一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于罗汉果叶片蛋白质提取领域，特别是一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法。
【背景技术】
[0002]罗汉果(Siraidiagrosvenorii (Swingle)C.Jeffrey)为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)的雌雄异株植物，具有重要的医疗和保健价值。罗汉果果实营养价值高，含有丰富的果糖、葡萄糖、蛋白质和多种维生素，其性凉味甘，具有清热解毒、止咳润肺等功效，已广泛应用于医药、饮料和调味品中。罗汉果甜甙甜度高、热量低、无毒，可作为肥胖病人、糖尿病人、高血压病人理想的食品添加剂。在历届《中国药典》中均有记载，具有清热润肺、滑肠通便的功效，用于治疗肺火燥咳。现代药理研宄，其药理有效成分主要是罗汉果皂苷。目前，罗汉果优良品种稀少、种性退化、混杂严重、产量低、品质差。迄今为止，国内对罗汉果的研宄主要集中在选育品种方面，对于罗汉果的发育机理研宄较少，植株的蛋白质有效成分研宄尚未见报道。
[0003]由于罗汉果植物叶片本身蛋白含量低，且常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物，蛋白质提取有一定的难度，获得的蛋白质样品溶液粘稠，因为蛋白质样品中含有大量的多糖类物质，在使用丙酮等有机溶剂沉淀蛋白的同时，多糖类物质也沉淀下来。多糖类物质可溶于水，从而导致蛋白质样品溶液粘稠并影响蛋白质的溶解，进而影响了蛋白质样品的上样量和电泳的质量。传统方法主要采用酚法进行了植物叶片蛋白质提取，利用多糖类物质不溶于酚相这一特征，可使用饱和酚萃取蛋白，从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质，但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。因此，酚法提取得到的罗汉果叶片蛋白质质量不佳，无法用于下一步蛋白质组学分离，进而无法进行蛋白质组学分析。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，解决传统的酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚类和盐类物质的问题，实现了罗汉果叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组学分析，并提供至少后面将说明的优点。
[0005]本发明还有一个目的是通过采用微波装置进行微波处理，工艺简单，节能、污染小，进一步提高了蛋白质提取效率。
[0006]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，
[0007]将预处理得到的罗汉果叶片粉末与第一蛋白质提取液混合，于-20°C中静置10-14h，4°C下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每Ig罗汉果叶片粉末添加2-4ml ；
[0008]所述第一蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比10000: 5-10混合，加入三氯醋酸，混合，于_20°C保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每Iml丙酮需1-1.05go
[0009]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0010]将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔1min振荡一次，振荡至重悬，置于_20°C放置l_3h，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第二沉淀，其中所述第二蛋白质提取液的加入量为每Ig第一沉淀添加200-250 μ L ；
[0011]所述第二蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比为10000: 6-10混合，于-20°C保存备用。
[0012]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0013]将所述第二沉淀与第三蛋白质提取液混合，振荡至重悬2-3次，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第三沉淀，其中，所述第三蛋白质提取液的加入量为每Ig第二沉淀添加200-250 μ L ；
[0014]其中，所述第三蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮、双蒸水以及巯基乙醇按体积比8000: 2000: 5-10混合，于-20°C保存备用。
[0015]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述预处理是指将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯吡咯烷酮，研磨，得罗汉果叶片粉末。
[0016]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0017]S1:将所述第三沉淀冷冻干燥至粉末状，于-20°C保存备用；
[0018]S2:将所述步骤SI得到的第三沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4°C裂解ll_13h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每Ig所述第三沉淀粉末添加Iml ；
[0019]所述蛋白质裂解液的制备方法为:按质量比96: 30-31: 6-9: 1_2将尿素、硫脲、3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20 °C保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需Iml ；
[0020]S3:将所述罗汉果叶片裂解溶液于4°C离心28-32min，转速为12000r/min，取上层清液，即为罗汉果叶片总蛋白质。
[0021]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述步骤SI中，在冷冻干燥之前将所述第三沉淀与质量分数为8%的氯化钠溶液按照质量比1: 4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w。
[0022]优选的是，所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述预处理时，将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1: 18混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为20MPa，萃取温度为30°C _33°C，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1: 100混合，搅拌lOmin，加入摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的碳酸氢钠溶液直至pH值为9.2-9.6，22°C下静置3h，清水洗至pH值为6.8-7.1，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末。
[0023]本发明至少包括以下有益效果:解决传统的酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚类和盐类物质的问题，实现了罗汉果叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于蛋白质组学分析；通过采用微波装置进行微波处理，工艺简单，节能、污染小，进一步提高了蛋白质提取效率。
[0024]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研宄和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0025]图1为实施例2中提取的罗汉果叶片总蛋白质双向电泳图谱；
[0026]图2为传统酚法提取的罗汉果叶片总蛋白质双向电泳图谱。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0028]实施例1
[0029]本发明提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，
[0030]将预处理得到的罗汉果叶片粉末与第一蛋白质提取液混合，于-20°C中静置10h，4°C下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每Ig罗汉果叶片粉末添加2ml，利用第一蛋白质提取液对罗汉果叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素、留醇等，而12000r/min高速转速的离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、留醇等物质都溶解于所述第一蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若第一蛋白质提取液的加入量不足，会导致细胞破碎效果差，进而影响提纯效果，而加入量过多，则造成不必要的浪费。
[0031]所述第一蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比10000: 5混合，加入三氯醋酸，混合，于-20°c保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每Iml丙酮需lg，丙酮和三氯醋酸按所述比例同时作用时，可以促进绝大多数蛋白质沉淀，而巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。
[0032]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0033]将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔1min振荡一次，振荡至重悬，置于_20°C放置lh，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层