专利名称：一种快速检测马铃薯y病毒烟草分离物的方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒学技术领域，尤其是一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法。
背景技术：
马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是马铃薯病毒科(Potyviridae)马铃薯Y 病毒属(Potyvirus)的典型成员。在东亚地区、中南美洲、加拿大、墨西哥、哥斯达黎加及美国均有发生，我国各主要烟区亦普遍发生，该病毒还可侵染茄科、苋科、藜科、菊科和豆科的 120余种植物。其病毒粒子呈弯曲线状，无包膜，长约700nm，直径11 13nm，螺旋对称结构，可在感病寄主体内形成风轮状内含体。标准沉降常数S20w= 1MS，氯化铯中的浮力密度为 1.33g/cm3。烟叶粗汁液的钝化温度为55°C，10min，稀释限点(DEP)为1X10—4，体外存活期 (LIV) 5 10 天。病毒核酸为单分子线形正义ssRNA，长9496nt，基因组结构具有典型马铃薯Y病毒属病毒结构特征，核酸约占病毒粒子重量的5%。病毒外壳蛋白由一种多肽组成，分子质量约 30 47kDa。PVY基因组RNA具有典型的马铃薯Y病毒属病毒基因组结构特征，其5 ‘端为VPg 结构，3'端为Poly(A)尾。基因组编码一个多聚蛋白，切割产生10个蛋白，分别为Pl蛋白(功能未知)、HC-Pro蛋白(与蚜虫传播相关)、P3蛋白(功能未知)、6K1蛋白(功能未知)、CI蛋白(柱状内含体蛋白)、6K2蛋白(功能未知)、NIa-VPg蛋白(即VPg蛋白)、 NIa-Pro蛋白(核内含体蛋白酶)、NIa蛋白(核内含体复制酶)和外壳蛋白。基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的免疫吸附法和基于病毒核酸的LAMP检测是目前应用广泛的检测病毒的方法。但现有方法在检测时间、不灵敏和稳定性等方面存在不足， 且检测特异性不强。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，即结合了上述两种方法的免疫捕获RT-LAMP，免疫捕获RT-LAMP (IC-RT-LAMP)主要由三个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的免疫吸附试验的测定过程，第二部分为第一链cDNA的合成，第三部分即通常的LAMP扩增，为快速、灵敏的检测大量样品，使用了一步法反转录环介导等温扩增，即将后两步合并为一步。整个技术省略了繁琐的RNA提取、第一链cDNA的合成以及LAMP扩增等三个步骤， 利用马铃薯Y病毒烟草分离物抗体的高效价和特异性以及简便、灵敏的LAMP法扩增，特异、 快速的检测样品中的病毒病原，通过肉眼或浊度仪判定病样中是否含有马铃薯Y病毒，为快速检测病毒提供了一种快速、特异和灵敏的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，其步骤包括通过马铃薯Y病毒烟草分离物特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯 Y病毒、高温变性获得病毒RNA作为模板、利用马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3'末端引物及四条特异反应引物进行一步法反转录环介导等温扩增(Reverse-transcriptionLoop-Medi ated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法扩增，肉眼观察或浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度或电泳条带观察，判断样品中是否带有病毒。1.引物设计用于反转录反应的3'端引物5' -CCA AGC TTC ATG TTC TTS ACT CCA AGT ARA-3'用于LAMP反应的四条引物PVY-FIP 5' -CGT CCT TCT CCT TTT CTT TGT TGA ATT TTG AAG GAT GCA AAA CAAGAG C-3'，PVY-BIP 5' -ATC TGG AAC TCA TAC TGT GCC ACT TTT TCA GTA CAG TTG CACCCT-3‘，PVY-F3 5' -AAT CGA TGC AGG AGG AAG-3‘，PVY-B3 5' -AGC ATA CTC GAG TAA ATG TTC T-3'。2.病毒粒子的免疫捕获在PCR管中加入稀释为1 1000的PVY兔多抗血清，4°C下包被过夜，PBST洗涤3 次。烟草病样用PBST研磨，IOOOg离心lmin，取100 μ 1上清加入PCR管中，温育汕；PBST 洗涤3次，H2O洗涤1次，短暂离心，吸去残液。
3.高温变性
加25 μ 1 DEPC处理的超纯水，97°C变性5min，即刻插入冰内X预冷3_5min。
4.一步法 RT-LAMP
在上述PCR管内进行RT-LAMP，反应体系30 μ L
2xBst DNA polymerase Buffer15 μL10 U/ AMV RTase (Initrogen )1 μL40 U RNase Inhibitor1 μL8 υ/μ Bst DNA polymerase1 μL0.1 μΜ3'端引物及LAMP四条引物各1 μ DEPC处理的超纯无菌水7 μLRT-LAMP反应条件50°C温育30min ；60°C温育40min，降至常温。5.肉眼观察或浊度仪检测肉眼观察反应液是否变浑浊，与阴性样品比较有明显浑浊的反应液即为阳性样品，反之则为阴性；浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度，浊度升高的为阳性，浊度与阴性对照没有明显变化的为阴性样品.6.电泳检测RT-LAMP反应结束后取5 μ L反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 X TBE缓冲液中，80V稳压电泳1. 5h，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，有明显条带状电泳痕迹的即为阳性样品，反之则为阴性。序列表
<110>云南省烟草公司昭通市公司，云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南省烟草农业科学研究院<120> 一种快速马铃薯Y病毒烟草分离物的检测方法
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>1
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<213>人工序列
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权利要求
1. 一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，包括以下步骤1)在PCR管内利用马铃薯Y病毒烟草分离物特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯Y病2)高温变性获得病毒RNA作为模板；3)利用上述RNA模板的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3'末端引物及四条特异反应引物进行一步法反转录环介导等温扩增 Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP ；4)肉眼观察或浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度，判断样品中是否带有病毒，或者通过琼脂糖电泳观察电泳条带，判断样品中是否带有病毒。
2.根据权利要求1所述的快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，其特征是进行一步法RT-LAMP的引物为马铃薯Y病毒云南分离物外壳蛋白基因内3'末端引物一条及LAMP 扩增引物四条。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，其特征是用于反转录反应的 3'端引物5' -CCA AGC TTC ATG TTC TTS ACT CCA AGT ARA-3'，用于LAMP反应的四条引物PVY-FIP 5' -CGT CCT TCT CCT TTT CTT TGT TGA ATT TTG MG GAT GCA AM CMGAG C-3'，PVY-BIP 5 ‘ -ATC TGG AAC TCA TAC TGT GCC ACT TTT TCA GTA CAG TTG CACCCT-3‘，PVY-F3 5' -AAT CGA TGC AGG AGG AAG-3‘，PVY-B3 5' -AGC ATA CTC GAG TAA ATG TTC T—3'。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测马铃薯Y病毒烟草分离物的方法，其步骤包括通过马铃薯Y病毒烟草分离物特异性抗体诱捕病株样品中的马铃薯Y病毒、高温变性获得病毒RNA作为模板、利用马铃薯Y病毒外壳蛋白基因3′末端引物及四条特异反应引物进行一步法反转录环介导等温扩增(Reverse-transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification，RT-LAMP)法扩增，肉眼观察或浊度仪在400nm波长下检测沉淀浊度或电泳条带观察，判断样品中是否带有病毒。该方法将快速、特异和高灵敏度的病毒免疫捕捉与快捷的RT-LAMP法结合，从而快速、简便的检测烟草样品中的马铃薯Y病毒。
文档编号C12Q1/70GK102352418SQ20111035085
公开日2012年2月15日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者丁铭, 付修廷, 倪霞, 卯志勇, 张仲凯, 张磊, 游堂贵, 秦西云, 赵声春, 陆文林, 黄韡 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南省烟草公司昭通市公司, 云南省烟草农业科学研究院