一种特异性检测小麦秆锈菌的pcr方法

专利名称：一种特异性检测小麦秆锈菌的pcr方法
技术领域：
本发明属农业生物技术领域，特别是涉及一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方法。
背景技术：
小麦锈病致病菌包括小麦秆锈菌Puccinia graminis f. sp. tritici、小麦条锈菌 Puccinia striiformis f. sp. tritici禾P小麦叶绣菌Puccinia triticina f. sp. tritici, 是侵染小麦等禾谷类作物的重要致病真菌。小麦秆锈病是世界范围的小麦病害，在种植小 麦的国家和地区均有发生，主要分布于北美、澳洲及非洲等地。我国主要在华东沿海、长江 流域和福建、广东、广西的冬麦区及东北、内蒙古、西北等春麦区发生流行，给小麦生产造成 严重损失。1949 1966年的17年间，福建省就有6次大发生，重者损失40% 50%。1956 年江苏省的流行，造成减产50% 80%，个别田块甚至绝收。近30年来，由于推广抗病品 种，基本上控制了该病的流行和危害。但在一些流行区，感病品种仍占相当大的面积，流行 具有潜在的可能。1998年在非洲的乌干达发现新型的强致病力小麦秆锈菌Ug99，可克服已 在世界应用30余年的小麦抗病基因Sr31，导致所传播区域内小麦最高减产80%，这一新型 小种还没传播到中国，但是在中国应提早加强小麦秆锈病的研究和秆锈菌小种的监测。病害的早期诊断检测是准确测报和有效防控的基础和前提。长期以来，锈病的诊 断主要基于病原菌的生物学及病害症状特征，其预测预报主要基于定期、大规模的田间病 叶调查和温室病菌的活体分离、培养和鉴定。而在小麦锈病潜育阶段，寄主的发病症状不易 观察，难以界定初侵染的时期和规模，而且调查鉴定结果的准确性和可靠性在很大程度上 依赖于调查测报人员的经验和技术水平。传统锈病诊断及病情预报方法耗时费工，难以满 足病害的快速、高通量诊断检测实际需求。因此，有必要研发简单快捷、灵敏准确的小麦锈 病快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预报预测的准确性和快捷性均具有重要 的理论意义和实际应用价值。小麦3种锈病菌的田间症状非常相似，一些基层植保工作者时常会产生错报、误 报的情况，影响了数据的可靠性及预测预报的准确性，进而影响防治策略与防治措施的合 理性。因此利用分子生物学技术，采用PCR、琼脂糖凝胶电泳等一系列手段来区分小麦条锈 病、叶锈病和秆锈病3种致病菌是比较准确、快捷的病害诊断检测技术。目前，中国农业科学院植物保护研究所麦类病害实验室已经针对这一生产中面 临的实际问题，建立了小麦条锈菌和叶锈菌生理小种的特异性分子诊断检测技术(Cao et al. ,2007 ；曹丽华等，2007)。作为一种重要的小麦专性寄生菌，秆锈菌在微卫星分子标记方 面的研究远远滞后于其他小麦专性寄生菌，如叶锈菌和条锈菌，其SSR标记已有许多研究， 并公开发表了大量可以直接利用的引物序列。而现有秆锈菌的微卫星标记数量非常有限， 仅有LESJ. SZABO分离的M对引物可用(LES J. SZAB0, 2007)。这严重制约了微卫星标记在 秆锈菌检测方面的研究和应用。因此，迫切需要更多独立分离的、多态性丰富的秆锈菌微卫 星标记。
SSR(simple sequence repeats)又称短串联重复序列或简单重复序列，是一类广 泛存在于原核、真核生物基因组中的串联重复DNA。SSR核心序列一般为以1 6bp核苷酸 为单位的重复序列，侧翼序列大多是保守的单拷贝序列。微卫星具有较快的变异速率，而且 这些变异大都位于可积累的中性突变非编码区，因此微卫星具有丰富的多态性。SSR标记 最显著的优点是多态性高、信息量大；一般按照孟德尔方式分离，而呈共显性遗传，故可以 区分杂合子和纯合子，对个体鉴定具有重要意义；带型简单，实验结果稳定可靠，重复性高； 易于操作，对DNA质量要求不高，并且用量不大，甚至DNA轻度降解后，仍能扩增出目的微卫 星座位序列。目前许多物种已有现成的、商品化的SSR引物，并已广泛应用于遗传图谱的构 建、遗传多样性分析、基因标记、定位、克隆及辅助育种等。但由于SSR标记必须根据微卫 星两侧的序列设计引物，因此在引物设计之前必须搞清微卫星侧翼的序列，这使得SSR标 记的获得一般需要建立、筛选基因组文库，克隆测序等一系列实验，因此，人力、物力消耗较 大。如何快速获得微卫星序列是微卫星应用中最关键的一步。尽管公共数据库如GenBank、 EMBL和DDBJ上可以直接检索到一些物种的微卫星序列，但大多集中在模式物种及经济物 种上。对于像小麦秆锈菌这种微卫星序列资源相对较少的物种来说，通过实验方法来获得 更多的微卫星序列是必须的。Zane 等(2002)提出 FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats,借助含重复序列的AFLP序列快速分离SSR)，是将现阶段的微卫星开发策略很好 的结合起来的一种开发SSR的方法。该方法先对基因组DNA进行酶切，加上AFLP接头，用 带一个选择性碱基的引物组进行1次PCR扩增，用生物素标记的探针与变性的扩增产物杂 交，用磁珠富集富含SSR的片段，然后经一系列洗涤除去非特异性杂交，变性分离DNA片段 进行第2次扩增得到富含SSR的双链DNA，连接载体转化克隆测序。这种方法快速简单并 且高效，省去了很多不必要的步骤，该技术在鸟类、鱼类以及很多植物中的应用十分成熟。 目前逐渐开始在植物病原菌中应用，2005年Nakabonge等用此方法分离了 Cryphonectria eucalypti中的SSR标记；Hunter等Q006)在一种桉树属重要的叶部病害病原菌 Mycosphaerella nubilosa 中开发了 10 个微卫星标记；Barrtee 等 0006)从 Melampsora Iini开发了 11对多态性引物；Barnes等^)08)也用此法对红松疫病菌(Dothistroma septosporum)开发了 12对多态性引物。但此法尚未对小麦秆锈菌的多态性引物的开发进 行研究报道。

发明内容
本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方 法，该方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。一种特异性检测小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的PCR方法，其步骤如下(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察；其特征在于所述PCR反应体系中的引物是根据kq ID No. 1所示的序列设计的 正、反向引物，所述PCR扩增的阳性产物ID No. 1所示序列上正向引物完全互补识别 的起始碱基至反向弓I物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。
所述正向引物为Pgt-FSl-F :5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘，所述反向引物为Pgt-FSl-R :5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3 ‘，扩增产物为 330bp。所述PCR反应体系如下模板DNA 20nmol，正向引物40pmol，反向引物40pmol， 2 X PCR Master Mix 10 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。所述PCR反应的程序如下94°C 3分钟，94°C 1分钟，55°C 45秒，72°C 45秒，30个 循环，72°C 10min，4°C保存。本发明采用FIASCO法富集小麦秆锈菌的微卫星文库，将富集获得的微卫星片段 经过回收纯化，连接到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌Dffia感受态细胞，涂板于含有Amp的 LB固体培养基中，即构建成小麦秆锈菌基因组微卫星富集文库。经过蓝白斑筛选，挑取白色 克隆到含有Amp的LB液体培养基中，37°C培养过夜。将ImL菌液提取质粒，EcoR I酶检测 确定插入片段的有无及大小。挑取扩增片段在200-500bp之间的阳性克隆测序。测序结果 先用SSR Hunter搜索微卫星序列后再用EBI比对去除重复序列。挑选两侧翼区都足够长 的微卫星序列，从中选择一条SSR标记，其核苷酸序列如％(1 ID No. 1所示，是秆锈菌特有 的SSR标记序列，可应用于特异性检测鉴别小麦秆锈菌，这种应用包括用作探针，或者作为 设计特异性引物的模板，设计出的引物扩增待测模板，如果扩增出预期大小的片段说明该 待测模板中含有该SSR标记，也就是说该待测模板中含有小麦秆锈菌的DNA。本发明的优选实施例中，设计的引物为Pgt-FSl-F 5' -CTTGTAAACT CTCTCACATTGCCA-3’ /Pgt-FSl-R 5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3‘。该对引物用于检测小麦秆锈菌，具有特异性好、灵 敏度高、操作简便快速的优点，在叶片感病30h时即可检测到真菌。能够专一识别小麦秆锈 菌，能够鉴别小麦幼苗期麦苗的感染情况，使植保工作人员针对致病菌进行提早防治。获得 该引物后，植保工作人员通过简单的PCR、琼脂糖凝胶电泳检测等技术即可鉴定小麦是否感 染小麦秆锈菌，与其他种类致病菌的鉴定方法结合使用达到鉴别诊断的目的。本发明还进一步做了 PCR条件的优化工作，提供一种更有利于特异性、灵敏性地 扩增目的产物优选PCR方案。


图1.基因组DNA经选扩-纯化后得到的smear区域其中1为阴性对照，2、3为模板小麦秆锈菌(21C3)DNA图2.引物Pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R扩增测序结果图3.引物pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R应用在相关小麦真菌中的特异性检测其中泳道1-19 分别为小麦秆锈菌(Puccinia graminis) 17，19，21，21C1，21C2， 21C3，21C3CKR，21C3CTH，34，34C1，34C2MFR，34C2MFK,34C2MKR,34C3，34C4，34C5，40，116， 194号小种或致病类型，20-22分别为叶锈菌(Puccina triticina)PHK、PHT、THT致病类 型；23-25 分别为条锈菌(Puccinia striiformis) CY29、CY32、CY33 致病类型，26- 分别 为小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa) TCKDl、TCKD2、TCKD3菌株，29-为网腥黑粉菌 (T. caries) TCTSC 菌株，30-32 为光腥黑粉菌(T. foetida) TF1、TF2、TF3 菌株，33-为小麦散 黑粉菌(Ustilago tritici)UMl 菌株，34-玉米丝黑穗病原菌(Sporisorium reilianum)
5SRl菌株、35-为小麦赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027菌株、36-37为小麦赤霉菌 (Fusarium asiaticum) 1012、12003 菌株，39-43 为小麦白粉菌(Blumeria graminis) CPff-U E16、ES-l-S、E32、E06 菌株。图4.灵敏度检测其中泳道1-6 小麦秆锈菌Q1C3)模板DNA浓度分别为20ng/l·! 1，lOng/μ l,5ng/ μ l,lng/y 1,0. lng/μ 1,0. Olng/μ 1 ；7 阴性对照图5.引物I^gt-FSl-F/Pgt-FSl-R在染病叶片中的PCR检测结果其中泳道1是阴性对照(以DDW为模板)；2是小麦品种McNair 701未被秆锈菌 侵染叶片；3 9分别是小麦秆锈菌21C3侵染6h，12h，24h, 30h, 2d，3d，4d，5d，6d后取样并 经自来水冲洗叶片
具体实施例方式实验材料小麦秆锈菌21C3小麦秆锈菌分离物秆锈菌(Pucciniagraminis) 17，19，21，21C1，21C2，21C3， 21C3CKR,21C3CTH,34，34C1,34C2MFR,34C2MFK,34C2MKR,34C3,34C4,34C5，40，116，194，叶 锈菌(Puccina triticina) PHK、PHT、THT 致病类型，条锈菌(Puccinia striiformis) CY29、 CY32、CY33 致病类型，小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)TCKDl、TCKD2、TCKD3 菌 株、光腥黑粉菌(T. foetida)TFU TF2、TF3菌株、网腥黑粉菌(T. caries)TCTSC菌株、小麦 散黑穗病菌(Ustilago tritici)UMl菌株、玉米丝黑穗病原菌(Sporisorium reilianum) SRl菌株、小麦赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027菌株、小麦赤霉菌(Fusarium asiaticum) 1012、12003 菌株、小麦白粉菌(Blumeria graminis)CPff-U E16、ES-l-S、E32、 E06菌株。以上菌株均为已经发表在其它文献中的已知菌株，且本实验室均有保存，可向公 众发放用于验证试验。小麦品种McNair 701，可商购，本实验室有保存，可向公众发放。实施例1 小麦秆锈菌的扩繁本发明以中国麦区19份小麦秆锈菌单孢分离物为实验材料，在中国农业科学院 植物保护研究所常温室进行鉴定与大量扩繁，具体步骤如下1.种植小麦秆锈病感病品种McNair 701，待第1叶片完全展开第2片新叶长时， 接种19份小麦秆锈菌分离物。2.接种前先将叶片表面喷施0. 5%。的土温-20溶液润湿，然后用洁净手指夹住叶 片自下而上轻轻抹去叶片表面的蜡质。用洁净梭形接种针，蘸水轻轻挑取孢子(对于病叶， 在挑取时应尽量选择清晰，独立的夏孢子堆)，轻轻涂抹于麦苗的叶片正面。接种完成后，立 即将接种针用清水冲洗，然后蘸取75%酒精在酒精灯上灼烧消毒，以防污染后续标样的接 种。将接种完毕的麦苗放入保湿 筒，在叶片表面上喷上一层均勻细密的水雾后封闭保湿筒， 置于15-25°C遮光及90% -100%的相对湿度条件下保湿18_24h，之后置于15_30°C常温室 中，并适当补充光照至12-1 !，约5-7d后叶片显出褪绿斑剪去第二片心叶并罩上干净透明 的玻璃罩，待孢子堆充分发育后备用。
3.在叶片显斑后的7-10天内夏孢子成熟时，进行第一次收菌，将麦苗小心横放于 一个垂直放置的玻璃罩子上，用已消毒过的接种针从根部轻轻抖动叶片或轻轻敲打罩在麦 苗外的玻璃罩，使夏孢子散落到玻璃罩内，移去麦苗并轻敲玻璃罩，使夏孢子集中成一条直 线，装入写好标签的指形管。实施例2 =FIASCO法筛选小麦秆锈菌微卫星标记链霉亲和素磁珠购自hvitrogen北京公司，磁珠型号Dynakads M-280Str印tavidin。磁性分离架购自hvitrogen 北京公司，型号 DynaMag -Spin magnet 123-20D生物素标记探针核苷酸序列为(TC) 10，3'端经生物素修饰，合成自上海生工生 物工程技术服务有限公司。步骤1.基因组DNA的提取(1)预处理参照Paul J. Zambino的方法并加以改良称取IOmg小麦秆锈菌21C3的夏孢子、25mg硅藻土、250 士 IOmg直径Imm灭菌玻璃 珠分别装入2. 5ml灭菌螺口离心管，置于-30°C保存至少ld，欲抽提时立即从冰箱取出。(2)研磨置离心管于MPi^astft·印-24中，设6. 5M/s, IOs处理1次，共处理2次。(3)水浴加入预热 600 μ 1 CTAB 缓冲液(pH8. 0),60 μ 120 % SDS 缓冲液和 5 μ 1 蛋白酶K溶液，蜗旋混勻，65°C恒温水浴lh。裂解过程中每IOmin混勻一次，越到后期动作 越要温和，防止DNA破碎。(4)抽提待提取体系冷至室温，加入等体积氯仿/异戊醇混合溶液，4°C， M493Xg离心lOmin。取上清液至新离心管，再重复抽提操作2次。(5)去RNA 取上清至新离心管中，加入2μ 110mg/ml RNA酶，37°C恒温水浴l_2h。(6)精提同抽提步骤。(7)沉淀转上清至新离心管，加入2倍体积无水乙醇，4°C，1M93 Xg离心lOmin，
弃上清。(8)洗涤加入300 μ 1预冷70%乙醇，用移液器冲洗2遍。(9)溶解真空干燥lOmin，溶于20 μ 1 TE溶液(ρΗ8. 0)，4°C保存。利用紫外分光 光度计检测DNA的浓度和纯度，调整浓度至lOOng/μ 1，_20°C保存备用。步骤2.基因组DNA的酶切、连接及特定大小DNA片段的获得用MseI限制性内切酶65°C下切割基因组DNA 3h，随后与MseI A/Msel B(5~-TACT CAGGACTCAT-3" -GACGATGAGTCCTGAG-3") 16°C连接过夜。消化连接产物稀释后，采用 AFLP 接头特异性Mse I-N引物组(5、-GATGAGTCCTGAGTAAN-3)进行PCR预扩增，将PCR循环数设 定在21个循环，PCR反应成功的标志是电泳产物中出现一个Smear区域(300_800bp)，如图 1。步骤3.生物素探针杂交生物素标记探针核苷酸序列为(TC) 10，3端联生物素，合成自上海生工生物工程 技术服务有限公司。取上述PCR预扩增产物10μ L，95°C水浴解链5min，加入50°C预热的含有0. 1 % SDS的6 X SSC杂交缓冲液(pH7. 0)85 μ L和生物素标记探针5 μ L，构成100 μ L杂交体系。PCR仪中50°C反应30min，取出后，缓慢冷却至室温，加入300 μ L TEm00溶液(1 OOmM NaCl， IOmM Tris-HClpH7. 5, ImM EDTA)混勻，4°C保存备用。取Img的链霉亲和素磁珠(购自hvitrogen北京公司，磁珠型号Dynabeads M-280Streptavidin)，加入400 μ L ΤΕΝ100溶液仔细洗涤3次，每次洗涤都用磁性分离架 (购自hvitrogen北京公司，型号DynaMag -Spin magnet 123-20D)固定磁珠。洗涤完 毕后，用200 μ L TEmOO溶液重悬磁珠，接着加入到生物素探针杂交液中，室温反应lh， 待磁珠吸附完毕，用磁架固定磁珠，移去杂交混合液。沉淀用400 μ LTEN1000溶液(IOmM Tris-HCiamM EDTA，IM NaCl ρΗ7. 5)室温下洗涤3次，将与磁珠非特异性结合的DNA片段 洗脱。然后用400 μ L含0. SDS的0. 2X SSC特异性杂交洗脱液(ρΗ7. 0)室温下洗涤磁 珠3次，每次5分钟，再于50°C下洗涤lOmin，最后使用400 μ L 0. 2 X SSC室温下洗涤磁珠 IOmin,以除去残留SDS，洗涤过程中不时的搅动或轻轻用移液器吹打。步骤4.磁珠富集微卫星DNA片段在上述完成洗涤后的磁珠中加入50 μ L无菌水，然后于95°C下水浴5min，用磁架 收集磁珠后，迅速吸取上清液，按1 2的比例加入100 μ L冰冻乙醇，再加入10 μ L 5mol/ L的醋酸钠助沉，4 °C、13000r/min离心20min，弃上清后，用70 %酒精再清洗2遍，4 °C， 13000r/min离心20min，小心的移去乙醇，真空干燥机中干燥lOmin，加入50 μ L无菌水溶解
沉淀，4°C保存备用。步骤5.目的DNA片段的洗脱和精制以上述单链目的DNA片段为模板，用MseI-N引物组进行PCR扩增获得双链微卫 星DNA片段。PCR扩增的20 μ L反应体系中包含无菌水8.8 μ L，10*PCR buffer 2 μ L， dNTP (2. 5mmol/L)2y L，MseI-N 引物组(IOmM) 2 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0· 2 μ L，模板DNA 5μ L。PCR反应条件为94°C预变性5min，经94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 Imin共32个循环后，72°C放置lOmin，以完成末端加A步骤。步骤6 微卫星富集文库的构建完成双链卫星片段PCR扩增后，将PCR产物回收纯化，连接到pGEM-T载体中，转化 大肠杆菌DH5 α感受态细胞，铺板于含有Amp的LB固体培养基中，即构建成秆锈菌基因组
微卫星富集文库。实施例3.微卫星序列的鉴定和特异性引物设计实施例2中步骤6的转染细胞，经过蓝白斑筛选，挑取白色克隆到含有Amp的LB 液体培养基中，37°C培养过夜。将ImL菌液提取质粒，EcoR I酶检测确定插入片段的有无 及大小。挑取扩增片段在200-500bp之间的阳性克隆送出测序。测序结果先用SSRHimter 搜索微卫星序列后再用EBI比对去除重复序列获得一批SSR标记。挑选两侧翼区都足够长 的微卫星序列，其中一条SSR标记如kq ID No. 1所示，用I^rimer 5.0软件设计引物，设计 出的引物Pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R，其序列为Pgt-FSl-F 5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘Pgt-FSl-R 5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC—3‘引物对在小麦秆锈病菌中特异性扩增出330bp的产物见图3，其序列如kq ID No. 2所示，测序序列图2。PCR优化引物的反应条件如下
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模板DNA(20ng/ul)1 μ 1Primer (20pmol/μ 1)2μ 12 X PCRMasterMix10 μ 1ddH207 μ 1所述PCR反应的程序如下94"C 3min94°C Imin55°C 45s72°C 45sGoto Step 2 for 30circle72 °C IOmin4 "C forever实施例4 小麦秆锈菌特异性SSR标记的检测应用灵敏度检测梯度稀释纯化后的秆锈菌Q1C3)模板DNA，浓度为O.Olng/μΙ^Ο. lOng/yL、 1. OOng/μ L、5. OOng/μ L、10. OOng/μ L、和 20. OOng/μ L，选用特异性引物 Pgt-FSl-F/ Pgt-FSl-R进行扩增。PCR体系及程序与实施例4相同。PCR反应产物经凝胶电泳，结果如图4所示从1. OOng/μ L-20. OOng/ μ L的模板 DNA中均检测到长度为330bp的DNA片段。特异性检测以小麦重要病原菌叶锈菌(Puccina triticina)PHK、PHT、THT致病类型，条 锈菌(Puccinia striiformis)CY29、CY32、CY33 致病类型，小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa) TCKDU TCKD2, TCKD3 菌株、光腥黑粉菌(T. foetida) TFUTF2.TF3 菌株、网腥 黑粉菌(T. caries) TCTSC菌株、小麦散黑穗病菌(Ustilago tritici) UMl菌株、玉米丝黑穗 病原菌(Sporisorium reilianum) SRl 菌株、小麦赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027 菌株、小麦赤霉菌(Fusarmm asiaticum) 1012、12003菌株、小麦白粉菌(Blumeria graminis)CPff-U E16、ES-l-S、E32、E06菌株为对照，对供试的19个小麦秆锈菌菌株进行 回检，PCR程序及体系同实施例4。结果如图3所示，在所有参检的小麦秆锈菌中均呈现阳 性扩增，显示出该DNA片段对小麦秆锈菌的检测具有高度的专化性；而在3个小麦条锈菌菌 株、3个小麦叶锈菌株、及其它病原真菌中则没有扩增到该片段(图3)。在染病叶片中检测以小麦秆锈菌菌株01C3)室内苗期接种McNair 701，接种菌量为5mg/盆，对照 处理喷滑石粉。接种后6h，12h，24h, 30h, 2d，3d，4d，5d，6d取小麦叶片，以无菌水清洗叶表 面去除未侵染小麦秆锈菌夏孢子后，液氮速冻，储存于-80°C，用于病害显症前小麦秆锈菌 的检测。小麦秆锈菌成功侵染小麦后，一般需要7-14天甚至更长时间才能产生新的传播 体-病菌夏孢子。室内接种后小麦叶片DNA的PCR结果表明，小麦秆锈菌侵入寄主后30h， 即可利用该SSR标记检测到秆锈菌的特异性DNA片段，见图5。因此，在小麦生产实践中，可 以在病害潜育阶段进行PCR检测，根据秆锈菌特异性SSR标记的出现概率进行病害早期预警，以提早开展病害流行测报和及时指导病害防治，这对于降低小麦秆锈病的防治成本、阻 断病害的扩散蔓延、确保我国小麦安全生产具有重要意义。
权利要求
1.一种特异性检测小麦秆锈菌(Puccinia graminis)的PCR方法，其步骤如下(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察；其特征在于所述PCR反应体系中的引物是根据％(1 ID No. 1所示的序列设计的正、反 向引物，所述PCR扩增的阳性产物为kq ID No. 1所示的序列上正向引物完全互补识别的 起始碱基至反向弓I物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的PCR方法，所述正向引物为 Pgt-FSl-F :5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘， 所述反向引物为Pgt-FS 1-R 5 ‘ -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3 ‘，扩增阳性产物为 330bp。
3.根据权利要求1或2所述的PCR方法，所述PCR反应体系如下模板DNA20nmol，正 向引物 40pmol，反向引物 40pmol，2XPCRMasterMix 10 μ 1，力卩 ddH20 至 20 μ 1。
4.根据权利要求1或2所述的PCR方法，所述PCR反应的程序如下94°C3分钟，94°C 1 分钟，55°C 45 秒，72°C 45 秒，30 个循环，72°C 10min，4°C保存。
全文摘要
本发明“一种特异性检测小麦秆锈菌的PCR方法”，属于农业生物技术领域。其步骤如下(1)制备待测DNA模板；(2)预备含有所述待测DNA模板的PCR反应体系；(3)进行PCR反应及结果观察；其特征在于所述PCR反应体系中的引物是根据Seq ID No.1所示的序列设计的正、反向引物，所述PCR扩增的阳性产物为Seq ID No.1所示的序列上正向引物完全互补识别的起始碱基至反向引物完全识别的末端碱基之间的核苷酸片段。本发明的方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。能够为植保工作人员提供可靠的预报参数，以便于及时采取合理的防治措施。
文档编号C12Q1/04GK102146464SQ201110031068
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者刘博 , 刘太国, 王曦, 陈万权, 高利 申请人:中国农业科学院植物保护研究所