36] 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3 (A7) 蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。
[0137] 实施例6(仅加入万珂，肿瘤细胞为B16-F10细胞）
[0138] 一、Vx3(A7)蛋白的提取方法：
[0139] (1)将 PUbiG101-Vx3(A7)-eGFP 质粒转入大肠杆菌 E. coli(DH5-a );
[0140] (2)将步骤（1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB(Luria-Bertani)培养基培养并做 双酶切鉴定；
[0141] (3)将步骤（2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0. 5时加 IP TG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导 16h， 高速离心8000rpm，15min，弃去上清；
[0142] (4)将步骤（3)高速离心后得到的沉淀用Bing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，25mM imidazole, pH8.0)重悬，加入溶菌酶冰上反应30min;超声破碎后，高速离心 12000rpm，10min，4°C ;
[0143] (5)收集步骤（4)得到的上清，将其加入到镍离子亲和层析中，待与柱材料结合 后，用 Washing buffer(50mM NaH2PCM, 300mM NaCl, 150mM imidazole，pH8.0)洗去杂蛋 白，用 Elution buffer (50mM NaH2PCM, 300mM NaCl，300mM imidazole, ρΗ8·0)收集所要的 Vx3(A7)蛋白，冻存于-20°C，备用。
[0144] 二、泛素化蛋白的提取方法：
[0145] (1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的B16-F10细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至I X IO6个/ ml，并将其移入500ml细胞培养瓶中，在37°C、5% (V/V)C02的恒温培养箱中培养，每1~2 天换液一次，常规0. 25%胰蛋白酶消化传代；
[0146] (2)肿瘤细胞的处理：
[0147] 按步骤（1)方法培养，待细胞生长至80%，加入万珂，加入量为200nmol/L，干预肿 瘤细胞16小时，抑制泛素化蛋白的降解；
[0148] (3)提取泛素化蛋白：
[0149] 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3 (A7) 蛋白共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。
[0150] 实施例7 Western blot检测泛素化蛋白
[0151] 分别将实施例3和实施例4所得泛素化蛋白加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（江 苏碧云天，？0015)，15%聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，加抗泛素化抗体（3111:;[-1^3111:;[130(17)， 加二抗显色。
[0152] 1、制备分离胶和浓缩胶：配方如下
[0153] A分离胶（I5% )制备：
【主权项】
1. 一种抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，其主要是由以下步骤提取所得： (1) 肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养； (2) 肿瘤细胞的处理： 按步骤（1)方法培养细胞待细胞生长至80%，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，加入量分 别为（80_120)nmol/L、（160-240)nmol/L 和（25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞 14-18 小时，抑 制泛素化蛋白的降解； (3) 提取泛素化蛋白： 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3(A7)蛋白 共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。
2. 根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述肿瘤细胞为多发性骨 髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。
3. 根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述步骤（1)中的常规培养 方法如下： 复苏冻存的肿瘤细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (v/v)胎牛血清、lOOU/ml青霉 素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至I X IO6个/ml，并将其移入细胞培养瓶中， 在37°C、5% (V/V)C02的恒温培养箱中培养，每1~2天换液一次，常规0. 25%胰蛋白酶消 化传代。
4. 根据权利要求1所述的抗肿瘤泛素化蛋白，其特征在于，所述Vx3 (A7)蛋白的提取方 法包括如下步骤： (1)将pUbiG101-Vx3(A7)-eGFP质粒转入大肠杆菌E. coli (DH5-a ); (2) 将步骤（1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB培养基培养并做双酶切鉴定； (3) 将步骤（2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0. 5时加IPTG 诱导16h，高速离心8000rpm，15min，弃去上清； (4) 将步骤（3)高速离心后得到的沉淀用Bingbuffer重悬，加入溶菌酶冰上反应 30min ;超声破碎后，高速离心12000rpm，10min，4°C ; (5) 收集步骤（4)得到的上清，将其加入到镍离子亲和层析中，待与柱材料结合后，用 Washing buffer洗去杂蛋白，用Elution buffer收集所要的Vx3(A7)蛋白，冻存于-20°C， 备用。
5. 权利要求1-4任一项所述抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养； (2) 肿瘤细胞的处理： 按步骤（1)方法培养细胞待细胞生长至80%，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，加入量分 别为（80_120)nmol/L、（160-240)nmol/L 和（25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞 14-18 小时，抑 制泛素化蛋白的降解； (3) 提取泛素化蛋白： 将步骤（2)所得细胞经细胞裂解液处理后，离心得到沉淀，取上清液并同Vx3(A7)蛋白 共孵育，经镍离子亲和层析可得到泛素化蛋白。
6. 根据权利要求5所述的抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，所述肿瘤细胞 为多发性骨髓瘤细胞或黑色素瘤细胞。
7. 根据权利要求5所述的抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤（1)中 的常规培养方法如下： 复苏冻存的肿瘤细胞，40°C水浴融化后立即加入含10% (v/v)胎牛血清、lOOU/ml青霉 素和100U/ml链霉素的DMEM培养基，重悬细胞至I X IO6个/ml，并将其移入细胞培养瓶中， 在37°C、5% (V/V)C02的恒温培养箱中培养，每1~2天换液一次，常规0. 25%胰蛋白酶消 化传代。
8. 根据权利要求5所述的抗肿瘤泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，所述Vx3 (A7)蛋 白的提取方法包括如下步骤： (1) 将 pUbiG101-Vx3(A7)-eGFP 质粒转入大肠杆菌 E. coli (DH5-a ); (2) 将步骤（1)得到的大肠杆菌挑取单克隆，LB培养基培养并做双酶切鉴定； (3) 将步骤（2)鉴定后的细菌扩大培养，于菌液600nm波长下吸光值为0. 5时加IPTG 诱导16h，高速离心8000rpm，15min，弃去上清； (4) 将步骤（3)高速离心后得到的沉淀用Bing buffer重悬，加入溶菌酶冰上反应 30min ;超声破碎后，高速离心12000rpm，10min，4°C ; (5) 收集步骤（4)得到的上清，将其加入到镍离子亲和层析中，待与柱材料结合后，用 Washing buffer洗去杂蛋白，用Elution buffer收集所要的Vx3(A7)蛋白，冻存于-20°C， 备用。
9. 权利要求1-4任一项所述抗肿瘤泛素化蛋白的应用，其特征在于，所述泛素化蛋白 在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。
10. 根据权利要求9所述的抗肿瘤泛素化蛋白的应用，其特征在于，所述疫苗是由泛素 化蛋白和纳米铝佐剂联合制成。
【专利摘要】本发明公开了一种泛素化蛋白，其主要是由以下步骤提取所得：(1)肿瘤细胞的培养：复苏冻存的肿瘤细胞，按照常规培养方法培养；(2)肿瘤细胞的处理：(3)提取泛素化蛋白。发明还公开了所述泛素化蛋白的提取方法，以及所述泛素化蛋白在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。相对于现有技术，本发明蛋白能够大大提高交叉免疫反应的效果，大幅提高对不同种类肿瘤的抑制效果；此外，还克服了泛素化短寿蛋白降解快的问题，能够快速获取大量泛素化蛋白；最后，克服了短寿蛋白与长寿蛋白之间的不对称性，增加诱导特异性效应细胞的靶点，弥补以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗抗肿瘤效果不佳的缺陷。
【IPC分类】A61K39-00, C07K14-00, A61P35-00, C07K1-14
【公开号】CN104877017
【申请号】CN201510227961
【发明人】王立新
【申请人】东南大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月6日