:将步骤4所得酶解液在90 °C水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在 9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物； 步骤6:对步骤5所述酶解产物进行一级超滤。采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一 级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7. 0,操作压力0. 15 MPa，温度45°C，超滤时 间2h ; 步骤7 :采用MWCO为6 kDa的超滤膜对步骤5所述滤过液进行二级超滤处理2 h，初步 得到具有ACE抑制活性的滤液； 步骤8 :将步骤7所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品 经SephadexG-25凝胶层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间 范围收集洗脱液，分别命名为E1-E6组分； 步骤9 :将步骤8所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成0. 5 mg/mL的多肽溶液，利用 紫外风光光度法测定ACE抑制活性值，El组分是最先被洗脱下来的成分，平均分子量最大， ACE抑制率为50. 90 ± 1. 12%，E2和E4组分，具有相近的ACE抑制率，虽然E3组分的含量 较高，但其ACE抑制率仅为35. 18 ±3. 35%。E5组分ACE抑制率最高，为77. 47 ±1. 12 %，该 组分洗脱时间长，其平均分子量小于前4个组分。E6组分为分子量更低的肽组分，也具有一 定的ACE抑制活性，但该组分含量低； 步骤10 :经凝胶层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组 分含量占凝胶过滤后收集多肽总量的33. 5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步 分离。半制备反相液相色谱柱分离E5,将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重 复操作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥。测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相 同浓度的溶液测定ACE抑制率。保留时间段分别为24-26. 5min和31. 9-32. 3min的E5b和 E5e组分的ACE抑制率均大于70 % ; 步骤11 :将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联 质谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到多肽序列； 步骤12 :采用化学固相合成法合成多肽，并测定了合成多肽的ACE酶的体外抑制活 性。在合成的这两条多肽八肽MENSAEPE和五肽LDTDY具有较高的ACE抑制率，IC50值分 别为 27·7μΜ、112·5μΜ; 步骤13 :以原发性高血压大鼠（SHR)为动物模型，尾脉搏法间接测定大鼠血压收缩，评 价牦牛乳乳清蛋白多肽的降血压功能。SHR大鼠连续14日口服1.2 g/kg BW和2.4 g/kg BW剂量的降血压多肽，给药后第4日起，两组SHR大鼠的尾动脉收缩压均显著低于对照组 (p〈0. 05)，心率值无差异。停药后1日，多肽组SHR大鼠的血压值仍保持较低的血压，停药 后7日，多肽组大鼠血压值与对照组无差异。提示这两条降血压多肽对SHR大鼠有辅助降 血压作用。
【主权项】
1. 一种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽，其特征在于，所述ACE抑制 肽包括两条肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。
2. -种牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽的制备方法，其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤： 步骤1 :将牦牛乳乳清蛋白冻干粉制成乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶进行水解反应 2~4 h，酶与乳清蛋白的比为1500~2000 U/g，调整乳清蛋白的温度40°C~50 °C和pH值 6. 5~7. 5,水解2~4h，得到酶解液； 步骤2:将步骤1所得酶解液在90 °C水浴中保持15 min使酶失活，使用高速离心机在 9000 rpm的条件下离心20 min，除去未水解的乳清蛋白，得到酶解产物； 步骤3 :对步骤2所述酶解产物进行一级超滤，收集滤液，得到一级滤液； 步骤4 :对步骤3所得的一级滤液进行二级超滤，初步得到具有ACE抑制活性的滤液； 步骤5 :将步骤4所述超滤膜滤过液的多肽组分进一步分离分析其活性功能组分，样品 经层析柱分离，多肽中的组分按分子量大小依次分离，按分离峰的时间范围收集洗脱液，分 别命名为E1-E6组分； 步骤6 :将步骤5所述E1-E6组分冷冻干燥保存，配置成多肽溶液，测定ACE抑制活性 值； 步骤7 :经层析分离后获得的E2、E4和E5组分ACE抑制活性高于其他组分，E5组分含 量占凝胶过滤后收集多肽总量的33. 5 %，高于E2和E4组分，我们选择E5组分进一步分离， 半制备反相液相色谱柱分离E5,将不同洗脱时间范围的洗脱液分为5个组分，多次重复操 作，收集洗脱液，将有机溶剂挥发后冷冻干燥，测定E5a到E5e组分多肽含量，配置相同浓度 的溶液测定ACE抑制率，保留时间段分别为24-26. 5min和31. 9-32. 3min的E5b和E5e组 分的ACE抑制率均大于70 % ; 步骤8 :将反相液谱制备柱分离得到的组分E5b和E5e进行液质分析，然后利用串联质 谱对一级质谱中的肽段氨基酸序列进行了分析，得到所述多肽序列，即为八肽MENSAEPE和 五肽LDTDY。
3. 根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方 法，其特征在于，所述牦牛如乳清蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤： 步骤1 :将新鲜的牦牛乳高速离心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脱脂乳； 步骤2 :将所得脱脂乳在35-50°C范围内的恒温水浴箱中进行保温，采用磁力加热搅拌 器进行搅拌，边搅拌边滴加IM HCl溶液，使脱脂乳溶液的pH达到4. 6,使酪蛋白进行沉淀， 6000 rpm离心20 min后，得到上清液； 步骤3 :将上清液用采用磁力搅拌器进行搅拌，边搅拌边滴加IM NaOH调节pH值5. 2， 再加热至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm离心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，将其冷 冻干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的冻干粉。
4. 根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方 法，其特征在于，步骤3中所述的一级超滤处理的条件为： 采用MWCO为10 kDa的超滤膜进行一级超滤：乳清蛋白降血压多肽浓度5 %，溶液pH 7. 0,操作压力0? 15 MPa，温度45°C，超滤时间2h。
5. 根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方 法，其特征在于，步骤4中所述的二级超滤处理的条件为：采用MWCO为6 kDa的超滤膜对一 级滤液，进行超滤l~3h，压力0? 15 MPa，温度45°C，pH值7。
6. 根据权利要求2所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方 法，其特征在于，步骤5中所述层析柱为SephadexG-25凝胶层析柱。
7. 根据权利要求6所述的牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备方 法，其特征在于，所述Sephadex G-25凝胶柱2. 6 X 80cm，超纯水0. 6 mL/min洗脱，波长检 测 215 nm〇
【专利摘要】本发明公开了两条牦牛乳乳清蛋白源血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽及其制备方法。本发明所述的两条ACE抑制肽，分别为八肽MENSAEPE和五肽LDTDY。本发明采用酶解牦牛乳乳清蛋白制备出两条有效地ACE抑制肽，以新鲜牦牛乳为原料，选材纯天然，营养价值高，牦牛乳乳清蛋白还具有多种生理功能，且含有人体生长发育所必需的氨基酸，酶解后可制备大量的ACE抑制肽，该产品具有用量小、无毒副作用、性质温和、生理功能强的特点。
【IPC分类】A61P9-12, C12P21-06, C07K7-06, C07K1-34
【公开号】CN104877007
【申请号】CN201510077783
【发明人】任发政, 赵亮, 郭慧媛, 李依璇, 田劢, 崔娜
【申请人】任发政
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年2月13日