总蛋白质的提取方法中，所述预处理时，将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1: 18混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为20MPa，萃取温度为30°C，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1: 100混合，搅拌lOmin，加入摩尔浓度为0.4mol/L的碳酸氢钠溶液直至pH值为9.2，22°C下静置3h，清水洗至PH值为6.8，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末，这样可以将粉末中残余的脂类物质进行进一步萃取、分离，从而进一步提高蛋白质提取效率。
[0094]实施例5
[0095]本发明提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，
[0096]将预处理得到的罗汉果叶片粉末与第一蛋白质提取液混合，于-20°C中静置12h，4°C下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每Ig罗汉果叶片粉末添加3ml，利用第一蛋白质提取液对罗汉果叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素、留醇等，而12000r/min高速转速的离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、留醇等物质都溶解于所述第一蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若第一蛋白质提取液的加入量不足，会导致细胞破碎效果差，进而影响提纯效果，而加入量过多，则造成不必要的浪费。
[0097]所述第一蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比10000: 7混合，加入三氯醋酸，混合，于_20°C保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每Iml丙酮需1.02g，丙酮和三氯醋酸按所述比例同时作用时，可以促进绝大多数蛋白质沉淀，而巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。
[0098]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0099]将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔1min振荡一次，振荡至重悬，置于_20°C放置2h，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第二沉淀，其中所述第二蛋白质提取液的加入量为每Ig第一沉淀添加220 μ L，利用第二蛋白质提取液对第一沉淀中的蛋白质进行进一步提取，而12000r/min高速转速的离心可以进一步促进蛋白质和杂质物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而其它杂质也都溶解于所述第二蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若第二蛋白质提取液的加入量不足，会影响蛋白质提取效果，而加入量过多，则造成不必要的浪费；
[0100]所述第二蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与β-巯基乙醇按体积比为10000: 7混合，于-20°c保存备用，丙酮可以促进蛋白质沉淀，而β-巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。
[0101]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0102]将所述第二沉淀与第三蛋白质提取液混合，振荡至重悬2次，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第三沉淀，其中，所述第三蛋白质提取液的加入量为每Ig第二沉淀添加220 μ L，对第二沉淀中的蛋白质进行进一步提取，使得蛋白质提取效果更好。
[0103]其中，所述第三蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮、双蒸水以及巯基乙醇按体积比8000: 2000: 7混合，于-20°C保存备用，有效促进蛋白质沉淀。
[0104]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述预处理是指将罗汉果叶片剪成碎片，加入液氮以及聚乙烯吡咯烷酮，研磨，得罗汉果叶片粉末，用液氮研磨罗汉果叶片，可以研磨得更细，更充分，而且液氮低温使得细胞内的酶钝化，能够更好的保持蛋白质的完整性，防止DNA或RNA被破坏，为后续的组学分析做准备。
[0105]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0106]S1:将所述第三沉淀经冷冻干燥后粉碎得到第三沉淀粉末，于-20°C保存备用；
[0107]S2:将所述步骤SI得到的第三沉淀粉末与蛋白质裂解液混合，于4°C裂解12h，得罗汉果叶片裂解溶液，其中，所述蛋白质裂解液的加入量为每Ig所述第三沉淀粉末添加lml，将所述第三沉淀粉末中的蛋白质进行溶解，以实现可溶蛋白质与不可溶杂质的进一步分离；
[0108]所述蛋白质裂解液的制备方法为:按质量比96: 30.45: 8: 15.4将尿素、硫脲、3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐以及二硫苏糖醇混合均匀，加入双蒸水，于-20°C保存备用，所述双蒸水的加入量为每0.48g尿素需1ml，尿素可以降低蛋白质的活度系数促进其溶解，尿素添加不易过多，否则会使蛋白质变性，硫脲也可以促进蛋白质溶解；
[0109]S3:将所述罗汉果叶片裂解溶液于4°C离心30min，转速为12000r/min，取上层清液，即为罗汉果叶片总蛋白质，蛋白质溶解于所述罗汉果叶片裂解溶液，进一步与不溶性杂质分离，提纯效果更好。
[0110]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述步骤SI中，在冷冻干燥之前将所述第三沉淀与质量分数为8%的氯化钠溶液按照质量比1: 4混合，置于微波装置微波35s，微波功率为450w，此处采用微波技术，工艺简单、节能、污染小，有利于将蛋白质与所述其它杂质进行进一步分离，从而进一步提高了蛋白质提取效率，而氯化钠溶液则有助于保护蛋白质不容易变性。
[0111]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，所述预处理时，将罗汉果叶片研磨之后与超临界二氧化碳按质量比1: 18混合，投入超临界萃取罐，萃取压力为20MPa，萃取温度为32°C，取出萃取脂类后的粉末与清水按质量比1: 100混合，搅拌lOmin，加入摩尔浓度为0.5mol/L的碳酸氢钠溶液直至pH值为9.4，22°C下静置3h，清水洗至PH值为6.9，过滤，冷冻干燥，得罗汉果叶片粉末，这样可以将粉末中残余的脂类物质进行进一步萃取、分离，从而进一步提高蛋白质提取效率。
[0112]实施例6
[0113]本发明提供一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法，
[0114]将预处理得到的罗汉果叶片粉末与第一蛋白质提取液混合，于-20°C中静置14h，4°C下离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第一沉淀，其中，所述第一蛋白质提取液的加入量为每Ig罗汉果叶片粉末添加4ml，利用第一蛋白质提取液对罗汉果叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素、留醇等，而12000r/min高速转速的离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、留醇等物质都溶解于所述第一蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若第一蛋白质提取液的加入量不足，会导致细胞破碎效果差，进而影响提纯效果，而加入量过多，则造成不必要的浪费。
[0115]所述第一蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比10000: 10混合，加入三氯醋酸，混合，于-20°C保存备用，其中，所述三氯醋酸的加入量为每Iml丙酮需1.05g，丙酮和三氯醋酸按所述比例同时作用时，可以促进绝大多数蛋白质沉淀，而巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。
[0116]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括:
[0117]将所述第一沉淀与第二蛋白质提取液混合，每隔1min振荡一次，振荡至重悬，置于_20°C放置3h，于4°C离心30min，转速为12000r/min，取下层沉淀，得第二沉淀，其中所述第二蛋白质提取液的加入量为每Ig第一沉淀添加250 μ L，利用第二蛋白质提取液对第一沉淀中的蛋白质进行进一步提取，而12000r/min高速转速的离心可以进一步促进蛋白质和杂质物质进行有效分离，蛋白质主要集中在沉淀层，而其它杂质也都溶解于所述第二蛋白质提取液，也就是溶于上层清液，被带走；若第二蛋白质提取液的加入量不足，会影响蛋白质提取效果，而加入量过多，则造成不必要的浪费；
[0118]所述第二蛋白质提取液的制备方法为:将丙酮与巯基乙醇按体积比为10000: 10混合，于_20°C保存备用，丙酮可以促进蛋白质沉淀，而β-巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。
[0119]所述的用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法中，还包括: