牦牛乳乳清蛋白源ace抑制肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及功能乳品领域，特别涉及两条牦牛乳乳清蛋白源ACE抑制肽及其制备 方法。 技术背景
[0002] 随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐 加大，再加上运动量的减少，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位。
[0003] 高血压是指在未使用降压药物的情况下，收缩压 2 HOmmHg和(或)舒张压2 90mmHg。目前，常用于抗高血压药物治疗的有6种主要的降压药 物，它们分别是利尿剂、α-受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素 Π 受体拮抗剂、α-肾 上腺素受体阻滞剂和血管紧张素转化酶抑制剂。这些降血压药物能显著的降压，但却存在 一定的毒副作用，如咳嗽、过敏性血管水肿及肾功能不全加重等。
[0004] 血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显 著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并 且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸（His-Leu)的 切除，能够把原本无活性的血管紧张素 I转变为具有活性的血管紧张素 II，引起血管收缩， 使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形， ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
[0005] ACE抑制肽一般以无活性的形式存在于蛋白质序列中，但当蛋白质通过热、酸碱的 降解、酶制剂的水解或微生物的发酵等，无活性的蛋白质中可以释放出具有降压作用的ACE 抑制肽。ACE抑制肽的制备方法主要有5种：化学降解法、酶解法、微生物发酵法、化学合成 法和基因工程法，现在研宄最多的是酶解法和微生物发酵法。相对于微生物发酵法，酶法反 应迅速，制备ACE抑制肽的活性高，且原料广泛，主要有乳类蛋白、植物类蛋白及动物类蛋 白，目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳为原料。
【发明内容】
[0006] 本发明基于现有的技术，酶解牦牛乳乳清蛋白制备ACE抑制肽，为降血压提供无 副作用药物做出了很大的贡献。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为： 一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽，所述ACE抑制肽包括两条肽， 分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
[0008] 一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方法，所述制备方 法包括以下步骤： 步骤1 :牦牛乳经过脱脂、酸凝沉淀得到上清，将上清液用IM NaOH调节pH值5. 2,加热 温度达80-90°C，使之沉淀即为乳清蛋白，冻干得到乳清蛋白冻干粉。
[0009] 步骤2 :将牦牛乳乳清蛋白冻干粉制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反 应2~4 h，酶与乳清蛋白的比为1500~2000 U/g，调整乳清蛋白的温度40°C~50 °C和pH值 6. 5~7. 5,水解2~4h，得到酶解液； 步骤3:将步骤2所得酶解液在90 °C水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在 9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物； 步骤4 :对步骤3所述酶解产物进行一级超滤，收集滤液，得到一级滤液； 步骤5 :对步骤4所得的一级滤液进行二级超滤，初步得到具有ACE抑制活性的滤液； 步骤6 :将步骤5所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品 经层析柱分离（Sephadex G-25,凝胶柱2. 6 X 80cm，超纯水0.6 mL/min洗脱，波长检测215 rim)，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为 E1-E6组分； 步骤7 :将步骤6所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成多肽溶液，测定ACE抑制活性 值； 步骤8 :经层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组分含 量占凝胶过滤后收集多肽总量的33. 5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步分离， 半制备反相液相色谱柱分离E5,将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重复操 作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥，测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相同浓度 的溶液测定ACE抑制率，保留时间段分别为24-26. 5min和31. 9-32. 3min的E5b和E5e组 分的ACE抑制率均大于70 % ; 步骤9 :将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联质 谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到多肽序列。
[0010] 进一步的，所述牦牛如乳清蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤： 步骤1 :将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳； 步骤2 :将所得脱脂乳在35-50°C范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌 器进行搅拌，边搅拌边滴加 IM HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4. 6,使酪蛋白进行沉淀， 6000 rpm离心20 min后，得到上清液； 步骤3 :将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加 IM NaOH调节pH值5. 2， 再加热至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷 冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。
[0011] 进一步的，步骤3中所述的一级超滤处理的条件为： 采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7. 0,操作压力0· 15 MPa，温度45°C，超滤时间2 h。
[0012] 进一步的，步骤4中所述的二级超滤处理的条件为：压力0. 15 MPa，温度45°C，pH 值 7.0。
[0013] 采用MWCO为6 kDa的超滤膜对一级滤液，进行超滤l~3h。
[0014] 进一步的，步骤5中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。
[0015] 进一步的，所述凝胶层析的条件为：Sephadex G-25,凝胶柱2. 6X80cm，超纯水0· 6 mL/min洗脱，波长检测215 nm。
[0016] 本发明相比现有技术的有益效果为： 本发明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制备出两条有效地ACE抑制肽，以新鲜牦牛乳为原 料，选材纯天然，营养价值高，牦牛乳乳清蛋白还具有多种生理功能，且含有人体生长发育 所必需的氨基酸，酶解后可制备大量的ACE抑制肽，该产品具有用量小、无毒副作用、性质 温和、生理功能强的特点。
【附图说明】
[0017] 图1为凝胶层析分离多肽示意图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽，所述ACE抑制肽包括两条肽， 分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
[0020] 一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方法，所述制备方 法包括以下步骤： 步骤1 :将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳； 步骤2 :将所得脱脂乳在35-50°C范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌 器进行搅拌，边搅拌边滴加 IM HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4. 6,使酪蛋白进行沉淀， 6000 rpm离心20 min后，得到上清液； 步骤3 :将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加 IM NaOH调节pH值5. 2， 再加热至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷 冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉； 步骤4 :将上述步骤所得乳清蛋白冻干粉制成质量浓度为5 %的乳清蛋白溶液100 ml， 用中性蛋白酶进行水解反应3 h，酶与乳清蛋白的比为1800 U/g，用恒温水浴箱及I M NaOH 溶液分别调整乳清蛋白的温度45 °C和pH值7. 0,水解3h ; 步骤5