一种纯化氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纯化辅酶的方法，尤其涉及一种纯化氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
【背景技术】
[0002]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸Nicotinamide adenine dinucleotide 缩写 NAD，也称二磷酸卩比啶核苷酸(缩写DPN)，或辅脱氢酶(codehydrogenase) I或辅酶I。NAD通过各种脱氢酶，从底物中接受一个氢原子和一个电子，变成还原型，吡啶环被还原，这个反应也能可逆地进行。因此NAD+可作为各种脱氢酶的一种共同底物，在两种脱氢酶之间进行作用，微量的存在就能催化二种底物间的氧化还原反应(电子传递)。NAD可以广泛用于化学合成的原料，市场需求量大。
[0003]目前主流的纯化工艺多采用离子交换树脂纯化和重结晶等手段，但生产过程不易控制，生产效率低，产品纯度只有95%左右，收率只有60%，不能满足市场的需求。
[0004]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0005]鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，旨在解决现有纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的工艺存在纯度低、收率低及产能受到限制的问题。
[0006]为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案:
一种纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，包括步骤:
a、对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；
b、然后在浓缩液中加入磷酸或盐酸调节pH至3-5，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；
C、对步骤b所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干。
[0007]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤a中纳滤采用的纳滤膜为截留分子量200的中空纤维膜。
[0008]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤a中浓缩液的浓度为30-50g/L。
[0009]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶。
[0010]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中缓冲盐溶液为甲酸和氢氧化钠配成的浓度为20mM的缓冲盐溶液。
[0011]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中缓冲盐溶液的PH为3-5。
[0012]所述的纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中A相和B相的体积比大于3:97，小于I。
[0013]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中梯度洗脱时间为40min。
[0014]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤b中检测波长为260 nm。
[0015]所述的纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，所述步骤c纳滤浓缩后的溶液浓度为100~150g/L。
[0016]有益效果:本发明提供的一种纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，本发明采用反相高效液相色谱法纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，获得的产品纯度高达99%，收率高达90%以上，生产效率也比其他工艺提高了 I倍以上，大大降低了生产成本，符合市场对产量和价格的需求，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0017]本发明提供了一种纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0018]本发明一种纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，该方法是采用反相高效液相色谱法对氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸进行纯化，从而使得纯化后的氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高、收率高，达到产业化要求。
[0019]一种纯化氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其中，包括步骤:
a、对酶催化反应所得反应液先后进行微滤和纳滤，收集浓缩液备用；
b、然后在浓缩液中加入磷酸或盐酸调节pH至3-5，用反相色谱柱为固定相，以缓冲盐溶液为A相、乙醇为B相，进行梯度洗脱纯化；
C、对步骤b所得的滤液进行纳滤，最后用真空冷冻干燥机冻干。
[0020]本发明中，所述步骤a将酶催化反应所得反应液先进行微滤，所述微滤用0.35 μ m的微滤膜过滤，其操作压力为0.1Mpa，所述微滤用于除掉微生物，这是由于微滤膜允许大分子和溶解性无机盐通过，而截留微生物、细菌及悬浮物等物质；然后再对微滤后所得滤液用纳滤膜进行纳滤，所述纳滤膜为中空纤维膜，优选地，所述纳滤膜为截留分子量200的中空纤维膜，采用此材料的纳滤膜能去除部分溶解性盐和分子量200以下的有机物，从而可进一步地提尚广品纯度和广品收益。
[0021]本发明中，所述步骤a中浓缩液的浓度为30_50g/L。本发明在样品溶液进样前，采用微滤和纳滤对样品溶液进行处理，可去除颗粒物、微生物、有机物和部分溶解的无机盐等，以缩短后续色谱洗脱时间，且还能避免颗粒物堵塞柱子，从而延长柱子的使用寿命。本发明步骤a中经微滤和纳滤浓缩后的浓缩液的浓度为30-50g/L，将样品溶液浓缩至该浓度下有利于缩短步骤b中样品洗脱时间，且还能提高分离效率。
[0022]本发明中，所述步骤b中反相色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，采用该非极性的十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相，可高效快速分离样品溶液，获得的氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纯度高和收益高。
[0023]进一步，本发明所述步骤b中还采用HCl回流法对十八烷基硅烷键合硅胶进行预处理，用HCl活化十八烷基硅烷键合硅胶柱，可使S1-O-Si键断裂，形成游离的S1-OH，提高硅胶表面的硅羟基含量，更有利于键合反应的进行，色谱分离效果更佳。
[0024]本发明所述步骤b中，缓冲盐溶液为甲酸和氢氧化钠配成的浓度为20mM的缓冲盐溶液。缓冲盐溶液的浓度高低直接影响目标组分的峰形，从而影响色谱柱的分离效果。缓冲盐溶液浓度较低会导致色谱峰拖尾和色谱峰变宽，缓冲盐溶液浓度较高时会损伤色谱柱，缩短色谱柱的寿命，本发明中在缓冲盐溶液浓度为20mM时，得到的色谱峰峰形较好，色谱分离效果更佳。
[0025]进一步，本发明所述步骤b中缓冲盐溶液pH为3-5。选择正确的缓冲盐溶液pH值对可离解的化合物十分关键，恰当的缓冲盐溶液PH值可保证可离解的化合物以一种形式存在，从而有助于获得好的和尖锐的峰，使得分离效果更好；而在不恰当的PH值时可能导致宽峰、不对称峰和分裂峰。在本发明缓冲盐溶液PH为3-5时，得到的目的峰峰形较好。优选地，缓冲盐溶液pH为4时，目的峰峰形最好，分离的效果最佳。
[0026]进一步，本发明所述步骤b中A相和B相的体积比大于3:97，小于I。优选地，A相和B相的体积比大于20:80，小于40:60o在该配比内，氧化型β _烟酰胺腺嘌呤二核苷酸能得到良好分离。
[0027]进一步，本发明所述步骤b中梯度为3%?15% B%,流动相在该比例内能达到对氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸快速分离及较好分离效果的目的。
[0028]进一步，本发明步骤b中选择检测波长为260 nm，这是因为氧化型β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在该波长处具有最大吸收，从而使得色谱峰峰形较好，灵敏度更高。
[0029]本发明所述步骤b中梯度洗脱时间为40min，这是由于浓缩液中成分复杂，如果采用等梯度洗脱，洗脱时间较长，且分离的效率较差，灵敏度不高。本发明采用梯度洗脱来纯化氧化型烟酰胺腺嘌呤二