用于hla-a2阳性人群的来自gpc3的癌症排斥抗原肽以及含有该肽的药物的制作方法
【专利说明】用于HLA-A2阳性人群的来自GPC3的癌症排斥抗原肽以及 含有该肽的药物
[0001] 本申请是申请日为2006年8月8日、国际申请号为PCT/JP2006/315631、进入国家 阶段的申请号为200680037419. 8、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及可有效用作肝细胞癌、恶性黑色素瘤（黑素瘤）等高表达磷脂酰肌醇 蛋白聚糖_3(GPC3)的癌症的疫苗的新型肽，以及含有该肽的肿瘤治疗和预防的药物。
【背景技术】
[0003] 原发性肝细胞癌是在世界各国发生频率很高的恶性疾病之一。随着乙型和丙型肝 炎的世界性流行，亚洲或欧洲各国的肝细胞癌发生率急剧升高，考虑到由肝炎病毒感染至 发病的较长的潜伏期，可以预想今后的五十年内该倾向会持续升高。病状发展的肝细胞癌 预后不良，迫切需要开发新的治疗方案。
[0004] 另一方面，随着近年来分子生物学和肿瘤免疫学的发展，已经了解到：细胞毒性 (杀伤）T细胞和辅助性T细胞可识别经HLA分子呈递于癌细胞或抗原呈递细胞的表面、并 在癌细胞中特异性高表达的蛋白质分解得到的肽，显示破坏癌细胞的免疫反应。并且，对很 多刺激攻击上述癌症的免疫反应的肿瘤抗原蛋白、以及来自该肿瘤抗原蛋白的肽都进行了 鉴定，抗原特异性的肿瘤免疫疗法的临床应用得到了进展。
[0005] HLA-I类分子在身体的所有有核细胞的表面表达，与肽结合，在细胞表面表达，其 中，所述肽是在细胞质或核中产生的蛋白质在细胞内分解得到的。在正常的细胞表面，来自 正常的自身蛋白的肽与HLA-I类分子结合，免疫系统的T细胞并不对该分子进行识别及破 坏。另一方面，在癌细胞形成癌的过程中大量表达在正常细胞中几乎不表达或者很少表达 的蛋白质。上述在癌细胞中特异性高表达的蛋白质在体内分解成的肽与HLA-I类分子结 合，在癌细胞的表面表达，则杀伤T细胞识别该分子，只破坏癌细胞。将上述癌症特异性抗 原或肽给予个体，不会对正常细胞产生危害，即可破坏癌细胞并抑制癌的增殖。将其称为 使用癌症特异性抗原的癌症免疫疗法。另外，HLA-II类分子主要在抗原呈递细胞的表面表 达，其与肽结合，在细胞表面表达，其中所述肽是抗原呈递细胞从细胞外摄入、在细胞内分 解的来自癌症特异性抗原的肽。识别该分子的辅助性T细胞被激活，生成各种可激活其它 免疫系统细胞的细胞因子，由此诱导或增强对肿瘤的免疫反应。
[0006] 因此，如果能够开发以在这些癌症中特异性高表达的抗原为靶的免疫疗法，则可 能获得不对自身正常器官产生伤害、只有效排除癌症的治疗方法。还有望进行其它的治疗， 成为对任何晚期癌症患者都可使用的治疗方法。另外，对于发生上述癌症的风险高的人群 预先以疫苗的形式给予癌症特异性抗原和肽，可以预防癌症的发生。
[0007] 有报道称，甲胎蛋白（AFP)是正常组织中只在胚胎期表达，但在很多肝细胞癌中 其表达重新被激活，即，是所谓的癌胚胎性蛋白质。另外，在小鼠和人的T细胞中存在识别 通过MHC-I类分子呈递的、来自AFP的肽表位物质。虽然胚胎在发育阶段暴露于在血浆中 高水平存在的AFP中，但成熟T细胞不会获得对AFP的完全免疫耐受，AFP特异性T细胞可 在末梢血中检测出。即，癌胚胎性蛋白可成为免疫治疗的靶。
[0008] 虽然肝细胞癌的治疗方法有多种，但与其它癌症相比，其预后差，是难治性癌症的 一种。其原因在于：在肝细胞癌的基础上有肝硬化，患者的肝功能恶化；以及即使治疗了一 处癌症，也会由其它的器官生成癌的特征，人们要求尽快开发新型的治疗方案。如果可以开 发以在肝细胞癌中特异性高表达的抗原为靶的免疫疗法，则可以得到不伤及自身的正常器 官、只有效地排除癌症的治疗方法。有望获得对于任何晚期癌症患者、进一步说对于肝功能 过于恶化、无法进行其它治疗的患者均可使用的治疗方法。目前在日本，据称肝细胞癌的后 备人群一一丙型肝炎感染者有200万人以上。对于这些感染者的肝细胞癌的预防，可以采 用上述免疫疗法。
[0009] 黑素瘤是被称为恶性黑色素瘤的皮肤癌的一种。皮肤癌有多种，它是恶性度最高 的皮肤癌，非常可怕。构成皮肤的细胞中有生成黑素的细胞，将其称为色素细胞（黑素细 胞），该细胞癌化成黑素瘤。
[0010] 日本黑素瘤发生人数是每10万人口中约有1. 5-2人左右，由此推测每年有1500 人-2000人左右发病。在欧美每10万人口中有10多人或以上发病，在澳大利亚每10万 人口中有20多人或以上的发病，可以说是世界第一的发病人数。仅此，欧美或澳大利亚的 人们对黑素瘤有很大的关心程度，非常注意黑素瘤的发生。另外，由于环境破坏导致大气中 臭氧层减少，暴露在紫外线中的机会增加，因此，特别是在白种人中发生频率增加。在日本， 黑素瘤的发生每年有增加倾向。最近的调查中，日本的黑色素瘤年死亡人数增加至450人 左右。黑素瘤在任何年龄的人群中均发生，特别是40岁或以上发生增多，在60岁-70岁左 右最多。儿童的发生非常少，但是并不是不发生，最近在20-30岁左右年轻人中的发生有增 加倾向。在性别方面，并没有某一方多的倾向，在男女人群均有发生。在日本，容易发生黑 素瘤的部位最多的是在足底（脚底面），约占三成左右。在足或手指尖的部分较多，这是日 本人的特征。除此之外，与欧美人同样，在身体、手、足、面部、头等任何皮肤上都有发生。
[0011] 本发明人首先利用CDNA微阵列分析，对包括23, 040种人类基因的全基因组的基 因表达分析，对20例原发性肝细胞癌和包括胚胎期的各种正常器官中这些基因的表达概 况进行了研宄，发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在胚胎期的肝脏、肾脏、肺中表达，在成 人的正常器官中除胎盘以外几乎不表达，而在很多肝细胞癌中高表达。并且报道，该GPC3 为分泌蛋白，使用ELISA法，可以在40 %的肝细胞癌症患者的血清中检测出GPC3,这可用 作肝细胞癌的新的肿瘤标志（Nakatsura，T.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 306， 16-25(2003))。还报道了，GPC3也在黑素瘤患者的血清中检测出，可用作黑素瘤的肿瘤标 志（Nakatsura，T.等人，Clin. Cancer Res. 10 :6612-6621 (2004)) 〇
[0012] 本发明人已经鉴定出在以HLA-A24阳性肝细胞癌或黑素瘤患者为对象的免疫疗 法中有用的、与HLA-A24结合并呈递在人杀伤T细胞上的GPC3肽。并在使用表达小鼠 Kd分子的BALB/c小鼠的动物实验中证明使用该肽有效，并已报道（国际申请编号PCT/ JP2004/016374 ;国际申请日2004年10月28日），其中所述#分子与一种肽结合，该肽与 同HLA-A24结合的肽具有同样的结构。GPC3在正常器官中只在胎盘和胚胎期的肝脏中表 达，因此，通过小鼠实验可确认：进行以GPC3为靶的免疫疗法，可抑制肿瘤的增殖但不会发 生自身免疫疾病等有害状况。
[0013] 本发明人还对于目前为止作为肿瘤排斥抗原的磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3(GPC3)，对 于主要通过HLA-A24向杀伤T细胞呈递的肽进行了鉴定（国际申请编号PCT/JP03/10459 ; 国际申请日2003年8月19日）。但是，如果只是通过HLA-A24呈递在杀伤T细胞上的肽， 日本人群中只有60%具有HLA-A24,因此无法作为肽疫苗给予对象。并且，如果可以鉴定出 日本人群的40%所具有的阳性HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，将两者合并则可以以日本人 群的约85%作为对象，不仅如此，HLA-A2在欧美白种人中阳性的频率高，因此也可应用于 很多欧美白种人。因此，通过HLA-A2向杀伤T细胞呈递的肽的鉴定成为重要课题。特别是 黑素瘤在欧美白种人中较多，是可有效应用免疫疗法进行治疗的癌症，并且肝细胞癌在欧 美也急速增加，因此可以推定：使用HLA-A2结合性GPC3肽的免疫疗法可以适应很多患者。
【发明内容】
[0014] 本发明要解决的课题在于：鉴定通过HLA-A2呈递于杀伤T细胞的肽，由此提供可 以进行以日本人中高表达GPC3的各种癌症患者的约40%为对象的免疫疗法的方法。
[0015] 本发明人首先根据CDNA微阵列分析鉴定了人肝细胞癌中特异性过量表达的新型 癌胚胎性蛋白一一磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3(GPC3)，又在肝细胞癌患者血清中检测出可溶性 GPC3蛋白，明确了 GPC3可成为肝细胞癌的新的肿瘤标志。本发明人发现GPC3在小鼠黑素 瘤细胞株B16中表达，GPC3在黑素瘤中与肝细胞癌中同样高表达，从而考虑其是否可以作 为有用