专利名称：一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物及其设计方法
技术领域：
本发明属于一种病毒检测的专用引物及其设计方法领域，尤其涉及一种可检测不 同株系马铃薯病毒的专用引物及其设计方法。
背景技术：
酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来的体外核 酸扩增技术。PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤 构成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。通过PCR，能在一个试管内 将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，具有特异、敏 感、产率高、快速简便、重复性好、易于自动化等突出优点，PCR已广泛应用于生物检测和疾 病诊断等领域。多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，原理与常规PCR基本相同，只是在一个 PCR反应体系中加入两对以上引物，针对多个模板或同一个模板的不同区域扩增多个目的 片段的PCR技术。在上述两种PCR反应中，引物设计的好坏直接影响检测的特异性和灵敏度。近几年，PCR技术广泛用于类病毒、病毒、真菌、线虫等的检测方法，它可将极微量 的靶DNA特异的扩增上万倍，从而能检测到单分子DNA或对每10万个细胞中仅1个靶分子 的样品。利用PCR可以检测出植物组织中含量极低的病毒。此类技术不仅可以在基因水平 上为植物病毒的检测提供更灵敏的手段，而且可与核酸序列分析结合，检测基因序列的分 子变异，分析病毒株系间的序列同源性，比较亲缘关系，为病毒的鉴定提供可靠依据。由于 马铃薯病毒基因是单链正义RNA，所以我们需用RT-PCR的方法扩增病毒目的片段。反转录 酶链反应(Reverse Transcription-polymerase ChainReaction，RT-PCR)的基本原理是以 所需检测的病毒RNA为模板，反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。近年来， RT-PCR在植物病毒检测上显示出强大的优势，运用这种方法已成功检测了多种病毒。典型的RT-PCR包括样品RNA的制备、引物的设计和合成、反转录合成cDNA、以 cDNA为模板进行PCR扩增、扩增产物的检测。RT-PCR的基本步骤是首先提取病毒RNAjg 据病毒基因序列设计合成引物，反转录合成cDNA，然后进行cDNA扩增。取出扩增产物，利 用琼脂糖凝胶电泳进行检测病毒RNA的成功提取是运用RT-PCR技术的前提。同时，RT-PCR 还受到提取物中多酚和多糖的抑制。植物组织中的酚类物质被氧化后会和RNA不可逆地结 合，导致RNA的活性丧失，从而抑制RT-PCR反应。最新研究证实在RNA提取缓冲液中加亚 硫酸钠可改进核酸提取质量，而且在提取液中不需使用蛋白酶K，从而降低了费用。研究表 明，核酸样品中含有氯原酸会抑制反转录和PCR反应。影响PT-PCR的因素还包括反转录 中dNIPs的浓度，Taq DNA聚合酶的量，缓冲液中Mg2+的浓度，退火温度，反应循环次数等。合理的引物设计是成功应用RT-PCR技术的关键。引物的特异性对反应有很大的 影响，如果引物特异性不高，可能在扩增的过程中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。如对某种病毒进行检测，所选病毒基因组中的靶序列应为该种病毒的特异保守序列；如对 同种病毒的不同株系进行检测，则应选择该株系的特异序列区进行引物设计。对于马铃薯病毒的检测，更好的专用引物和检测条件是该领域研究的重要技术问 题，而好的引物与引物设计方法有着密切的关系。
发明内容
本发明公开了一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物及其设计方法。本发明 要解决的问题之一是提供一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物，本发明要解决的另 一个问题是提供一种用上述引物检测马铃薯病毒的方法，本发明要解决的第三个问题是提 供一种设计专用引物的方法。一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物，包括如下引物中的至少一对弓丨物对I序列表的序列1和序列2所示核苷酸序列组成的引物对；弓丨物对II序列表的序列3和序列4所示核苷酸序列组成的引物对；引物对III 序列表的序列5和序列6所示核苷酸序列组成的引物对；弓丨物对IV序列表的序列7和序列8所示核苷酸序列组成的引物对；弓丨物对V序列表的序列9和序列10所示核苷酸序列组成的引物对；引物对VI 序列表的序列11和序列12所示核苷酸序列组成的引物对；所述检测马铃薯病毒是马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶 病毒、马铃薯M病毒或番茄斑萎病毒病。所述专用引物由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V和引物对VI组成。另一引物组合方式是专用引物由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物 对V或引物对VI组成。上述可检测不同株系马铃薯病毒专用引物的检测方法A、病毒总RNA的提取提取马铃薯病毒的总RNA。B、RT-PCR 应用专用引物对病毒总RNA进行逆转录准备cDNA模板，应用专用引物 对cDNA模板进行PCR反应，得扩增产物。C、对扩增产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测，获病毒基因扩增条带，根据扩增片 段大小判断病毒种类。上述PCR 的反应参数是 94°C 3min，94°C变性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 个循环，最后72°C延伸lOmin，PCR反应结束后，取出扩增产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检 测。上述可检测不同株系马铃薯病毒专用引物的设计方法，包括以下方法或步骤a.通过NCBI (美国国立生物信息中心)的GENBANK数据库检索所有已报道、已发 现、已提交数据库的上述任一病毒序列；b.将同一病毒序列下载后，使用DNAMAN软件进行比对分析，筛选出不同株系的同 一病毒的病毒序列；c.通过DNAMAN软件将不同株系的同一病毒序列进行比对，寻找其保守区域；d.使用PRIMER5，OLIGO引物设计软件在保守区域内设计引物；
4
e.将设计好后的备选引物提交到NCBI的BLAST系统中进行电子PCR筛选，选择相 似性为100%，能搜索出最多不同株系同一病毒病毒序列的引物作为标准引物。检测马铃薯Y病毒(PVY)的引物序列是扩增片段大小550bpSEQ ID NO. 1 5-GAGCAACTCAATCACAGTTTGATAC-3SEQ ID NO. 2 5-TGTTCTTGACTCCAAGTAGAGTATG-3检测马铃薯S病毒(PVS)的引物序列是扩增片段大小SEQ ID NO. 3 5-TTCCAGAGGACGCCTTTGCAATC-3SEQ ID NO. 4 5-GTCTAACTGGCATCAGGGCACAATA-3检测马铃薯A病毒(PVA)的引物序列是扩增片段大小300bpSEQ ID NO. 5 5-CGCTCGCAAATGGGAGTGTT-3SEQ ID NO. 6 5-GCTCACTATAGGGGATCCAC-3检测马铃薯卷叶病毒(PLRV)的引物序列是扩增片段大小222bpSEQ ID NO. 7 5-AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3SEQ ID NO. 8 5-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3检测马铃薯M病毒(PVM)的引物序列是扩增片段大小630bpSEQ ID NO. 9 5-CGCATACAATATCTGGACTTACAC-3SEQ ID NO. 10 5-CTACTCCAGTAATGCAACTCATC-3检测番茄斑萎病毒(TSWV)的引物序列是扩增片段大小747bpSEQ ID NO. 11 5-GGCAAAGTGAATGTTCTATCTCCTAA-3SEQ ID NO. 12 5-TTCTCCCCTGGCAAAGTCTATC-3本发明的有益性本发明提供检测马铃薯病毒的专用引物，本发明提供了应用专 用引物检测马铃薯病毒的RC-PCR最佳检测方法和检测条件，基于RC-PCR检测其特异性强、 灵敏度高、检测速度快、操作简便、样品预处理简单、重复性好、易于分析；本发明还提供了 设计所述专用引物的方法，通过该方法筛选出的专用引物与马铃薯病毒相似性达100%可 检测已报道或发现的不同株系马铃薯病毒；在马铃薯病毒检测中具有广泛的应用价值。
下面结合具体实施例和
对本发明进一步说明。图1是PVY引物筛选结果图；图2是PVS引物筛选结果图；图3是PVA引物筛选结果图；图4是PLRV引物筛选结果图；图5是PVM引物筛选结果图；图6是TSWV引物筛选结果图；图7是下游引物浓度比和dNTP浓度对多重RT-PCR同时扩增PVY、PVA和PLRV的 影响电泳图；图8是Mg2+浓度对三重RT-PCR同时扩增PVY、PVA和PLRV三种病毒的影响电泳 图；图9是下游引物浓度比对多重RT-PCR同时扩增PVM、PVS和TSWV的影响电泳5
图10是Mg2+浓度对TSWV、PVM和PVS的三重RT-PCR扩增的影响电泳图。
具体实施例以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常 规生化试剂商店购买得到的，专用引物由英俊生物技术公司合成。实施例1专用引物的设计。以 PVM 为例1.通过 NCBI 的 GENBANK 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)检索所有已报 道、已发现、已提交数据库的PVM序列；2.将尽可能多的PVM序列下载后，使用DNAMAN软件进行比对分析，筛选出不同株 系的PVM病毒序列；3.通过DNAMAN软件将不同株系的PVM病毒序列进行比对，寻找其保守区域(即所 有株系完全相同，没有变异的一段DNA序列)；4.然后使用PRIMER5，OLIGO等引物设计软件在保守区域内设计筛选引物；5.将设计好后的备选引物提交到NCBI的BLAST系统中进行电子PCR筛 选(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer_blast/index.cgi ？ LINK_L0C = BlastHome)，选择相似性为100%，能搜索出最多不同株系PVM病毒序列的引物作为标准引 物。同样方法，通过NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/，美国国立生物信息中心) 检索已注册的PVM、PVS、PVY、PVA、PLRV和TSWV六种病毒所有序列后(9个PVA同源序列、 5个PVM同源序列、7个PVS同源序列、30个PVY同源序列、28个TSWV同源序列、^fPLRV 同源序列)，使用DNAMAN软件确定各个病毒的保守区域，最后通过0LIG0、PRIMER5等引物 设计软件针对该病毒的保守区域设计特异性引物。通过软件和相关网站工具对设计好的多对引物进行特异性、高效特征筛选，在比 胃工胃(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)白勺“nucleotide blast'中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物。通过比对，筛选出与六种病毒PVM、PVS、PVY、PVA、PLRV和TSWV相似性达100%的 引物序列。比较结果见图1至图6。六种病毒主要引物设计结果见序列表。实施例2单重RT-PCR标准化检测方法。RT-PCR检测步骤是现有常规步骤，下面是相关检测条件。1、反转录反应:20μ 1体系中，RNA 2. 5 μ 1，dNTP 0. 5mM, RNA抑制剂5U，下游引物 0. 5 μ 1，MMLV 反转录酶 50U。RT 反应条件为42°C 50min，94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反应25μ 体系中，cDNA 4 μ 1, dNTP 0. 2mM，Mg2+L 5mM，上下游引物各 0. 4μΜ，Taq 酶 1U。
PCR反应条件为94°C预变性:3min，94°C变性30s ；59°C退火30s，72°C延伸30s，共 30个循环；最后72°C延伸10min，4°C，保存。实施例3双重RT-PCR标准化检测方法。RT-PCR检测步骤是现有常规步骤，下面是相关检测条件。1、反转录反应20μ 1 体系中，RNA 2. 5 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1，RNA 抑制剂 10U， 5 XMMLV buffer 4 μ 1，20pM 病毒下游引物各 0. 5 μ 1，MMLV 反转录酶 IOOU0RT 反应条件为42°C 30min,94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反应25μ1 体系中，cDNA 4 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1, 10XPCR buffer2. 5 μ l,25mM Mgcl2 2 μ 1，20ρΜ 病毒上下游引物各 1 μ 1，Taq DNA 聚合酶 1. 5U。PCR 反应条件为94°C预变性:3min，94°C变性 30s ；59°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30个循环；最后72°C延伸10min，4°C，保存。实施例4三重RT-PCR标准化检测方法。RT-PCR检测步骤是现有常规步骤，下面是相关检测条件。1、反转录反应20μ 1 体系中，RNA 2. 5 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1，RNA 抑制剂 10U， 5 X MMLV buffer 4 μ 1，三种病毒上下游引物各0. 5 1 μ 1，MMLV反转录酶200U。RT 反应条件为42°C 30min,94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反应25μ1 体系中，cDNA 4 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1, 10XPCR buffer2. 5μ l,25mM Mgcl2 2· 5 μ 1，三种病毒上下游引物各0· 5 1 μ 1，Taq DNA聚合酶 2. 5U0PCR 反应条件为94°C预变性:3min，94°C变性 30s ；59°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30个循环；最后72°C延伸10min，4°C，保存。实施例5结合图7和图8。三重RT-PCR即一个反应中同时检测3种马铃薯病毒，本试验即同步检测PVY、PVA、 PLRV。与实施例4三重RT-PCR标准化检测方法相同。本试验设计的6对不同下游引物浓度比对同时扩增PVY、PVA和PLRV3种病毒没 有明显的影响，如图 7(1-6 泳道所示)。dNTP 浓度 1-6 :lmmol/L,8-13 1. 5mmol/L，15-20 2mmol/L ；下游引物浓度 PVY PVA PLRV 比依次为 0. 5 0. 5 0. 5,0. 7 0. 7 0. 7， 1.0 1.0 1.0,0.5 0. 7 1.0,0.7 0.5 1.0,1.0 0.7 0. 5 ;3 种病毒下游引 物不同的6对浓度比均能同时扩增出PVA、PVY和PLRV的靶标条带。反体转录系体中dNTP浓度为lmmol/L、1. 5mmol/L, 2mmol/L时，对三重RT-PCR同 时检测PVA、PVY和PLRV的影响如图7所示，当dNTP浓度为lmmol/L时能扩增出3种病毒 的靶标条带，且靶带清晰无拖尾和无非特异性条带(1-6泳道)；当dNTP浓度为1. 5mmol/L 时，只能同时扩增出PVY和PLRV的靶标条带(8-13泳道)；当dNTP浓度为2mmol/L时，3种 病毒的靶标条带均不能扩增出来(15-20泳道)。PCR 体系中 Mg2+ 浓度为 2. 5mmol/L, 3. 0mmol/L、3. 5mmol/L 时，对三重 RT-PCR 同时 检测PVA,PVY和PLRV的影响如图8所示，1,2泳道Mg2+浓度为3. 5mmol/L ；4，5泳道Mg2+浓度为 3mmol/L ；6，7 泳道 Mg2+ 浓度为 2. 5mmol/L。当Mg2+浓度为2. 5mmol/L时，无法进行三重扩增，只能扩增出PLRV的靶标条带(6， 7泳道)；当Mg2+浓度增至3. Ommol/L,同样无法进行3种病毒的同步扩增，而只能扩增出 PVY和PLRV两种病毒的靶标条带(4，5泳道)；当Mg2+浓度增为3. 5mmol/L,才能同时扩增 出PVA、PVY、PLRV3种病毒的靶标条带(1,2泳道)。试验结果表明，三重RT-PCR同时检测PVY、PVA和PLRV的体系，反转录反应中需加 入 dNTP 1. Ommol/L, RNA 抑制剂(ToYoBa)增至 20U，MMLV 反转录酶(ToYoBa)增至 200U，3 种病毒下游引物各0. 7 μ 1，42 V反转录50min可以合成足够量的cDNA用于PCR。PCR反应 中仅需将Mg2+增至3. 5mmol/L, dNTP增至0. 5mmol/L, Taq酶(ToYoBa)增至2U，上下游引物 各0. 8 μ mol/1 ；反应条件为94°C预变性3min, 94°C变性30s, 59°C退火30s, 72°C延伸lmin， 30个循环，最后72°C IOmin0运用优化后的三重RT-PCR体系对9个马铃薯带毒材料进行检 测，均可稳定的同时检测出PVY、PVA和PLRV。实施例6结合图9和图10。三重RT-PCR即一个反应中同时检测3种马铃薯病毒，与实施例4三重RT-PCR标 准化检测方法相同。本试验中对PVM、PVS、TSWV及PVM、PVS、PSTVd的两组病毒组合进行了 三重RT-PCR检测。在反转录时，对两组组合设计了 5对引物浓度比，其扩增效果如图9，1-5泳道 下游引物量 TSWV PVM PVS 分别为 0.5 1. 5 1. 5，1 1. 5 0. 5，1 1 0. 5， 1 1 1.5，1 1 1。同时扩增PVM、PVS、TSWV时下游引物量为1 1 1时扩增效果 最佳；扩增PVM、PVS和PSTVd时，下游引物量为时0.5 0. 5 1扩增效果最佳。PCR 体系中 Mg2+ 终浓度分别为 0. 25mmol/L,0. 5mmol/L,0. 75mmol/L 时，对三重 RT-PCR检测的影响结果如图10。结果表明同时检测TSWV、PVM、PVS, Mg2+终浓度为0. 25mmol/L,无法进行三重扩 增，PVM的靶标条带几乎不能看见，随着Mg2+浓度的提高，三条靶标条带逐渐明亮，当Mg2+终 浓度为0. 75mmol/L效果最佳，靶带最清晰明亮；同时检测PSTVd、PVM、PVS, Mg2+终浓度为 0. 25mmol/L仅PSTVd的靶标条带不够清晰，增加Mg2+终浓度至0. 5mmol/L则同时扩增的效
果最佳。
权利要求
1.一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物，其特征是包括如下引物中的至少一对引物对I 序列表的序列1和序列2所示核苷酸序列组成的引物对；引物对II 序列表的序列3和序列4所示核苷酸序列组成的引物对；引物对III 序列表的序列5和序列6所示核苷酸序列组成的引物对；引物对IV 序列表的序列7和序列8所示核苷酸序列组成的引物对；引物对V 序列表的序列9和序列10所示核苷酸序列组成的引物对；引物对VI 序列表的序列11和序列12所示核苷酸序列组成的引物对；所述检测马铃薯病毒是马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯卷叶病毒、 马铃薯M病毒或番茄斑萎病毒。
2.根据权利要求1所述的可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物，其特征是所述专 用引物由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V和引物对VI组成。
3.根据权利要求1所述的可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物，其特征是所述专 用引物由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V或引物对VI组成。
4.根据权利要求1至3任一项所述的可检测不同株系马铃薯病毒专用引物的检测方 法，其特征是包括以下步骤A、病毒总RNA的提取提取马铃薯病毒的总RNA；B、RT-PCR应用专用引物对病毒总RNA进行逆转录准备cDNA模板，应用专用引物对 cDNA模板进行PCR反应，得扩增产物；C、对扩增产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增片段大小判断病毒种类。
5.根据权利要求4所述的可检测不同株系马铃薯病毒专用引物的检测方法，其特征 是所述PCR的反应参数是94°C 3min, 94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，30个循 环，最后72°C延伸lOmin，PCR反应结束后，取出扩增产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测。
6.一种权利要求1所述的可检测不同株系马铃薯病毒专用引物的设计方法，其特征 是包括以下方法或步骤，a.通过NCBI的GENBANK数据库检索所有已报道、已发现、已提交数据库的上述任一病 毒序列；b.将同一病毒序列下载后，使用DNAMAN软件进行比对分析，筛选出不同株系的同一病 毒的病毒序列；c.通过DNAMAN软件将不同株系的同一病毒序列进行比对，寻找其保守区域；d.使用PRIMER5，OLIGO引物设计软件在保守区域内设计引物；e.将设计好后的备选引物提交到NCBI的BLAST系统中进行电子PCR筛选，选择相似性 为100%，能搜索出最多不同株系同一病毒病毒序列的引物作为标准引物。
全文摘要
本发明公开了一种可检测不同株系马铃薯病毒的专用引物及其设计方法。本发明提供的专用引物包括如下引物中的至少一对，序列表中引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V和引物对VI。本发明还提供了用所述专用引物进行马铃薯病毒检测的方法和条件；本发明还提供了专用引物的设计方法。本发明基于专用引物的RC-PCR检测其特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便、样品预处理简单、重复性好、易于分析；通过本发明设计筛选出的专用引物与马铃薯病毒相似性达100％可检测已报道或发现的不同株系马铃薯病毒；在马铃薯病毒检测中具有广泛的应用价值。
文档编号C12N15/11GK102146484SQ20111003105
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者万佳, 刘可, 孟兴, 宁红, 张敏, 张洪峰, 李霄林 申请人:中华人民共和国四川出入境检验检疫局, 四川省农业厅植物检疫站