专利名称：：蜂王浆新鲜度检测试纸制备及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种属于医药、食品及生物
技术领域：
中用于蜂王浆新鲜度检测的检测设备、其制备及应用方法，更具体地，涉及一种可用于简便、快捷、有效地评判蜂王浆新鲜度的检测试纸、其制备及应用方法。
背景技术：
：由于鲜王浆通常贮存在一2(TC或更低的温度以保持其活性成分，如果贮存温度不当，将会导致功能成分丢失或变质而失去商业价值，但目前尚无简便、快捷、有效的方法评判蜂王浆的新鲜度和品质。我们最近通过蛋白质组学技术证明蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5可做为新鲜度的蛋白标记物。由于纳米级胶体金(Colloidalgold)具有高电子密度，能与生物大分子结合,胶体金技术己成为继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后新发展起来的一种常用的固相标记技术。纳米胶体金检测试纸技术以免疫层析反应和胶体金技术为基础，利用目标蛋白与其抗体的特异性反应，快速鉴别样品中是否存在目标蛋白。检测试纸工作是原理，试纸条上的硝酸纤维膜(NC膜)检测线固定有目标蛋白抗体，质控线则固定有前述抗体的二抗，检测线和控制线前的胶体金释放垫含有表面标记上了目标蛋白抗体的纳米胶体金颗粒，样品溶液在层析作用下移动到胶体金释放垫时将胶体金标记的抗体解吸下来并继续移动，如果样品溶液中含有目标蛋白，将形成目标蛋白-抗体-'纳米胶体金复合物，到检测线时，复合物将与固定在检测线上的目标蛋白抗体结合，未结合上的复合物和剩余的胶体金标记抗体会继续移动到质控线与二抗结合，使检测线和质控线显现胶体金的红色。纳米胶体金检测试纸制作的具体数据方法极易从相关科学书籍和文献中获得。通过对蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5进行色谱分离纯化、基因克隆表达和蛋白质表位氨基酸分析合成，分别获得上述三种天然蛋白，三种表达蛋白和三种人工合成多肽，制备这些蛋白多肽的单克隆抗体或多克隆抗体，可用于上述检测蜂王浆新鲜度的纳米胶体金检测试纸的制作。基因克隆表达、蛋白质表位氨基酸分析合成、单克隆抗体制备和多克隆抗体制备的具体数据方法极易从相关科学书籍和文献中获得。
发明内容在已有的科学知识基础上，以蜂王浆中易受贮存温度影响的蛋白质为检测目标评价蜂王浆新鲜度和品质，发明了一种快速、低成本和高灵敏度的用于蜂王浆及其他相关产品生产、销售和使用过程中的原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面的纳米胶体金检测试纸。首先使用双向电泳分离/色谱分离-质谱分析技术确定蜂王浆中易受贮存温度影响的检测目标蛋白，如葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5。利用多肽合成、基因克隆表达和蜂王浆中天然蛋白分离技术获得检测目标蛋白及特异肽片段，获得检测目标蛋白及特异肽片段的单抗或多抗，制备可检测一种或多种易受贮存温度影响的目标蛋白的蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸。本发明检测试纸包括滤纸(l)、释放垫(2)、检测线(3)、质控线(4)和衬板(5)。本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的葡萄糖氧化酶。本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的王浆蛋白4。本发明检测试纸检测目标为蜂王浆中易受贮存温度影响的王浆蛋白5。本发明检测试纸检测目标蛋白在室温贮存下易降解。本发明检测试纸制备检测目标蛋白或特异肽片段的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明检测试纸在蛋白质组分析比较结果基础上，利用多肽合成、基因克隆表达和蜂王浆中天然蛋白分离技术获得检测目标蛋白及特异肽片段。本发明检测试纸的方法，其特征在于获得葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5或特异肽片段的单抗或多抗，用抗体标记胶体金制作释放垫，用抗体作为检测线，用相应的二抗作为质控线，检测蜂王浆新鲜度和含量。本发明检测试纸检测蜂王浆中的蛋白降解情况指示蜂王浆新鲜度和品质。本发明检测试纸用于蜂王浆品质的快速、低成本和高灵敏度检测。本发明检测试纸用于蜂王浆生产、销售和使用过程中的原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面。本发明检测试纸用于其他相关产品中蜂王浆含量检测。图l:纳米胶体金检测试纸腑视图。图2:纳米胶体金检测试纸侧视图。'图3:不同储存条件下王浆蛋白的双向电泳图谱。(a),(b),(c)和(d)分别对应新鲜王浆、一2(TC储存一年、4'C储存一年和室温储存一年的王浆图谱。电泳上样量均为200ug，考马斯亮兰G-250染色。图4:不同储存条件下王浆蛋白4(Apa4)的双向电泳图谱(从图1对应位置切割而来)。(a)，(b),(c)，(d)同图2。从图中可以较为直观的看出随着储存温度的升高，王桨蛋白4(Apa4)降解程度越来越高，最后甚至消失殆尽。'说明这种王浆蛋白对储存温度比较敏感。图5:不同储存条件下王浆蛋白5(APa5)和葡萄糖氧化酶(God)电泳图谱(从图1对应位置切割而来)。(a),(b),(c)，(d)同图2。从图中可以较为直观的看出随着储存温度的升高，王浆蛋白5(Apa5)和葡萄糖氧化酶(God)降解程度越来越高，最后甚至消失殆尽。说明这两种王浆蛋白对储存温度比较敏感。图6:王浆蛋白4的肽质量指纹图谱。图7:王浆蛋白5的肽质量指纹图谱。图8:葡萄糖氧化酶的肽质量指纹图谱。图9:新鲜蜂王浆的Superosel2HR分子筛色谱分离结果。从图中可看出，新鲜蜂王浆蛋白经Superose12HR分子筛分离可明显得到7个色谱峰。图10:—20'C储存一年、4。C储存一年和室温储存一年的王浆经Superose12HR分子筛色谱分离得到的7个蛋白质多肽峰相对峰面积比较，结果显示不同条件下储存的王浆7个蛋白组分含量存在较大差异。图lh4。C储存一年的王浆经Superose12HR分子筛色谱分离得到的第4个蛋白质多肽峰的NanoLCMS/MS序列分析结果，表明示4'C储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白l、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3。图12:—2(TC储存一年的王浆经Superose12HR分子筛色谱分离得到的第4个蛋白质多肽峰的NanoLCMS/MS序列分析结果，表明示-2(TC储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白1、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3和王浆蛋白5，表明示4'C储存王浆的第4个色谱峰中可检测到王浆蛋白1、王浆蛋白2、王浆蛋白7、王浆蛋白3，而王浆蛋白5只能在-20'C储存王浆的第4个色谱峰中检测到。序列表1、王浆蛋白4的肽序列及匹配结果:(注加粗标识部分为与NCBI数据库中所示肽段相匹配的部分)。1MTKWLLLMVCLGIACQNIRGGVVRENSSGKNLTNTLNVIHKWKYLDYDFD51NDERRQAAIQSGEYDRTKNYPLDVDQWHNKTFLAVIRYNGVPSSLNVVSD101KTGNGGRLLQPYPDWSFAKYEDCSGIVSAPKIAIDEYERLWVLDSGLVNN151TQPMCSPKLFAFDLNTSQLLKQVEIPHDVATTGKGELVSLTVQAMDSTNT201MVYMVDNKNTLIIYQNADDSFHRLSSHTLNHNSDKMSDQQENLTLKEVDN251KVYGMALSPVTHNLYYNSPSSENLYYVNTESLMKSENQGNDVQYERVQDV301FDSQLTVKAVSKNGVLLFGLA丽TLSCWNEHQSLDRQNIDVVARNEDTLQ351MVVSMKIKQNVPQSGRVNNTQRNEYLLAlisDRNQNVL丽DLNLEHVNFQI401LGANVNDLIRNSRCANFDNQDNNHYNHNHNQARHSSKSDNQNNNQHNDQA451HHSSKS丽RHNNND■2、王浆蛋白5的肽序列及匹配结果(注加粗标识部分为与NCBI数据库中所示肽段相匹配的部分)。1MTKWLLLVVCLGIACQDVTSAAVNHQRKSANNLAHSMKVIYEWKHIDFDF51GSDERRDAAIKSGEFDHTKNYPFDVDRWRDKTFVTIERNNGVPSSLNVVT101NKKGKGGPLLRPYPDWSFAKYEDCSGIVSAFKIAVDKFDRLWVLDSGLVN151删QPMCSPKJ丄TFDLKTSKLVKQVEIPHNIAVNATTGMGELVSLAVQATD201RTNTMVYIADEKGEGLIMYQNSDDSFHRLTSNTFDYDPRYTKLTVAGESF251TVKNGIYGIALSPVTNNLYYSPLLSHGLYYVDTEQFSNPQYEE丽VQYEG301SQDILNTQSFGKVVSKNGVLFLGLVGNSGIACVNEHQVLQRESFDVVAQN351EETLQMIVSMK1MENLP(JSGRINDPEGNEYMLALSNRMQKITNNDFNFND401VNF肌GANVDDLMRNTRCGRYHNQNAGNQNADNQNADNQNA画QNADNQ451NANKQNGNRQNDNRQNDNKQNG雨QNDNKQNGNRQNDNKQNGNRQNGNKQ501NDNKQNGNRQNDNKRNGNRQNDNQ應QNDNNRNDNQVHHSSKLH3、葡萄糖氧化酶的肽序列及匹配结果(注加粗标识部分为与NCBI数据库中所示肽段相匹配的部分)。1MAILNSMYNNVSPLQCTSPFLGGPQLTDVCSASNGELFLALLNFFVATSP51VIGEPC(JRVHSSRIPDLSYDF1VVGGGAARAVVAGRLSEVSNWKVLLLEA101GPDEPAGAEIPSNLQLYLGGDLDWKYYTTN,ESHACLSTGGSCYWPRGKNL151GGTTLHHGMAYHRGHRKDYERWVQQGAFGWSWDEVMPYYLKSE丽TELSR201VGTKYHRSGGL画VERFPYQPPFAWKILKAAEEAGFGVSEDLSGDRINGF251TVAQTISRNGVRLSSARAFITPFENRSNLHy画ATVTKVRTLNKRATGV301NVLINGRRRIIFARREVILSAGSVNTPQLLMLSGIGPKEHLRSLGIPVVV351DLPGVGENLHNHQSFGMDFSLNEDFYPTFNQTNVDQYLYNQTGPLSSTGL401AQVTGIWHSNLTTPDDPDIQIFFAGYQAICKPKLKIADLSAHDKQAVRMS451ALNVQPTSKGRITLNSKDPLDPPVIWSNDLATEHDRSVMIQAIRVVQKLV501NTTVMRDLGVEFQK正LKQCDEFVEDSDDYWNCVIQYNTRAENHQTGTAK551MGPSYDPMAVVSPRLKVHGIRGLRVADASV,VISGNPVASVNMVGERA601ADFIKEDWGELLQLL4、王浆蛋白4核酸序列,61218243036424854606672788490%102108gtcacttgtaaaatatttgtaatatcctagaaaaaaaatgacaaaatggttgctgttgatggtatgccttggcatagcttgtcaaaatattagaggtggcgttgttcgagaaaattcctcgggaaaaaacttgacaaatacgttgaacgtgattcacaaatggaagtatctcgattatgatttcgataacgacgaaaggaggcaagctgcgattcaatctggcgaatatgatcgtacaaaaaattatcctcttgacgtcgatcaatggcacaacaagacttttctcgctgtaataagatacaatggtgtgccttcctctttgaacgtggtatctgacaaaactggcaacggtggacgacttctacaaccgtatcctgattggtcatttgccaagtacgaagattgctctggaatcgtgagcgctcataaaattgctatcgacgaatatgagagattgtgggttctggattcgggtctcgtcaataatacgcaacccatgtgttctccaaaactgttCgcttttgatcttaatacctcgcaattgctcaagcaagtcgagataccgcacgatgttgccaccacaggaaagggcgaattagtatctttaactgttcaagctatggattcgacaaatactatggtgtacatggtagacaacaaaaatactttgatcatctaccaaaatgccgatgattc加catcgattgtcttcccacactttgaatcacaactctgacaaaatgtcagatcaacaagaaaatctcaccttgaaagaagtagacaacaaagtttatggaatggcacttagtcccgtgacgcataatctttattacaattctccgtcttctgagaatttgtattatgttaacacagaatcgttaatgaaatcggaaaatcaaggaaatgacgtgcaatatgaaagagtccaagaCgttttcgacagtcaattaaccgttaaagcagtatcgaaaaatggcgtactccttttcggactcgcgaataatactcttagttgctggaacgagcatcagtcacttgacagacaaaatatcgatgtcgtagctcgaaatgaggacacgcttcaaatggtcgttagtatgaagattaagcaaaacgttccacaatctggcagagttaa<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>王浆蛋白5核酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6、王浆葡萄糖氧化酶核酸序列。.1ccggttttcattctctgagcgtaactcgacatggcgatcttaaactcaatgtacaacaac61gtatccccgctgcagtgcacgtcgccgttccttggcgggccgcagctgaccgacgtgtgc121tcggcgagcaacggcgagctgrtcctcgccctcctcaacttcttcgttgccacgagcccg181gtgatcggcgagccgtgccagcgcgtccactcctcgaggatacccgacctcagctacgac241ttcatcgtggtcggcggcggagccgcgcgggc鹏gtcgctggaaggctgagcgaggtt301tcgaattggaaggttctgcttctggaggcaggcccggacgagccggccggcgccgagata361cctagcaaccttcagctttatctaggcggggatctggactggaagtattacactacgaac421gagtcgcacgcctgcctaagcactggcggcagttgctactggcctcgaggcaagaatctc481gggggaacgacccttcaccacggcatggcgtaccaccgtggccatcgcaaggattacgag541agatgggtccagcagggcgcctttggctggagctgggacgaggttatgccgtattacctg601aaatcggagaacaacaccgagctgagcagagtcgggacaaagtaccatcgaagcggtgga661ctgatgaacgtggaaaggttcccataccagccacctttcgcttggaagatcctgaaagcg721gcggaggaggcgggtttcggcgtttcggaggacttgtcgg鹏atcggataaacggtttc781acggtggcgcagacgataagcaggaacggcgtgcgtttgagcagcgcgagagcgttcatc841acgccgttcgagaaccgaagtaacctccacgtg欲agtgaacgcgaccgtgacgaaagtg901agaacgttgaacaagagggcgacgggcgtgaacgtgttgatcaac鹏aggaggaggatc961atattcgcgagacgggaggtgatcctgtccgcaggctcggtgaacactcctcaactgctc1021atgttgtcgggcatagggccgaaggaacaccttcgatccctgggaatcccggtggtggtt1081gatctgcctggagttggcgagaaccttcacaatcaccaatcgttcggcatggatttctcg1141ttgaacgaggac加acccgaccttcaaccagaccaacgtcgaccagtacctgtacaat1201cagacgggccctctatccagcaccgggttggctcaggtgaccggtatatggcactcgaat1261ctcaccacccccgacgaccccgacatacagatattcttcgccggttaccaggcaatttgc1321aagccaaaattgaagatcgcagatctatcggcccacgacaaacaggcggtgagaatgtcc1381gcgttgaacgttcagccgacgagcaaaggtcgcatcacgttgaacagcaaagaccccctc1441gacccgcccgtcatctggagcaacgatctggccaccgagcacgaccgcagcgtcatgata1501caggcgatccgagtcgtgcaaaaattggtgaacactaccgtcatgagggatctgggggtc1561gagtttcaaaagatcgaactgaagcaatgcgacghgttcgtcgaggacagcgacgattac1621tggaactgcgtgatacagtacaacacgagggcggaaaatcatcagaccggcacggcgaag1681atgggacccagttacgatcctatggcggtcgtctqtccccggctcaaggtgcacggcatc1741aggggactgagagtggcagacgcctccgttcagccgcaggtgatctcgggtaatcctgtc1801gcctctgtcaatatggtcggcgagagggctgcagactttatcaaggaggattggggagaa1861ttacttcaattactgtaatcatttgttggagttaactgtactcgtgttttaaagctacgt1921atatatatataattattctg具体实施例方式实施例1蜂王浆蛋白双向电泳分离与质谱分析将不同储存条件下的王浆分别经磷酸抽提缓冲液(PB)和蛋白样品溶解缓冲液(LB)提取，提取液加入三氯乙酸使蛋白沉淀，得到不同储存条件下的王浆全蛋白。将蛋白重新溶解并检测浓度，然后按一定的上样量作双向电泳(固相pH梯度，17cm胶条，pH3-10),所得电泳图谱(图1)用专业分析软件分析。对表达丰度较高的目标蛋白点经酶切作质谱分析，质谱结果提交专业数据库进行序列比对进行蛋白鉴定(图2)。分析结果表明随着储存温度的升高，王浆蛋白4、王桨蛋白5和葡萄糖氧化酶的降解越来越严重(图l)，说明这三种蛋白对储存温度比较敏感。,实施例2蜂王浆蛋白色谱分离与质谱分析不同贮存条件保存的蜂王浆分别经丙酮沉淀，碱性缓冲液(pH8.2)复溶，获得新鲜蜂王浆、-20"贮存一年蜂王浆、4'C贮存一年蜂王浆、室温贮存一年蜂王浆的总蛋白，将上述蛋白样品进行分子筛色谱分离(图3)，确定在分子量10K至U100K的组分存在明显差异。选取其中第四组分(Re^7.34min)经胰酶消化，钠升级色谱分离和质谱序列分析(NanoLCMS/MS，表1)，确定王浆蛋白5仅能在鲜蜂王浆和-20。C贮存的蜂王浆中检测到。实施例3检测目标蛋白基因克隆表达根据从NCBI数据库中提供的王浆蛋白4、王浆蛋白5和葡萄糖氧化酶的序列合成各自的正向和反向引物，以蜜蜂工蜂头部的DNA为模板，进行PCR扩增。将扩增得到的目的片段与适当的载体(T质粒，试剂盒)连接组成重组体，然后导入受体菌(大肠杆菌toplO菌株，双抗)，菌落PCR筛选重组阳性克隆，对目标克隆一物进行核苷酸序列分析。将经测序证实无误的重组体重组入表达载体中，诱导使其表达。对表达产物分离纯化后进行质谱分析检测。实施例4检测目标蛋白表位氨基酸分析和多肽合成葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5序列如图4所示，利用多种软件分析目标蛋白的亲疏水性并预测其二级结构，每个目标蛋白选择1-2个抗原表位氨基酸序列，利用化学方法分别合成抗原表位多肽并与载体蛋白交联后用于单克隆或多克隆抗体体制备。实施例5蜂王浆中检测目标蛋白分离制备根据葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5的主要理化性质，对利用丙酮沉淀所得的-201:|￡存的蜂王浆总蛋白进行液相分离，具体方法是首先利用分子筛色谱技术将分子量不同的组分分离开，随后对上述各组分进行禽子交换色谱分离、疏水色谱分离和反相色谱分离，再辅以SDS电泳及正F进行纯度检验。对色谱分离到的纯蛋白组分进行胰酶消化和肽指纹图谱分析，确定可用于抗体制备的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5后，将上述三种蛋白组分脱盐，冷冻真空干燥。实施例6检测目标蛋白单克隆抗体体制备通过免疫小鼠和杂交瘤细胞制备检测目标蛋白单克隆抗体，具体方法是免疫与骨髓瘤细胞同源的健康小鼠后，分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养，筛选出高分泌特异性的阳性杂交瘤细胞进行体外培养，从培养液中制备单克隆抗体，或小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，从腹水中制备单克隆抗体抗体，最后用亲和色谱方法分离获得各种检测目标蛋白单克隆抗体。'实施例7检测目标蛋白多克隆抗体制备通过免疫新西兰大白兔制备检测目标蛋白多克隆抗体，具体方法是在第0、28、42、56天皮内多点注射新西兰大白兔，每次注射lmg目标蛋白或多肽合成物，70天后收集血清，利用亲和色谱方法分离获得各种检测目标蛋白多克隆抗体。实施例8纳米胶体金-抗体结合物制备采用柠檬酸三钠还原方法制备纳米直径的胶体金，调节pH至9.09.2，加入纯化的检测目标蛋白单克隆抗体或多克隆抗体后加入含稳定剂的BSA溶液，完成标记后先低速离心弃去沉淀，再将上清液高速离心后将得到的沉淀物溶于pH8.2的TBS溶液中，完成纳米胶体金-抗体结合物制备。，,实施例9纳米胶体金-抗体结合物释放垫制备将保存于TBS溶液中的纳米胶体金-抗体结合物进行适度稀释后，取吸水玻璃纤维素膜均匀等量浸于其中，随后冷冻真空干燥，剪切成所需大小，完成纳米胶体金-抗体结合物释放垫制备。实施例10硝酸纤维膜检测线和二抗控制线制备将纯化的检测目标蛋白单克隆抗体或多克隆，以及相应的二抗分别包被或喷涂硝酸纤维膜，具体说，用不同抗体分别包被不同的硝酸纤维膜，自然晾干或冷冻真空干燥后剪切成所需大小的细条，固定于吸水玻璃纤维素臆或经封闭液封闭过的涂硝酸纤维膜上，用作检测线和控制线；或者在硝酸纤维膜不同位置上喷涂出检测线和二抗控制线，自然晾干后用封闭液进行封闭。检测线可用葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5抗体中的一种或几种，也可用其他易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质的抗体。实施例U蜂王浆新鲜度纳米胶体金检测试纸组装在白色塑料垫板上固定一层吸水玻璃纤维素膜作为衬板，从下至上依次粘贴用于吸附样品的滤纸、纳米胶体金-抗体结合物释放垫、检测线和二抗质控线、吸水滤纸，检测线和质控线区域可为封闭过的硝酸纤维膜(图5)。实施例12单克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备单克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备方法参考实施例1-11，其检测线为单克隆抗体纳米胶体金，检测线可为一条至多条，含易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质抗体中的一种或几种，二抗质控线采用可市购的抗鼠Ig抗体。实施例13多克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备多克隆抗体纳米胶体金蜂王浆新鲜度测试纸制备方法参考实施例1-11，其检测线为多克隆抗体纳米胶体金，检测线可为一条至多条，含易受贮存温度影响的蜂王浆蛋白质抗体中的一种或几种，二抗质控线采用可市购的抗兔Ig抗体。实施例14利用蜂王桨新鲜度纳米胶体金检测试纸检测蜂王浆新鲜度取鲜蜂王浆、-201:贮存一年蜂王浆、4。C贮存一年蜂王浆、室温贮存一年蜂王浆，分别按一定比例加水稀释后，加于蜂王桨新鲜度纳米胶体金检测试纸下端吸附样品滤纸上，仅鲜蜂王浆和-2(TC贮存一年蜂王浆能使检测线和质控线显现胶体金的红色；短期4'C贮存和室温贮存的蜂王浆能使同一抗体的前一条或两条检测线和质控线显现胶体金的红色，但不能使同一抗体的后几条检测线显现胶体金的红色；而长期4"C贮存和室温贮存的蜂王浆仅能使质控线显现胶体金的红色。'权利要求1.一种蜂王浆新鲜度检测试纸，其特征在于以蜂王浆中易受贮存温度影响的蛋白质为检测目标评价蜂王浆新鲜度和品质。2.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于其检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的葡萄糖氧化酶。3.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于其检测目标为蜂王浆中最易受贮存温度影响的王浆蛋白4。4.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于其检测目标为蜂王浆中易受贮存温度影响的王浆蛋白5。5.根据权利要求1一4中所述检测试纸，其特征在于其中检测目标蛋白在室温贮存下易降解。6.根据权利要求1所述检测试纸，其，征在于制备检测目标蛋白或特异肽片段的单克隆抗体或多克隆抗体。7.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于在蛋白质组分析比较结果基础上，利用多肽合成、基因克隆表达和蜂王浆中天然蛋白分离技术获得检测目标蛋白及特异肽片段。8.根据权利要求1一7中所述检测试纸的方法，其特征在于获得葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5或特异肽片段的单抗或多抗，用抗体标记胶体金制作释放垫，用抗体作为检测线，用相应的二抗作为质控线，检测蜂王浆新鲜度和含量。9.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于检测蜂王浆中的蛋白降解情况指示蜂王浆新鲜度和品质。10.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于用于蜂王桨品质的快速、低成本和高灵敏度检测。11.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于用于蜂王桨生产、销售和使用过程中的原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面。12.根据权利要求1所述检测试纸，其特征在于用于其他相关产品中蜂王浆含量检测。全文摘要本发明涉及一种蜂王浆新鲜度检测试纸产品、其制备及应用方法，属于医药、食品及生物
技术领域：
。我们最近通过蛋白质组学技术证明蜂王浆中的葡萄糖氧化酶、王浆蛋白4和王浆蛋白5可做为新鲜度蛋白标记。本发明通过制备检测上述蛋白质的纳米胶体金检测试纸，实现了蜂王浆品质的快速度、低成本和高灵敏度检测。本检测试纸可用于生产、销售和使用过程中的蜂王浆原料品质鉴定、产品质量控制和活性价值测定等方面，也可用于其他相关产品中蜂王浆含量检测。全世界90％以上的蜂王浆产自我国，蜂王浆的年产值在20多亿元，随着人们生活水平的提高，蜂王浆正逐渐成为重要的天然保健品，因此，研制快速、简洁的品种检测方法势在必行。文档编号G01N33/68GK101206226SQ20071017632公开日2008年6月25日申请日期2007年10月25日优先权日2007年10月25日发明者毛冯,国占宝,张朝晖,李建科,潘映红申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所;中国农业科学院作物科学研究所