PhenolRed) 5-20 盐酸卩比咳酸（Pyridoxal h drochloride) 0.01-1 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.01-1 亚油酸(Linoleic Acid) 0.01-1
[0009] 上述培养基的组成成分及重量份优选为：
[0010] 成份 mg/L 飞氨酸(Glycine) 26 L-丙氨酸(L-Alanine) 8.5 L-精氨酸(L-Arginine) 103
[0011] L-天冬酰胺(L-Asparagine) 10.5 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 13.5 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 58 L-谷氧酸(L-Glutamic Acid) 13.5 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 450 L-组氨酸(L-Histidine) 38 L-轻脯氧酸(L-Hydroxyproline) 6.8 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 88 L-亮氧酸(L-Leucine) 85 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 120 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 26 L·苯丙氨酸(Phenylalanine) 58 L-丝氨酸(L-Serine) 37 L-苏氨酸(L-Threonine) 81 L-色氨酸(L-Tryptophan) 14.5 L-缬氨酸(L-Valine) 78.5 L-脯氨酸(L-Proline) 10.5 L-酪氧酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 65 氯化钠 (Sodium Chloride) 6600 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 92 氯化钾(Potassium Chloride) 380 无水氯化钙(Calcium Chloride) 180 一水憐酸二氧钠 (Sodium Phosphate monobasic) 130 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 ^(D-Calcium pantothenate) 3.5 氯化胆碱(Choline chloride) 3.5 叶酸(Folic Acid) 3.5 肌醇(i-Inositol) 6.3 烟醜胺(Niacinamide ) 3.5 核黄素 (Riboflavin) 0.25 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 3.5 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 1200 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 105 酚红(Phenol Red) 12 盐酸fl比P多醛（Pyridoxal hydrochloride) 0.1 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.2 亚油酸(Linoleic Acid) 0.2
[0012] 上述培养基，在使用前加入2% -5%的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在 大规模高密度培养ST细胞的培养液。
[0013] 本发明的一种大规模高密度培养得到ST细胞接入猪瘟病毒后，维持病毒感染时 期的培养基，其组成成分及重量份为：
[0014] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 5-40 L-丙氨酸(L-Alanine) 5-15 L-精氨酸(L-Arginine) 80-130 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 5-15 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 10-20 L· 胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30-70 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 5-15 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 250-600 L· 组氨酸(L-Histidine) 30-60 L-经脯氣酸(L-Hydroxyproline) 5-10 L-异亮氣酸(L-Isoleucine) 50-120 L-亮氨酸(L-Leucine) 50-120 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70-150 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10-30 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 30-80 L-丝氨酸(L-Serine) 10-50 L-苏氨酸(L-Threonine) 40-100 L-色氧酸(L-Tryptophan) 5-20 L-缬氨酸(L-Valine) 30-100 L-脯氨酸(L-Proline) 5-15 L-酪氧酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40-110 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500-7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70-100 氯化钾(Potassium Chloride) 200-500 无水氯化!5(Calcium Chloride) 100-300 一水碟酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110-150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001-0.01 泛酸 ^(D-Caldum pantothenate) 1-10 氣化胆喊(Choline chloride) 1-10 叶酸(Folic Acid) 1-10 肌醇(i-Inositol) 1-10 烟酰胺(Niacinamide) 1-10 核黄素 (Riboflavin) 0.05-0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1-10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 500-4000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 50-120 酚红(PhenolRed) 5-20 盐酸 P比够酸（Pyridoxal h drochloride) 0.01-1 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.01-1 亚油酸(Linoleic Acid) 0.01-1
[0015] 上述培养基的组成成分及重量份优选为：
[0016] 成份 mg/L 甘氨酸(Glycine) 24 L-丙氛酸(L-Alanine) 7.5 L-精氨酸(L-Arginine) 96 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 9.8 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 13 L·胱氨酸二盐酸盐(IX：ysthie HC1) 52 L-谷氨酸(L-Ghitamic Acid) 12.6 L-谷氨酰胺(L^Glutamine) 480 L-组氨酸(L-Histidine) 35 L-轻脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5.5 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 81.5 L-亮氨酸(L-Leucine) 80 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 105 L-甲硫氣酸(L-Methionine) 22 L-苯丙氧酸(Phenylalanine) 53 L-丝氨酸(L-Serine) 34 L-苏氨酸(L-Threonine) 75 L-色氨酸(L-Tryptophan) 12.8 L-綱氨酸(L-Valine) 65 L-脯氨酸(L-Proline) 8.7 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 70.5 氯化钠 (Sodium Chloride) 6500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 87 氯化钾(Potassium Chloride) 365 无水氯化 ^(Calcium Chloride) 165 -水碟酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 115 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸妈(D-Calcium pantothenate) 3 氯化胆碱(Choline chloride) 3 叶酸(Folic Acid) 3 肌醇(i-Inositol) 5.8 烟酰胺(Niacinamide) 3 核黄素 (Riboflavin) 0.32 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 3 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 3000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 100 酚红(Phenol Red) 12 盐酸卩比卩多酸（Pyridoxal hydrochloride) 0.05
[0017] 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.1 亚油酸(Linoleic Acid) 0.15
[0018] 上述培养基还包含如下成分及其重量比例：
[0019] 成份_mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.05-0.5 乙醇胺(Ehanolamine) 1-5 胆固醇(Cholesterol) 1-5 氯化镁(Magnesium Chloride) 10-50 碳酸氢钠 (NaHC03) 1500-4000 半乳糖(Galactose) 150-300 胰岛素 (Insulin) 5-20 胸腺嘧啶(Thymine) 0.05-0.5 尿嘧啶(Uracil) 0.05-0.5 次黄曙呤(Hypoxanthine) 0.2-0.8 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 5-25 硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate) 5-25 转铁蛋白(Holo Transferrin) 5-15 谷光甘肽(Glutathione) 0.5-3 胸-(Thymidine) 0.2-1 缓冲液 HEPES 1000-5000 腐胺(Putrescine-2HCL) 2-10 维生素 B6(Vitamin B6) 0.05-0.5 维生素 A(Vitamin A) 0.01-0.1 维生素 D(Vitamin D) 0.01-0.1 维生素 K(VitaminK) 0.001-0.01 生物素 (Biotin) 0.01-0.5 血清素 (Serotonin) 1-10
[0020] 上述培养基包含的添加成分，其重量份的优选比例为：
[0021] 成份_mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.3 乙醇胺(Ehanolamine) 2.5 胆固醇(Cholesterol) 2.8 氯化镁(Magnesium Chloride) 25 碳酸氢钠 (NaHC03) 2700 半乳糖(Galactose) 200 胰岛素 (Insulin) 11 胸腺喃陡(Thymine) 0.2
[0022] 尿嘧啶(Uracil) 0.2 次黄嘿呤(Hypoxanthine) 0.4 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 14.5 硫酸腺嚼呤(Adenine sulfate) 12.5 转铁蛋白(Holo Transferrin) 6.5 谷光甘肽(Glutathione) 1.7 胸苷(Thymidine) 0.38 缓冲液HEPES 2800 腐胺(Putrescine-2HCL) 5.5 维生素 B6(Vitamin B6) 0.2 维生素 A(Vitamin A) 0.05 维生素 D(Vitamin D) 0.07 维生素 K(Vitamin K) 0.008 生物素 (Biotin) 0.15 血清素 (Serotonin) 5.5
[0023] 所述大规模高密度培养ST细胞所用的生物反应器可使用本领域常用的内部结 构支持使用载体的各类生物反应器，例如德国Eppendorf (艾本德）公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应 器生物反应器，杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州齐志公司生物 反应器。优选使用德国Eppendorf (艾本德）公司New Brunswick Scientific生物反应 器，德国Sartorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国 Eppendorf (艾本德）公司 New Brunswick Scientific 生物反应器。
[0024] 所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA， PGA，多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡 聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodexl球形微载体。
[0025] 所述ST细胞培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参 考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：37°C，溶氧D0为30-60%，按比 例通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1. 〇L/min，转速为80rpm。
[0026] 接种猪瘟病毒液，使用病毒液维持培养基时，培养的条件是本领域中常规的使用 条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是： 36°C，溶氧D0为40-70%，通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1. 2L/ min，转速为 80rpm。
[0027] 本发明的有益效果在于：本方法所述的培养基及其使用方法，在生物反应器中大 规模高密度的培养ST细胞时使用低浓度血清，在接种猪瘟后，使用无血清、低蛋白的培养 基维持病毒增殖，不仅可以有效地减少动物源血清可能带来的风险，而且可显著降低杂蛋 白对最终产品的干扰，提高产品的稳定性，同时可在较短时间内，通过灌流培养生产大量的 滴度高的病毒液，极大地降低了生产成本，提高了生产效率。
[0028] 本方法所述的培养基及其使用方法，适用于制备针对各种猪瘟病毒株的猪瘟疫 苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1为ST细胞培养的生长曲线对比图。
[0030] 图2为接种猪瘟病毒后病毒滴度曲线对比图。
【具体实施方式】
[0031] 材料与设备
[0032] 1 材料
[0033] 1)MEM培养基，DMEM培养基，GIBC0公司
[0034] 2)胎牛血清，GIBC0公司
[0035] 3) Cytodexl球形微载体，GE公司
[0036] 2主要设备
[0037] 1)生物反应器：德国Eppendorf (艾本德）公司New Brunswickl4L生物反应器 (工作体积10L)
[0038] 2)二氧化碳培养箱，日本三洋公司
[0039] 3)高速离心机，Beckman公司
[0040] 4)超速离心机，Beckman公司
[0041] 5)4°C和-20°C冰箱，日本三洋公司
[0042] 6)分光光度计，德国Eppendorf (艾本德）公司
[0043] 生产过程主要参数
[0044] 以下实施例在实施过程中的主要参数均设置为同样数值，仅在培养基的使用上有 所区别，具体成分见实施例1，实施例2,实施例3,实施例4,实施例5。
[0045] 1灭菌和预处理
[0046] 按照设备使用说明调试与准备生物反应器，进行必要的清洗，灭菌步骤，并进行无 菌试验，以确认生物反应器处于良好的生产状态。对选用Cytodexl微载体进行浸泡和灭菌 准备。按15g/L培养基加入微载体，每台14L生物反应器（工作体积10L)加入150g经预 处理的Cytodexl微载体。
[0047] 2ST细胞培养的条件是本领域中常规技术的使用条件，生物反应器的参数设置参 考生物反应器厂家的使用说明书设置。细胞接种密度为8X10 5cellS/mL。在全部实施例中， ST细胞大规模培养时的参数设置为：温度37°C，溶氧D0为40 %，按70 %，20 %，5 %，5 %的 比例分别通入空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1. 〇L/min，转速为80rpm。
[0048] 3以灌流方式培养ST细胞6天。用台盼蓝法检测细胞浓度和活性。将生物反应器 中的培养基更换为病毒液维持培养基，具体成分见实施例1，实施例2,实施例3,实施例4， 实施例5。按照合适的比例接种猪瘟病毒液。培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物 反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。在全部实施例中，接入猪瘟病 毒液后的参数设置为：温度36°C，溶氧D0为55 %，按47 %，45 %，7 %，1 %的比例分别通入 空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1. 2L/min，转速为80rpm。
[0049] 4以灌流方式维持病毒液15天，将15天内收集得到的全部病毒液经β -丙内酯灭 活，纯化，稀释，加入佐剂，制成猪瘟疫苗。
[0050] 实施例1
[0051] 使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
[0052] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 26 L·丙氨酸(L-Alanine) 8.5 L-精氣酸(L-Arginine) 103 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 10.5 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 13.5 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 58 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 13.5 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 450 L-组氨酸(L-Histidine) 38 L-经脯氨酸(L-Hydroxyproline) 6.8 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 88 L-亮氣酸(L-Leucine) 85 L-赖氧酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 120 L·甲硫氨酸(L-Methionine) 26 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 58 L-丝氨酸(L-Serine) 37 L-苏氣酸(L-Threonine) 81 L-色氨酸(L-Tryptophan) 14.5 L-織氨酸(L-Valine) 78.5 L-脯氨酸(L-Proline) 10.5 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 65 氯化钠 (Sodium Chloride) 6600 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 92 氯化钾(Potassium Chloride) 380 无水氯化 ^(Calcium Chloride) 180 一水憐酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 130 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 ^5(D-Calcium pantothenate) 3.5 氯化胆碱(Choline chloride) 3.5 叶酸(Folic Acid) 3.5 肌醇(i-Inositol) 6.3 烟酰胺(Niacinamide) 3.5 核黄素 (Riboflavin) 0.25 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 3.5 葡萄糖（D-Ghicose (Dextrose)) 1200 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 105 酚红(Phenol Red) 12 盐酸P比眵醛（Pyridoxal hydrochloride) 0.1 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.2
[0053] 亚油酸(Linoleic Acid) 0.2
[0054] 在上述培养基中加入2%的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。
[0055] 使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下：
[0056] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 24 L-丙氨酸(L-Alanine) 7.5 L-精氨酸(L-Arginine) 96 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 9.8 L-天冬氣酸(L-Aspartic acid) 13 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 52 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 12.6 L-谷氧酰胺(L-Glutamine) 480 L·组氨酸(L-Histidine) 35 L-轻脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5.5 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 81.5 L-亮氧酸(L-Leucine) 80 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 105 L-甲硫氣酸(L-Methionine) 22 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 53 L-丝氨酸(L-Serine) 34 L-苏氨酸(L-Threonine) 75 L-色氨酸(L-Tryptophan) 12.8 L-織氨酸(L-Valine) 65 L-脯氨酸(L-Proline) 8.7 L-酪氧酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 70.5 氯化钠 (Sodium Chloride) 6500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 87 氯化钟(Potassium Chloride) 365 无水氯化 l?(Calcium Chloride) 165 一水憐酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 115 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 l?(D-Calcium pantothenate) 3 氯化胆碱(Choline chloride) 3 叶酸(Folic Acid) 3 肌醇(i-Inositol) 5.8 烟酰胺(Niacinamide) 3 核黄素 (Riboflavin) 0.32 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 3 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 3000
[0057] 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 1〇〇 酷红(Phenol Red) 12 盐酸卩比唆醛（Pyridoxal hydrochloride) 0-05 维生素 B12 (Vitamin B12) 〇·1 亚油酸(Linoleic Acid) 〇· 15
[0058] 在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重 量份的比例如下：
[0059] 成份___mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 〇·3 乙醇胺(Ehanolamine) 2.5 胆固醇(Cholesterol) 2.8 氯化镁(Magnesium Chloride) 25 碳酸氢钠 (NaHC03) 2700 半乳糖(Galactose) 200 胰岛素 (Insulin) 11 胸腺嘧啶(Thymine) 0.2 尿嘧啶(Uracil) 〇·2 次黄卩票呤(Hypoxanthine) 0.4 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 14.5 硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate) 12.5 转铁蛋白(Holo Transferrin) 6.5 谷光甘肽(Glutathione) L7 胸苷(Thymidine) 〇 ·3 8 缓冲液HEPES 2800 腐胺(Putrescine-2HCL) 5.5 维生素 B6(Vitamin B6) 〇·2 维生素 A(Vitamin A) 〇,〇5 维生素 D(Vitamin D) 〇-〇7 维生素 K(Vitamin K) 0.008 生物素 (Biotin) 〇*15 血清素 (Serotonin)_5^5_
[0060] 实验结果见表1，表2中"实施例1"的数据。
[0061] 实施例2
[0062] 使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
[0063] 成份___mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 5 L-丙氨酸(L-Alanine) 5
[0064] L-精氧酸(L-Arginine) 800 L-天冬醜胺(L-Asparagine) 5 L-天冬氣酸(L-Aspartic acid) L·胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30 L-谷氣酸(L-Glutamic Acid) 5 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 250 L-组氨酸(L-ffistidine) 30 L-释脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5 L-异亮氧酸(L-Isoleucine) 50 L-亮氧酸(L-Leucine) 50 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 1 〇 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 30 L-丝氣酸(L-Serine) l〇 L-苏氨酸(L-Threonine) 40 L-色氨酸(L-Tryptophan) 5 L-缬氨酸(L-Valine) 30 L-脯氨酸(L-Proline) 5 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70 氯化钾(Potassium Chloride) 200 无水氯化 li(Calcium Chloride) 100 一水憐酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 f5(D-Caleium pantothenate) 1 氯化胆碱(Choline chloride) 1 叶酸(Folic Acid) 1 肌醇(i-Inositol) 1 烟酰胺(Niacinamide) 1 核黄素 (Riboflavin) 〇·〇5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 500 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 50 酿红(Phenol Red) 5 盐酸W比唆酸（Pyridoxalh drochloride) 〇-〇l 维生素 B12 (Vitamin B12) 〇 〇! 亚油酸(Linoleic Acid) 〇.〇l
[0065] 在上述培养基中加入2%的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 [0066] 使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下：
[0067] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 5 L-丙氨酸(L-Alanine) 5 L-精氨酸(L-Arginine) 800 L·天冬酰胺(L-Asparagine) 5 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 10 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 5 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 250 L-组氨酸(L-ffistidine) 30 L-经脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 50 L-亮氧酸(L-Leucine) 50 L-赖氧酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 30 L-丝氨酸(L-Serine) 10 L-苏氣酸(L-Threonine) 40 L-色氨酸(L-Tryptophan) 5 L-缬氨酸(L-Valine) 30 L-脯氦酸(L-Proline) 5 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70 氯化钾(Potassium Chloride) 200 无水氯化興(Calcium Chloride) 100 一水磷酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 f5(D-Calcium pantothenate) 1 氯化胆碱(Choline chloride) 1 叶酸(FdicAcid) 1 肌醇(i-Inositol) 1 烟酰胺(Niacinamide) 1 核黄素 (Riboflavin) 0.05 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 500 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 50 酚红(Phenol Red) 5 盐酸fl比眵醛（Pyridoxal h drochloride) 0.01 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.01 亚油酸(Linoleic Acid) 0.01
[0068] 在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重 量份的比例如下：
[0069] 成份_mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.05 乙醇胺(Ehanolamine) 1 胆固醇(Cholesterol) 1 氯化镁(Magnesium Chloride) 10 碳酸氢钠 (NaHC03) 1500 半乳糖(Galactose) 150 胰岛素 (Insulin) 5 胸腺嘧啶(Thymine) 0.05 尿嘧啶(Uracil) 0.05 次黄嘌呤(Hypoxanthine) 0.2 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL；) 5 硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate) 5 转铁蛋白(Holo Transferrin) 5 谷光甘肽(Glutathione) 0.5 胸苷(Thymidine) 0.2 缓冲液HEPES 1000 腐胺(Putrescine-2HCL) 2 维生素 B6(Vitamin B6) 0.05 维生素 A(VitaminA) 0.01 维生素 D(Vitamin D) 0.01 维生素 K(Vitamin K) 0.001 生物素 (Biotin) 0.01 血清素 (Serotonin) 1
[0070] 实验结果见表1，表2中"实施例2"的数据。
[0071] 实施例3
[0072] 使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
[0073] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 40 L-丙氣酸(L-Alanine) 15 L-精氨酸(L-Arginine) 130 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 15 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 20 L-胱氨酸二盐酸盐(L^Cystine HC1) 70 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 15 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 600
[0074] L-组氨酸(L-Histidine) 60 L-经脯氨酸(L-Hydroxyproline) 10 L·异亮氨酸(L-Isoleucine) 120 L-亮氨酸(L-Leucine) 120 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 150 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 30 L-苯丙氧酸(Phenylalanine) 80 L-丝氨酸(L-Serine) 50 L-苏氨酸(L-Threonine) 100 L-色氨酸(L-Tryptophan> 20 L-缬氨酸(L-Valine) 100 L-脯氨酸(L-Proline) 15 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodimn salt dihydrate) 110 氯化钠 (Sodium Chloride) 7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 100 氯化钾(Potassium Chloride) 500 无水氯化I丐(Calcium Chloride) 300 一水磷酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.01 泛酸 I丐(D-Calcium pantothenate) 10 氯化胆碱(Choline chloride) 10 叶酸(Folic Acid) 10 肌醇(i-Inositol) 10 烟醜胺(Niacinamide ) 10 核黄素 (Riboflavin) 0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 4000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 120 酚红(Phenol Red) 20 盐酸咐够醛（Pyridoxal h drochloride) 1 维生素 B12 (Vitamin B12) 1 亚油酸(Linoleic Acid) 1
[0075] 在上述培养基中加入2%的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。
[0076] 使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下：
[0077] 成份 mg/L 甘氧酸(Glycine) 40 L-丙氨酸(L-Alanine) 15 L-精氨酸(L-Arginine) 130 L-天冬醜胺(L-Asparagine) 15
[0078] L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 20 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 70 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 15 L-谷氨醜胺(L-Glutamine) 600 L-组氨酸(L-ffistidine) 60 L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline) 10 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 120 L-亮氨酸(L-Leucine) 120 L-赖氧酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 150 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 30 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 80 L-丝氣酸(L-Serine) 50 L-苏氨酸(L-Threonine) 100 L-色氨酸(L-Tryptophan) 20 L-缬氨酸(L-Valine) 100 L-脯氨酸(L-Proline) 15 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 110 氯化钠 (Sodium Chloride) 7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 100 氯化钾(Potassium Chloride) 500 无水氯化 ^(Calcium Chloride) 300 一水憐酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.01 泛酸 l^(I>Calciuin pantothenate) 10 氯化胆碱(Choline chloride) 10 叶酸(Folic Acid) 10 肌醇(i-lnositol) 10 烟酰胺(Niacinamide ) 10 核黄素 (Riboflavin) 0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 4000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 120 酚红(Phenol Red) 20 盐酸败p多醒（Pyridoxal h drochloride) 1 维生素 B12 (Vitamin B12) 1 亚油酸(Linoleic Acid) 1
[0079] 在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重 量份的比例如下：
[0080] 成份_mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.5 乙醇胺(Ehanolamine) 5
[0081] 胆固醇(Cholesterol) 5 氯化镁(Magnesium Chloride) 50 碳酸氢钠 (NaHC03) 4000 半乳糖(Galactose) 300 胰岛素 (Insulin) 20 胸腺嘧啶(Thymine) 0.5 尿嘧啶(Uracil) 0.5 次黄嘿呤(Hypoxanthine) 0.8 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 25 硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate) 25 转铁蛋白(Holo Transferrin) 15 谷光甘肽(Glutathione) 3 胸苷(Thymidine) 1 缓冲液HEPES 5000 腐胺(Putrescine-2HCL) 10 维生素 B6(Vitamin B6〕 0.5 维生素 A(Vitamin A) 0.1 维生素 D(Vitamin D) 0.1 维生素 K(VitaminK) 0.01 生物素 (Biotin) 0.5 血清素 (Serotonin) 10
[0082] 实验结果见表1，表2中"实施例3"的数据。
[0083] 实施例4
[0084] 使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
[0085] 成份_mg/L_ 甘氣酸(Glycine) 5 L-丙氨酸(L-Alanine) 5 L·精氨酸(L-Arginine) 800 L-天冬醜胺(L-Asparagine) 5 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 10 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 5 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 250 L-组氨酸(L-Histidine) 30 L-经脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 50 L-亮氨酸(L-Leucine) 50 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10
[0086] L-苯丙氧酸(Phenylalanine) 30 L· 丝氨酸(L-Serine) 10 L-苏氨酸(L-Threonine) 40 L-色氨酸(L-Tryptophan) 5 L-缬氨酸(L-Valine) 30 L-脯氨酸(L-Proline) 5 L-酪氧酸盐納盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70 氯化钾(Potassium Chloride) 200 无水氯化興(Calcium Chloride) 100 一水磷酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸 I^D-Calcium pantothenate) 1 氯化胆碱(Choline chloride) 1 叶酸(Folic Acid) 1 肌醇(i-Inositol) 1 烟酰胺(Niacinamide ) 1 核黄素 (Riboflavin) 0.05 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1 葡萄糖（E>*Glucose (Dextrose)) 500 两酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 50 酚红(Phenol Red) 5 盐酸啦够醛（Pyridoxal h drochloride) 0.01 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.01 亚油酸(Linoleic Acid) 0.01
[0087] 在上述培养基中加入2%的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。 [0088] 使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下：
[0089] 成份___nig/L_ 甘氨酸(Glycine) 40 L-丙氦酸(L-Alanine) 15 L-精氨酸(L-Arginine) 130 L-天冬醜胺(L-Asparagine) 15 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 20 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 70 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 15 L-谷氨酰胺(L-Glutamine) 600 L-组氣酸(L-Histidine) 60 L-轻脯氣酸(L-Hydroxyproline) 10
[0090] L-异亮氧酸(L-Isoleudne) 120 L-亮氨酸(L-Leucine) 120 L-赖氧酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 150 L-甲硫氧酸(L-Methionine) 30 L-苯丙氨酸(Phenylalanine) 80 L-丝氨酸(L-Serine) 50 L-苏氨酸(L-Threonine) 100 L-色氨酸(L-Tryptophan) 20 L-缬氨酸(L-Valine) 100 L-脯氨酸(L-Proline) 15 L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 110 氯化钠 (Sodium Chloride) 7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 100 氯化钾(Potassium Chloride) 500 无水氯化 li(Calcium Chloride) 300 一水鱗酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.01 泛酸 l?(D-Calchini pantothenate) 10 氯化胆碱(Choline chloride) 10 叶酸(Folic Acid) 10 肌醇(i-Inositol) 10 烟酰胺(Niacinamide) 10 核黄素 (Riboflavin) 0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 4000 丙酮酸钠 (Sodium Pyruvate) 120 酚红(PhenolRed) 20 盐酸B比移醒（Pyridoxal h drochloride) 1 维生素 B12 (Vitamin B12) 1 亚油酸(Linoleic Acid) 1
[0091] 在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，维持病毒增殖的培养液，其重量份 的比例如下：
[0092] 成份 mg/L 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.05 乙醇胺(Ehanolamine) 1 胆固醇(Cholesterol) 1 氯化镁(Magnesium Chloride) 10 碳酸氢钠 (NaHC03) 1500 半乳糖(Galactose) 150 胰岛素 (Insulin) 5 胸腺嘧啶(Thymine) 0.05
[0093] 尿嘧啶(Uracil) 0.05 次黄嘌呤(Hypoxanthine) 0.2 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 5 硫酸腺嘿呤(Adenine sulfate) 5 转铁蛋白(Holo Transferrin) 5 谷光甘肽(Glutathione) 0.5 胸苷(Thymidine) 0.2 缓冲液HEPES 1000 腐胺(Putrescine-2HCL) 2 维生素 B6(Vitamin B6) 0.05 维生素 A(Vitamin A) 0.01 维生素 D(Vitamin D) 0.01 维生素 K(VitaminK) 0.001 生物素 (Biotin) 0.01 血清素 (Serotonin) 1
[0094] 实验结果见表1，表2中"实施例4"的数据。
[0095] 实施例5
[0096] 使用的ST细胞大规模高密度培养的培养基，其组成成分和重量份的比例如下：
[0097] 成份_mg/L_ 甘氧酸(Glycine) 40 L-丙氧酸(L-Alanine) 15 L-精氨酸(L-Arginine) 130 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 15 L-天冬氦酸(L-Aspartic acid) 20 L-胱氨酸二盐酸盐(L_Cystine HC1) 70 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 15 L-谷^ 氨酰胺(L-Glutamine) 600 L-组氨酸(L-Histidine) 60 L-轻脯氨酸(L-Hydroxyproline) 10 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 120 L-亮氨酸(L-Leucine) 120 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 150 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 30 L·苯丙氨酸(Phenylalanine) 80 L-丝氨酸(L-Serine) 50 L-苏氣酸(L-Threonine) 100 L-色氣酸(L-Tryptophan) 20 L-缴氨酸(L-Valine) 100 L-脯氨酸(L-Proline) 15
[0098] L-酪氨酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 110 氯化钠 (Sodium Chloride) 7000 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 100 氯化钾(Potassium Chloride) 500 无水氯化妈(Calcium Chloride) 300 一水磷酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 150 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.01 泛酸 f5(D-Calcium pantothenate) 10 氯化胆喊(Choline chloride) 10 叶酸(Folic Acid) 10 肌醇(i-Inositol) 10 烟醜胺(Niacinamide ) 10 核黄素 (Riboflavin) 0.5 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 10 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 4000 丙酮酸納(Sodium Pyruvate) 120 酚红(Phenol Red) 20 盐酸U比够醛（Pyridoxalh drochloride) 1 维生素 B12 (Vitamin B12) 1 亚油酸(Linoleic Acid) 1
[0099] 在上述培养基中加入2%的胎牛血清，制成ST细胞大规模高密度培养的培养液。
[0100] 使用的维持病毒增殖的培养基的组成成分和重量份的比例如下：
[0101] 成份_mg/L_ 甘氨酸(Glycine) 5 L-丙氨酸(L-Alanine) 5 L-精氣酸(L-Arginine) 800 L-天冬酰胺(L-Asparagine) 5 L-天冬氨酸(L-Aspartic acid) 10 L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine HC1) 30 L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 5 L· 谷氨酰胺(L-Glutamine) 250 L·组氨酸(L-Histidine) 30 L-择脯氨酸(L-Hydroxyproline) 5 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) 50 L-亮氨酸(L-Leucine) 50 L-赖氨酸盐酸盐(L-Lysine hydrochloride) 70 L-甲硫氨酸(L-Methionine) 10 L-苯丙氧酸(Phenylalanine) 30 L-丝氨酸(L-Serine) 10
[0102] L-苏氧酸(L-Threonine) 40 L·-色氧酸(L-Tryptophan) 5 L-缬氧酸(L-Valine) 30 L-脯氨酸(L-Proline) 5 L-酪氦酸盐钠盐二水(L-Tyrosine disodium salt dihydrate) 40 氯化钠 (Sodium Chloride) 5500 无水硫酸镁(Magnesium Sulfate (anhydrous)) 70 氯化钾(Potassium Chloride) 200 无水氯化 I丐(Calcium Chloride) 100 -水鱗酸二氢钠 (Sodium Phosphate monobasic) 110 五水硫酸铜(Cupric sulfate) 0.001 泛酸妈(D-Calcium pantothenate) 1 氯化胆碱(Choline chloride) 1 叶酸(Folic Acid) 1 肌醇(i-Inositol) 1 烟酰胺(Niacinamide) 1 核黄素 (Riboflavin) 0.05 盐酸硫胺(Thiamine hydrochloride) 1 葡萄糖（D-Glucose (Dextrose)) 500 丙酮酸纳(Sodium Pyruvate) 50 酷红(Phenol Red) 5 盐酸P比眵醛（Pyridoxal h drochloride) 0.01 维生素 B12 (Vitamin B12) 0.01 亚油酸(Linoleic Acid) 0.01
[0103] 在上述培养基的基础上，还添加如下组成成分，制成维持病毒增殖的培养液，其重 量份的比例如下：
[0104] 成份_mg/L_ 七水硫酸亚铁(Ferric sulfate) 0.5 乙醇胺(Ehanolamine) 5 胆固醇(Cholesterol) 5 氯化镁(Magnesium Chloride) 50 碳酸氢钠 (NaHC03) 4000 半乳糖(Galactose) 300 胰岛素 (Insulin) 20 胸腺瞎腚(Thymi ne) 0.5 尿嘧啶(Uracil) 0.5 次黄卩票呤(Hypoxanthine) 0.8 盐酸鸟嘌呤(Guanine.HCL) 25 硫酸腺嘌呤(Adenine sulfate) 25 转铁蛋白(Holo Transferrin) 15 谷光甘肽(Glutathione) 3
[0105] 胸苷(Thymidine) 1 缓冲液HEPES 5000 腐胺(Putrescine-2HCL) 10 维生素 B6(Vitamin B6) 0.5 维生素 A(Vitamin A) 0.1 维生素 D(Vitamin D) 0.1 维生素 K(Vitamin K) 0.01 生物素 (Biotin) 0.5 血清素 (Serotonin) 10
[0106] 实验结果见表1，表2中"实施例5"的数据。
[0107] 在同样条件下，使用本发明所述生长培养基与普通市售MEM、DMEM培养基+10 %胎 牛血清的细胞生长曲线对比如表1 :
[0108] 表1ST细胞生长曲线对比表
[0109] 单位：105cells/mL
[0110] 0d id 2d 3d 4d 5d 6d~ 实施例 1 8 22 46 108 154 189 217 实施例 2 8 17 37 93 137 176 203 实施例 3 8 20 45 103 160 193 220 实施例 4 8 19 40 96 139 169 201 实施例 5 8 21 47 110 149 185 219 MEM+10%FBS 8 16 36 80 106 126 145 DMEM+10%FBS 8 17 35 82 113 127 153
[0111] 在同样条件下，接种猪瘟种毒液后，使用本发明所述维持病毒增殖的培养基与普 通市售MEM、DMEM+2% FBS有血清培养基的病毒滴度对比如表2 :
[0112] 表2猪瘟液滴度对比表
[0113] 单位：TCLD5(l/ml
[0114] 3d"""4d~5d~~6d~7d~~8d9d~10d~Ud12d~~13d~14d~15d" 实施例 1 4.3 4.7 5.4 6.2 6.6 6.9 7.2 7.1 6.9 6.8 6.7 6.6 6.6 实施例 2 3.9 4.3 4.8 5.6 6.1 6.6 6.8 6.7 6.8 6.5 6.4 6.4 6.5 实施例 3 4.4 4.8 5.5 6.3 6.8 7.1 7.1 6.8 6.6 6.7 6.5 6.5 6.4 实施例 4 4.1 4.6 4.9 5.4 6.1 6.5 6.7 6.9 6.9 6.6 6.5 6.6 6.4 实施例 5 4.5 4.9 5.5 6.1 6.6 6.9 7.3 7.2 6.9 6.9 6.7 6.8 6.5 MEM +2%FBS 3·8 4' 2 4.5 5.2 5.8 6.1 6.3 6.1 5.9 5.9 5.8 5.7 5.8 DMEM +2%FBS 3-9 4.3 4.6 5.1 5.7 5.9 6.2 6.1 6.1 5,9 5.7 5.8 5.6
【权利要求】
1. 一种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其特征在于，培养基的组成 成分及重量份为：
2.如权利要求1所述的大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养基，其特征在 于，上述培养基的组成成分及重量份优选为：
3. 如权利要求1或2所述的培养基，使用前加入2 % -5 %的胎牛血清或小牛血清，经过 膜过滤制成大规模高密度培养ST细胞的培养液。
4. 一种大规模高密度培养得到ST细胞并接入猪瘟病毒后，维持病毒感染时期的培养 基，其特征在于，培养基的组成成分及重量份为：
5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，上述培养基的组成成分及重量份优选为：
6. 如权利要求4或5所述的培养基，其特征在于，上述培养基还包含如下成分及其重量 比例：
7. 如权利要求6所述的培养基，其特征在于，上述培养基包含的添加成分，其重量份的 优选比例为：
8. -种大规模高密度培养ST细胞制备猪瘟疫苗的培养方法，其特征在于，使用权利要 求1-3所述的培养基，在生物反应器中以灌流培养的方式大规模高密度培养ST细胞；使用 权利要求4-7所述的培养基，接种猪瘟病毒种毒液，以灌流培养的方式维持猪瘟病毒的增 殖，直到收获病毒液。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，使用本方法所述的培养基和低浓度的血清， 在生物反应器中大规模高密度的培养ST细胞；在接种猪瘟病毒后，使用本方法所述的无血 清、低蛋白的培养基维持病毒增殖。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征还在于，适用于制备针对各种猪瘟病毒株的猪瘟 疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK104232564SQ201410200642
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】贾馨丹 申请人:杭州国牧生物科技有限公司