一种抗肿瘤泛素化蛋白及其提取方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种泛素化蛋白及其提取方法和应用，属于肿瘤疫苗技术领域。
【背景技术】
[0002] 肿瘤严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或化疗、放疗是目前肿瘤病人首选的 治疗方法。临床资料显示，大部分肿瘤病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肿瘤的临床治 疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肿瘤治疗策略，具有特异性强、毒 副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞（DC)为载体的肿瘤疫苗目前 已成为肿瘤生物治疗的研宄热点。
[0003] 在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要 原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量 和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于 DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研宄和临床试验。DC疫苗 功能的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原， 抗原信息得以充分表达。然而，研宄试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过 程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数，以及如何更好的募集肿瘤抗原等成为 目前关注的热点。
[0004] pAPC(professional antigen pressing cell,专职抗原提成细胞）交叉递呈的抗 原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有 效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细 胞的短寿蛋白（平均半衰期约为10分钟）；另一方面，PAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源 于肿瘤细胞的长寿蛋白（经自噬途径降解），两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上 述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息， 诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以"长寿蛋白"为基础的肿瘤疫苗所 面临的难题。
[0005] 目前认为抗原供者细胞主要有两条蛋白降解途径：泛素-蛋白酶体途径和细胞自 噬途径。其中，泛素-蛋白酶体途径主要由蛋白酶体降解处理泛素化短寿蛋白，短寿蛋白主 要包括一些错误编码、错误翻译等产生的核糖体废产品，半衰期仅为10分钟。近年来发现， 肿瘤细胞MHC I (major histocompatibility complex I，主要组织相容性复合体I)类分 子直接递呈的抗原肽有80%以上来源于短寿蛋白。泛素分子作为胞内信号分子能以一种极 其严密的方式标记蛋白分子。泛素分子与靶蛋白或者另一个泛素分子偶联的过程是由一系 列分子调控完成的，这些分子有泛素活化酶（El)，泛素交联酶（E2)和泛素连接酶（E3);最 终使泛素分子偶联到多肽链Lys残基的ε -氨基或者末端氨基酸的最末端基团，随后，另一 个泛素分子会通过与前一个泛素分子的Lys48连接而形成泛素链。这种连接类型的泛素链 在很大程度上是作为蛋白酶体识别的标志。被泛素化的底物进入蛋白酶体后很快就被蛋白 酶体所降解。
[0006] 因此，现有技术中存在以下问题需要解决，如交叉免疫效果差，泛素化短寿蛋白降 解快，难以提取；泛素化短寿蛋白与长寿蛋白具有不对称性，导致以"长寿蛋白"为基础的肿 瘤疫苗抗肿瘤效果不佳。
【发明内容】
[0007] 发明目的：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗肿瘤泛素化蛋白及其提 取方法和应用。
[0008] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种抗肿瘤泛素化蛋白，其主要 是由以下步骤提取所得：
[0009] (1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养；
[0010] ⑵肿瘤细胞的处理：
[0011] 按步骤（1)方法培养细胞待细胞生长至80%，加入雷帕霉素、万珂（硼替佐米，商 品名为万珂）和氯化铵，加入量分别为（80-120)nmol/L、（160-240)nmol/L和（25-35)mmol/ L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；
[0012] (3)提取泛素化蛋白：
[0013] 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液（Western及IP细胞裂解液，江苏碧云天）处 理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3 (A7)蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化 蛋白。
[0014] 作为优选，所述肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。
[0015] 进一步优选，所述多发性骨髓瘤细胞为小鼠 EL4细胞，所述黑色素瘤细胞为小鼠 B16-F10 细胞。
[0016] 作为优选，所述步骤（1)中的常规培养方法如下：
[0017] 复苏冻存的肿瘤细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (v/v)胎牛血清、100U/ml 青霉素和 l〇〇U/ml 链霉素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培养基，重悬细 胞至I X IO6个/ml，并将其移入细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V) CO2的恒温培养箱中培养， 每1~2天换液一次，常规0. 25%胰蛋白酶消化传代；
[0018] 作为优选，所述Vx3(A7)蛋白的提取方法包括如下步骤：
[0019] (1)将 PUbiG101-Vx3(A7)-eGFP 质粒转入大肠杆菌 E. coli(DH5-a );
[0020] (2)将步骤（1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB(Luria-Bertani)培养基培养并做 双酶切鉴定；
[0021] (3)将步骤（2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0. 5时加 IP TG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导 16h， 高速离心8000rpm，15min，弃去上清；
[0022] (4)将步骤（3)高速离心后得到的沉淀用Bing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，25mM imidazole, pH8.0)重悬，加入溶菌酶冰上反应30min;超声破碎后，高速离心 12000rpm，10min，4°C ;
[0023] (5)收集步骤（4)得到的上清，将其加入到镍离子亲和层析中，待与柱材料结合 后，用 Washing buffer(50mM NaH2PCM, 300mM NaCl, 150mM imidazole，pH8.0)洗去杂蛋 白，用 Elution buffer (50mM NaH2PCM, 300mM NaCl，300mM imidazole, ρΗ8·0)收集所要的 Vx3(A7)蛋白，冻存于-20°C，备用。
[0024] 本发明还提供了所述抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其包括以下步骤：
[0025] (1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养；
[0026] (2)肿瘤细胞的处理：
[0027] 按步骤（1)方法培养细胞待细胞生长至80%，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，加入 量分别为（80-120) nmol/L、（160-240) nmol/L和（25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞 14-18 小时， 抑制泛素化蛋白的降解；
[0028] (3)提取泛素化蛋白：
[0029] 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3 (A7) 蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。
[0030] 作为优选，所述肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。
[0031] 进一步优选，所述多发性骨髓瘤细胞为小鼠 EL4细胞，所述黑色素瘤细胞为小鼠 B16-F10 细胞。
[0032] 作为另一种优选，所述步骤（1)中的常规培养方法如下：
[0033] 复苏冻存的肿瘤细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (v/v)胎牛血清、100U/ml 青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至I X 106个/ml，并将其移入细胞培养 瓶中，在37°C、5% (V/V)CO2的恒温培养箱中培养，每1~2天换液一次，常规0. 25%胰蛋 白酶消化传代。
[0034] 作为另一种优选，所述Vx3(A7)蛋白的提取方法包括如下步骤：
[0035] (1)将 PUbiG101-Vx3(A7)-eGFP 质粒转入大肠杆菌 E. coli (DH5-a );
[0036] (2)将步骤（1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB培养基培养并做双酶切鉴定；
[0037] (3)将步骤（2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0. 5时加 IPTG诱导16h，高速离心8000rpm，15min，弃去上清；
[0038] (4)将步骤（3)高速离心后得到的沉淀用Bing buffer重悬，加入溶菌酶冰上反应 30min ;超声破碎后，高速离心12000rpm，10min，4°C ;
[0039] (5)收集步骤（4)得到的上清，将其